張若愚，閆菲，李雪寧，曹雨晴，余遠(yuǎn)，馮靜，薛鵬*

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊 261200）（2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東濰坊 261200） （3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261200）（4.濰坊醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院，山東濰坊 261200）

藜麥?zhǔn)蔷哂休^高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的雙子葉偽谷物植物，具有耐寒、耐旱，易于種植等優(yōu)點(diǎn)，已作為糧食作物在世界范圍廣泛種植[1]，在我國(guó)云南省、山西省、甘肅省、四川省以及新疆省都有廣泛種植，目前藜麥麩皮中已測(cè)得87種皂苷化合物[2]。藜麥皂苷具有抗蟲抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[3]。雖然藜麥皂苷已作為生物農(nóng)藥用于抑制福壽螺的繁殖[4]。市場(chǎng)上也有了含有藜麥皂苷的全谷物產(chǎn)品。一般劑量下的藜麥皂苷的高食用安全性也得到了證實(shí)[5]。然而，過(guò)量的皂苷對(duì)正常細(xì)胞及機(jī)體可能存在毒性效應(yīng)[6]，但其毒作用機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)。更無(wú)關(guān)于藜麥麩皮或藜麥麩皮皂苷使用的相關(guān)指南或推薦攝入量等。因此，近年來(lái)課題組開展了對(duì)藜麥皂苷的毒性研究，前期研究證實(shí)，經(jīng)甲醇提取，正丁醇萃取的藜麥皂苷（含量＞60%）急性毒性試驗(yàn)下LD50大于10 g/kg，且不具致畸致突變毒性[5]，本次研究基于皂苷亞慢性毒性研究的90 d灌胃干預(yù)，評(píng)價(jià)藜麥皂苷的口服安全性。攝入過(guò)高劑量植物皂苷可能會(huì)對(duì)腎臟及消化道造成損傷[7]。尿液可以直觀的反應(yīng)出腎臟的健康情況，通過(guò)采用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物尿液成分的高通量及高分辨率分析[8]。然而尿液中水溶性成分居多，多數(shù)采用親水系統(tǒng)。目前常用的HILIC色譜分析柱與Amide色譜分析柱的分離分析能力各有偏重。因此，本項(xiàng)研究在藜麥皂苷對(duì)SD大鼠進(jìn)行90 d經(jīng)口灌胃處理后，使用親水色譜柱-質(zhì)譜（HILIC-Q Exactive ESI & Amide-Q Exactive ESI）對(duì)尿液進(jìn)行全面分析[9]。同時(shí)，腸道菌群多樣性可反映機(jī)體健康狀況[10]，兩者具有很大的相關(guān)性[11]。綜上深入探究皂苷食用的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮購(gòu)自內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司；無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)別的雄性SD大鼠（6～8周齡），購(gòu)自山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（SCXK（魯）20190003）；甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNA提取試劑盒，德國(guó)默克；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨，色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；4%多聚甲醛，白鯊生物科技有限公司。藜麥皂苷由濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室參考Lin等[5]研究從藜麥麩皮中提?。ê浚?0%）。

1.2 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；QuantStudio 5 ABI PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；NovaSeq 6000系統(tǒng)，因美納科學(xué)器材有限公司；UPLC-Q-Exactive型超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；Micro 21型臺(tái)式離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；IX73光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯；SCIENTZ-48L型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。液相色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC BEH Amide柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理申請(qǐng)（2019SDL097）后根據(jù)良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范原則（GB/T 22278-2008）將大鼠飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的IVC大鼠籠盒內(nèi)。并將48只雌雄大鼠各隨機(jī)分為四組：高劑量（500 mg/kg）皂苷灌胃組、中劑量（50 mg/kg）皂苷灌胃組、低劑量（5 mg/kg）皂苷灌胃組與空白（溶媒）灌胃對(duì)照組，每組6只。連續(xù)90 d經(jīng)口灌胃暴露后，采集大鼠尿液后處死，解剖取腎臟，使用4%的多聚甲醛固定大鼠腎臟，石蠟包埋切塊后HE染色于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2 腸道菌群

大鼠解剖時(shí)，采集大鼠結(jié)腸內(nèi)容物，使用RNA試劑盒提取大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中RNA。對(duì)提取的RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增回收，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep試劑盒制備測(cè)序文庫(kù)，并進(jìn)一步純化文庫(kù)富集所得產(chǎn)物，在對(duì)RNA進(jìn)行高通量測(cè)序后所得的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.3 代謝組學(xué)

1.3.3.1 尿液分析

在大鼠灌胃90 d后，使用代謝籠采集大鼠尿液，使用冷甲醇將大鼠尿液原液去蛋白，渦旋1 min混勻，離心取上清，氮吹干，1 mL甲醇復(fù)溶，稀釋100倍，過(guò)0.45 μm濾膜備用[12]。

1.3.3.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件

UPLC-Q-Exactive液相質(zhì)譜儀進(jìn)行分析配合HILIC柱。根據(jù)Tang等[13]方法：流動(dòng)相A為0.1%甲酸加10 mmol/L的乙酸銨95/5%乙酸/水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸加10 mmol/L的乙酸銨為50/50%乙腈/水。線性UPLC梯度洗脫為：0 min為2%的B；1 min為2%的B；10 min為22%的B；15 min為30%的B；21 min為50%的B；22 min為2%的B；30 min為2%的B。在速率下進(jìn)行分離為0.3 mL/min和進(jìn)樣體積為4 μL。質(zhì)譜方法為：電噴霧離子源（ESI）；離子源電壓為3.2 kV，鞘氣體積流量為40 L/min；離子源溫度為320 ℃；飽和輔助氣體積流量為2 L/min；裂解電壓為300 V；霧化氣為氮?dú)?；?shù)據(jù)采集范圍m/z50～1200，采用Full MS-ddMS模式在正負(fù)離子模式下掃描。

另配合Amide柱。根據(jù)Ke等[14]方法：流動(dòng)相A為100 mmol/L的乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。線性UPLC梯度洗脫為：0 min為99%的B；10 min為99%的B；15 min為40%的B；20 min為99%的B；30 min為1%的B。在速率下進(jìn)行分離為0.3 mL/min和進(jìn)樣體積為4 μL。質(zhì)譜方法同上述質(zhì)譜方法。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用Compounds Discover 3.1.1對(duì)液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)導(dǎo)出的raw文件分析處理，進(jìn)行峰對(duì)齊，峰過(guò)濾，峰提取和自動(dòng)積分。最終創(chuàng)建了一個(gè)包含相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間（Rt）、峰面積、等信息的多維峰表。并采用mzCloud，Chemspide（包含BioCyc、Bovine Metabolome Database、Bovine Rumen Metabolome Database、CSF Metabolome database、Fecal Metabolome database、Golm Metabolome Database、Human Metabolome Database、KEGG、Saliva Metabolome Database、Serum Metabolome Database、Urine Metabolome Database、Yeast Metabolome Database等數(shù)據(jù)庫(kù)），進(jìn)行定性并獲取相應(yīng)峰面積，后使用SIMCA-P 14.1對(duì)腸道菌群及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），檢驗(yàn)R2、Q2值，得Folding Change值及P值后由Graph-pad 8.0制得差異代謝物火山圖。取差異代謝物（絕對(duì)值＞1，p＜0.05），使用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行代謝通路富集分析[15]。

初步篩查腸道菌群分析中的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)；重測(cè)、補(bǔ)測(cè)問(wèn)題樣本。通過(guò)質(zhì)量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進(jìn)行文庫(kù)和樣本預(yù)分析，并去除barcode序列。使用Vsearch 2.9.1軟件分析序列去噪或OTU聚類。對(duì)各樣本（組）在不同物種分類學(xué)水平的具體組成進(jìn)行展示，了解整體概況。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠生命狀態(tài)及解剖后觀察

大鼠在飼養(yǎng)期間無(wú)明顯不良狀況，灌飼結(jié)束后由HE染色切片觀察大鼠腎臟（圖1）。雌性高劑量藜麥皂苷灌胃組腎小球部分空泡變性，腎小球肥大，部分腎小管中細(xì)胞核數(shù)目增加，細(xì)胞核排列紊亂，與慢性腎損傷大鼠的病理表征一致[16]。在雄性大鼠及雌性中低劑量組大鼠與空白對(duì)照組大鼠無(wú)顯著差異。

2.2 代謝組學(xué)研究

對(duì)藜麥皂苷90 d灌胃大鼠的尿液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用儀分析后，使用Compound Discover 3.1.1對(duì)源文件處理得Fold Change值、VIP值、p值等，并做出火山圖，PCA分析，OPLS-DA分析等，重點(diǎn)對(duì)差異明顯的高劑量組大鼠與空白對(duì)照組大鼠進(jìn)行分析。

2.2.1 差異代謝物主成分分析

對(duì)代謝物進(jìn)行PCA分析，雌性大鼠R2=0.7，雄性大鼠R2=0.6，均大于0.5，擬合優(yōu)度較好，具有較高的解釋力。質(zhì)量控制（Quality Control，QC）樣本重合度均較好，證實(shí)實(shí)驗(yàn)采用的方法具有較高重復(fù)度且機(jī)器具有較高穩(wěn)定性，結(jié)果可信度高。在PCA圖（圖2）中可見(jiàn)雌性大鼠組間差異較為明顯，高中低劑量組與空白對(duì)照組均能較好區(qū)分；雖然雄性大鼠中劑量組與中劑量組區(qū)分不明顯，但雄性大鼠高劑量組與空白對(duì)照組仍有明顯差異，對(duì)照組散點(diǎn)分布于橫軸之下，高劑量組分布于橫軸之上。OPLS-DA模型下組間差異更為明顯，表明皂苷灌胃對(duì)大鼠尿液代謝物影響明顯（圖3）。

2.2.2 差異代謝物數(shù)量分析

高劑量藜麥皂苷灌胃對(duì)雌雄大鼠均可產(chǎn)生顯著影響，而在中低劑量下影響相對(duì)較小。通過(guò)火山圖（圖4）可見(jiàn)經(jīng)500 mg/kg藜麥皂苷灌胃后，雌性大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)可鑒別的代謝物596種，其中差異代謝物（|log2(Fold Change)|＞1，VIP＞1，p＜0.05）101種，上調(diào)38種，下調(diào)63種（由于數(shù)目過(guò)多，表1僅展示log2(FC)大于4，且VIP大于1的部分），雌性中劑量組與對(duì)照組相比之下僅有76中差異化合物，雌性低劑量組與對(duì)照組相比之下僅有53中差異化合物；雄性大鼠尿液中共發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)別的代謝物358種，其中差異代謝物29種，上調(diào)7種，下調(diào)22種（表1、表2僅展示可命名的化合物）雄性中劑量組與對(duì)照組相比之下僅有15中差異化合物，雄性低劑量組與對(duì)照組相比之下僅有2中差異化合物，且在雌雄中低劑量組與對(duì)照組差異代謝物均被高劑量組與對(duì)照組差異代謝物所包含。包括在雌性大鼠代謝物中發(fā)現(xiàn)的L-組氨酸（L-Histidine）、L-絲氨酸（L-Serine）、吡哆醇（pyridoxine）、甲酰-5-羥基犬尿胺（Formyl-5- hydroxykynurenamine）、黃尿酸（Xanthurenic acid），犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）等化合物的變化均提示了皂苷對(duì)腎臟的影響，而Helene等[17]的研究亦證實(shí)了 未水解的皂苷可能對(duì)腎臟具有一定毒性。

表1 雌性大鼠代謝物差異 Table 1 Metabolite differences in female rats

表2 雄性大鼠代謝物差異 Table 2 Metabolite differences in male rats

2.2.3 差異代謝物代謝物通路富集分析

將差異代謝物帶入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行通路富集分析，各代謝通路中，維生素B6代謝、色氨酸代謝、氨循環(huán)、丙氨酸代謝的改變明顯（圖5）。其中，維生素B6代謝與眾多輔酶的合成息息相關(guān)，藜麥皂苷通過(guò)提高吡哆醇（pyridoxine）水平，調(diào)節(jié)維生素B6代謝，參與輔酶合成，進(jìn)而影響各種氨基酸的代謝（圖6）。其中色氨酸又是腸胃微生物的重要代謝產(chǎn)物[18]。藜麥皂苷通過(guò)促進(jìn)色氨酸代謝下調(diào)了甲酰-5-羥基犬尿胺（Formyl-5-hydroxykynurenamine）、黃尿酸（Xanthurenic acid）水平，上調(diào)了犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）水平。而腸道中色氨酸代謝作為腸道相關(guān)疾病的重要相關(guān)因素與特定乳酸桿菌等益生菌關(guān)系密切，色氨酸代謝減弱可能與拮抗皂苷抗?fàn)I養(yǎng)作用，改善大鼠腸道損傷，增強(qiáng)大鼠的自身免疫水平有關(guān)[19-21]，亦可以此為依據(jù)將皂苷作為免疫佐劑激發(fā)皂苷干預(yù)后大鼠的免疫能力[22]。同時(shí)，維生素B6代謝還與固醇類激素具有相關(guān)性，維生素B6水平上調(diào)可增加機(jī)體對(duì)固醇類激素及維生素D的敏感性，而維生素D可促進(jìn)鈣吸收預(yù)防骨質(zhì)疏松，這極有可能是皂苷治療骨質(zhì)疏松以及發(fā)揮部分激素作用的重要機(jī)制[23]。不僅如此，隨著維生素B6的增加，同型半胱氨酸降解減緩可危害大鼠心血管健康[24]，L-絲氨酸（L-Serine）上調(diào)也可與同型半胱氨酸降解減緩的結(jié)論相互佐證。

值得注意的是L-組氨酸（L-Histidine）水平下降與甲基組氨酸代謝增強(qiáng)相關(guān)較大，而甲基組氨酸代謝的加快則表示及肌源纖維蛋白分解加快，說(shuō)明攝入藜麥皂苷可致肌肉代謝加強(qiáng)[25]。然而在藜麥皂苷高劑量灌胃組中的代謝產(chǎn)物中未見(jiàn)肌酐等急性腎損傷生物標(biāo)志物水平的變化，這說(shuō)明攝入藜麥皂苷未造成腎臟功能性改變[26]。但是通路富集分析卻發(fā)現(xiàn)高劑量的藜麥皂苷經(jīng)口灌胃造成了氨循環(huán)變化，藜麥皂苷通過(guò)下調(diào)L-組氨酸（L-Histidine）、上調(diào)L-絲氨酸（L-Serine）改變了氨循環(huán)。這一改變提示長(zhǎng)期高劑量攝入藜麥皂苷會(huì)造成大鼠腎臟代償性損傷[27]。HE染色切片也證實(shí)，高劑量藜麥皂苷對(duì)雌性大鼠腎臟產(chǎn)生損傷，這一影響在低中劑量范圍下不明顯，而日常所接觸的藜麥皂苷均在中劑量范圍以下[28]，因此推測(cè)藜麥皂苷在環(huán)境與食品中的適量添加不會(huì)對(duì)腎臟產(chǎn)生不良影響。

2.3 腸道菌群

腸道菌群作為一種機(jī)體健康不可忽視的重要因素，與腸道疾病、腎臟損傷、心血管疾病息息相關(guān)[29]。由Alpha多樣性的Observed Species指數(shù)（圖7a）可見(jiàn)，僅有雌性對(duì)照組與高中劑量之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表示雌性高中劑量組大鼠體內(nèi)腸道菌群豐度大于雌性空白對(duì)照組，這一現(xiàn)象在雄性大鼠及雌性低劑量組中未發(fā)現(xiàn)。Simpson指數(shù)（圖7b）中則未發(fā)現(xiàn)顯著差異。而本研究中，由于腸道菌群自身變異大，故使用OPLS-DA對(duì)腸道菌群種屬進(jìn)行分析。雌雄大鼠，對(duì)照組與藜麥皂苷灌胃各組均存在差異（圖8）。其中，雌性大鼠R2X為0.756，R2Y為0.602；雄大鼠R2X為0.956，R2Y為0.607，均大于0.5，模型擬合優(yōu)度較好。高劑量藜麥皂苷經(jīng)口灌胃組與空白組相比，腸道菌群種類分布具有顯著性差異。將代謝組學(xué)與腸道菌群多樣性交叉分析顯示，在各個(gè)差異代謝物相關(guān)的代謝通路中，色氨酸代謝與大鼠腸道菌群變化息息相關(guān)，而其他常見(jiàn)的腸道菌群相關(guān)代謝物未發(fā)現(xiàn)明顯改變。結(jié)合目前研究，影響腸道菌群分布的主要代謝物為色氨酸、短鏈脂肪酸及膽汁酸等[30]。藜麥皂苷通過(guò)下調(diào)大鼠體內(nèi)的色氨酸代謝，影響其腸道菌群分布，但其具體機(jī)制尚不清楚。而藜麥皂苷對(duì)大鼠腸道菌群的改變也反饋式地影響了機(jī)體本身代謝，在長(zhǎng)期藜麥皂苷灌飼過(guò)程中，代謝產(chǎn)物與腸道菌群相互作用，改變了腸道微環(huán)境。 為雌性對(duì)照組；MH為雄性高劑量組；MM為雄性中劑量組；ML為雄性低劑量組；MC為雄性對(duì)照組；圖8同。

3 結(jié)論

綜上，通過(guò)代謝組學(xué)及腸道菌群結(jié)合分析證實(shí)，高劑量藜麥皂苷使大鼠尿液中L-脯氨酸、甜菜堿、犬尿喹啉酸等能量代謝物質(zhì)及氨基酸類物質(zhì)水平發(fā)生改變，并影響了維生素B6代謝、氨循環(huán)、色氨酸代謝等通路，從而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，影響大鼠腸道菌群分布，改變其腸道微環(huán)境。低中劑量下藜麥皂苷對(duì)大鼠并未造成明顯傷害，雖在高劑量下可能會(huì)對(duì)腎臟造成損傷，但通常飲食與生活中所接觸的藜麥皂苷含量難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定的高劑量。本研究為藜麥皂苷對(duì)腎臟的作用提供了理論依據(jù)，但對(duì)整體及其他臟器的毒性研究仍有待探究。