候雨雪，劉學銘，程鏡蓉*，朱明軍

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610） （3.喀什大學生命與地理科學學院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室，新疆喀什 844000）

隨著人們生活水平的提高，人們對肉制品的需求不再簡單地停留在營養(yǎng)物質(zhì)的攝取上，而是更加注重肉制品產(chǎn)品的風味和健康。廣式臘腸是一種傳統(tǒng)的風味肉制品，風味物質(zhì)的組成和含量對其質(zhì)量有很大的影響[1]；廣式臘腸風味主要來源于原輔料自身的風味，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的降解與氧化[2]以及微生物分泌的胞外酶引起的生化反應(yīng)等[3]。研究表明，適度的水解與氧化有助于產(chǎn)品特征風味物質(zhì)的形成，但是過度氧化會導致某些不愉快氣味甚至有害物質(zhì)的合成，對臘腸風味產(chǎn)生不利影響[4]。為了控制肉制品的氧化，臘腸的制作過程中常常會加入硝酸鹽等抗氧化劑[5]。然而，由于存在潛在的遺傳毒性和致癌風險，傳統(tǒng)的抗氧化劑（如亞硝酸鈉）逐漸被人們所摒棄，人們開始嘗試從植物成分中尋找天然氧化調(diào)控策略來提高產(chǎn)品的品質(zhì)與安全[6]。植物多酚是一種植物的次級代謝產(chǎn)物[7]，具有良好的抗菌、抗氧化等生物活性[8]，近年來備受人們關(guān)注。Nowak等[5]將櫻桃中和黑醋栗中提取的酚類物質(zhì)分別加入到豬肉香腸中，發(fā)現(xiàn)二者均可有效延長香腸中的保質(zhì)期。Qin等[9]將蔥種子中提取的多酚加入到哈爾濱香腸中，發(fā)現(xiàn)干香腸的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化得到了抑制，香腸的色澤穩(wěn)定性得到了提高。然而植物多酚對肉制品的氧化抑制作用究竟如何影響產(chǎn)品的風味還鮮有研究。

桑椹是一種天然漿果類植物，富含多酚類物質(zhì)，掛果期短，易腐爛[10]，目前主要以水果、果汁、果酒或果醬的形式流通于市面，附加值較低。從桑椹中提取的多酚不僅儲存時間長，且附加值較高。風味是決定消費者選擇取向的主要決定因素[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，將桑椹中提取的酚類物質(zhì)加入到廣式臘腸中，可以有效緩解臘腸的氧化，同時賦予產(chǎn)品一定的抗氧化活性[12]。然而，桑椹多酚的加入是否會對臘腸的風味造成影響，造成怎樣的影響，目前還不得而知。鑒于此，本研究嘗試將桑椹多酚加入到臘腸中，試圖通過分析臘腸揮發(fā)性風味物質(zhì)、游離脂肪酸和游離氨基酸等的變化來解析桑椹多酚在臘腸風味品質(zhì)調(diào)控中的作用，以期為植物多酚在新型肉制品開發(fā)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中桑椹多酚源于桑椹（大10品種），由課題組分離提純得到，具體方法參照向榮的研究[13]，總酚含量為：320.31 mg GAE/g。豬里脊肉、板油、白砂糖、食用鹽等臘腸制作的原輔料均購自廣州華潤萬家超市，甲醇、異丙醇、正己烷、NaOH、Na2SO4等氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀使用的試劑均為色譜純或優(yōu)級純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司，內(nèi)標物十七酸購于美國Sigma oldrich公司，C7～C40正構(gòu)烷烴購于壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心。其他試劑均為分析純，購自廣州齊云生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T25D均質(zhì)機，德國IKA集團；TGL-16M冷凍高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；氨丙基硅膠固相萃取柱，德國Simon公司；50/30 μm DVB/CAR PMDS固相微萃取探頭，美國sigmaaldrich公司；6980N-5975B氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；斬拌機，廣東東菱電器有限公司；絞肉機，廣州旭眾食品機械有限公司；熱泵干燥機，廣東微而信實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 廣式臘腸的制作

廣式臘腸的制作參考Xiang等[12]的方法，稍加改動。廣式臘腸配方如下：瘦肉（800 g）、肥肉（200 g）、食鹽（30 g）和白酒（20 g）。其中，空白組不加入任何抗氧化劑，陽性對照組加入0.1 g/kg亞硝酸鈉，實驗組分別加入0.5 g/kg桑椹多酚和1.0 g/kg桑椹多酚。將瘦肉與調(diào)料混合，在攪拌機中攪拌10 min后，加入肥肉，繼續(xù)攪拌10 min后灌腸，用草繩將臘腸分成每段10～15 cm的小節(jié)，將氣泡扎破，排除其中的空氣。臘腸先在20 ℃熱泵烘烤2 h（濕度50%），然后50 ℃烘烤36 h（前30 h濕度為40%，后6 h濕度為30%）。分別在臘腸成熟后（第0 d）及儲藏10 d后取樣，儲存于-80 ℃。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

將臘腸粉碎并混勻，準確稱取臘腸2 g置于20 mL萃取瓶中，用固相微萃取探頭插入樣品上方，80 ℃萃取60 min。隨后收回探頭，迅速將探頭插入GC-MS進樣口，在進樣口270 ℃下解析5 min。

色譜條件：DB-5MS色譜柱；進樣口溫度：270 ℃，不分流；載氣為氦氣，流速1 mL/min；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持5 min，然后以4 /min℃ 的速率升溫至130 ℃，保持3 min，再以8 /min℃ 的速率至200 ℃，保持3 min，最后以12 /min℃ 的速率升溫至250 ℃，保持5 min，運行總時間52.67 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍：30～450 u。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)的定性和定量分析

定性分析：未知揮發(fā)性化合物與檢索譜庫匹配，并使用C7～C40正構(gòu)烷烴混合標樣進行GC-MS分析，記錄保留時間，計算各化合物的卡瓦茨保留指數(shù)（RI），并與參考文獻作對比，從而確定化合物的種類。RI的計算公式：

式中：

tn和tn+1——分別為碳原子數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴的出峰時間，min；

tx——被分析的風味化合物的出峰時間，min。

定量分析：使用峰面積（AU×106/g）對揮發(fā)性風味物質(zhì)進行定量分析。

1.3.4 游離脂肪酸的測量

1.3.4.1 脂肪的提取

將廣式臘腸中肥丁與瘦肉部分分離后分別絞碎，用于脂肪的提取。稱取一定量樣品（肥丁5 g或瘦肉10 g），用濾紙（中速定性濾紙，直徑18 cm）包好，放入到纖維素濾紙筒中，后者置于索氏抽提杯中，加入120 mL石油醚（沸程為30～60 ℃）和沸石后，于索氏抽提儀中進行脂質(zhì)提取。待脂肪抽提完畢后，將抽提杯放入通風櫥中，待石油醚揮發(fā)完畢后，剩余的液體即為脂肪。

1.3.4.2 游離脂肪酸的分離

游離脂肪酸的分離參考孫為正[3]的方法，稱取脂質(zhì)100 mg，用氯仿溶解，然后經(jīng)氨丙基硅膠固相萃取柱（Simon）吸附，用3 mL氯仿異丙醇（2:1，V/V）洗脫中性脂肪，然后加入2%乙酸-乙醚溶液洗脫游離脂肪酸，將洗脫下來的游離脂肪酸用N2吹干。

1.3.4.3 脂肪酸甲酯化

向分離出的游離脂肪酸中加入十七酸內(nèi)標物，加入2 mL 2% NaOH-CH3OH溶液（m/V），60 ℃水浴30 min（每10 min震蕩一次）；隨后加入2 mL 14% BF3-CH3OH溶液，60 ℃水浴2 min后取出，用流動水降至室溫。加入2 mL正己烷（色譜級）和5 mL飽和NaCl溶液，顛倒均勻后，離心（10000 r/min，5 min）分層。吸取2 mL上清液至裝有1 g無水Na2SO4的離心管中，搖勻，離心（10000 r/min，3 min），用1 mL一次性注射器吸取上清液，經(jīng)過有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至上樣瓶中，空白對照組1 mL正己烷（色譜級）。

1.3.4.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：DB-HeavyWax色譜柱；進樣口溫度：260 ℃，分流比20:1；載氣為氦氣，流速1 mL/min；程序升溫：起始溫度45 ℃，保持1 min，然后以12 /min℃ 的速率升溫至140 ℃，保持0 min，再以3 /min℃ 的速率至230 ℃，保持11 min，運行總時間49.92 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍：10～450 u。

1.3.5 游離氨基酸含量的測量

稱取4 g樣品，加入20 mL 5% 5-磺基水楊酸（m/V），均質(zhì)兩次（7000 r/min，40 s），離心（4 ℃，10000 r/min，15 min），取4 mL上清液與4 mL石油醚混合，旋渦震蕩40 s，除去有機上層，用一次性注射器吸取液體，過0.22 μm水相濾膜，使用全自動氨基酸分析儀測量游離氨基酸含量。

1.3.6 感官評價

感官評價參考Xu等[10]的方法，總共有11名感官評價人員。滿分為7分。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，通過SPSS對數(shù)據(jù)進行分析，通過Origin作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑椹多酚對廣式臘腸中揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響

通過將GC-MS識別的風味物質(zhì)與檢索譜庫對比，計算卡瓦茨保留指數(shù)，并與保留指數(shù)作對比，在8組臘腸中總共鑒定出58種揮發(fā)性風味物質(zhì)（詳見表1），主要包括18種醛、3種酮、6種醇、6種酸、17種酯、6種烷烴、1種醚和1種呋喃。這些化合物主要源于碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的水解與氧化、微生物代謝以及香料中的風味物質(zhì)[14]。

在0 d，桑椹多酚組的風味物質(zhì)含量（尤其是醛類物質(zhì)）明顯小于對照組和亞硝組。蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化是風味物質(zhì)形成的重要途徑。酸和醛類物質(zhì)，如辛酸、己酸、壬酸、己醛和壬醛，主要來自脂質(zhì)自氧化，在香腸的特殊風味形成中發(fā)揮著重要作用[15]。其中，己醛含量是肉制品脂質(zhì)氧化的重要指標，它可以準確地反映揮發(fā)性風味成分中脂肪的氧化狀態(tài)[16]，從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，在儲藏末期（10 d），添加1 g/kg桑椹多酚的樣品未檢測到己醛，而空白對照組檢測到的己醛含量達40.89 AU×106/g臘腸，這說明桑椹多酚對臘腸脂質(zhì)氧化的抑制作用是減少揮發(fā)性風味物質(zhì)的積累的重要成因。Munekata等[16]將啤酒渣提取物、板栗葉提取物、花生皮提取物等天然抗氧化劑添加到豬肉香腸中，發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑顯著降低了己醛的含量（p＜0.001）。值得注意的是，亞硝酸鹽也被認為可以抑制肉制品的氧化[17]，然而本研究中添加亞硝酸鈉的樣品風味物質(zhì)含量顯著高于多酚組。這一方面可能源于二者對產(chǎn)品氧化程度的抑制效應(yīng)存在差異[12]；另一方面，微生物內(nèi)源酶引起的生化反應(yīng)也是風味物質(zhì)形成的重要途徑[18]，桑椹多酚具有廣譜抑菌性[13]，可能會抑制微生物某些內(nèi)源酶的分泌，造成產(chǎn)品整體風味物質(zhì)的形成和積累受到限制。這也可以從臘腸中醛類物質(zhì)的變化得以證實。醛類物質(zhì)的積累主要源于微生物的代謝作用；肉制品中微生物可以將蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸，后者在微生物氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下被轉(zhuǎn)化成α-酮酸，α-酮酸作為中間體，可進一步轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的醛[14]。在0 d，空白組（未添加抗氧化劑）和亞硝酸鈉組的臘腸中的醛類物質(zhì)的含量明顯的少于10 d的臘腸，而桑椹多酚組的臘腸中醛類物質(zhì)含量在儲藏期變化不明顯。

在儲藏期間，十四烷酸、十六碳烯酸含量顯著上升，這些物質(zhì)同樣源于脂質(zhì)氧化[14]。然而，較儲藏初期相比，儲藏末期（第10 d）酸類物質(zhì)的種類減少，這可能是因為酸類物質(zhì)在儲藏期中參與了酯類物質(zhì)的形成。與該推測結(jié)果相一致，在儲藏過程中，臘腸樣品酯類物質(zhì)的含量顯著提高。酯類物質(zhì)是臘腸香味的重要來源[19]，經(jīng)過10 d的儲藏期后，大部分酯類物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升的趨勢，可能是因為臘腸的儲藏過程中，脂肪氧化產(chǎn)生的羧酸類物質(zhì)與臘腸制作過程中加入的乙醇發(fā)生了酯化反應(yīng)，生成了脂類物質(zhì)。盡管如此，整個儲藏期間，桑椹多酚組的酸類物質(zhì)含量明顯少于空白對照組，這進一步說明桑椹多酚對臘腸脂質(zhì)氧化的抑制作用限制了揮發(fā)性風味物質(zhì)中酸類物質(zhì)的積累。

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2.2 桑椹多酚對廣式臘腸中游離脂肪酸含量的影響

圖2a和圖2b分別表示的是臘腸瘦肉和肥丁部分總游離脂肪酸的含量。從圖中的數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)過了10 d的儲藏期后，臘腸的游離脂肪酸含量顯著提高。具體來說，在儲藏初期（0 d），樣品總游離脂肪酸含量在4.61～5.58 mg/g脂肪，經(jīng)過10 d的儲藏后，總游離脂肪酸含量增加至6.18～8.78 mg/g脂肪，該結(jié)果與孫為正[3]的研究結(jié)果相似。肌肉內(nèi)源酶系統(tǒng)在游離脂肪酸的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用[20]，游離脂肪酸的增加主要源于脂質(zhì)水解酶的作用。其他發(fā)酵肉制品（如西班牙馬肉火腿肉[21]、干熏鵝肉[22]等）中也有過類似報道，在Lorenzo[21]的研究中，在西班牙馬肉火腿肉的總游離脂肪酸含量由原始材料的433.7 mg/100 g脂肪在發(fā)酵成熟后期增加到2655.5 mg/100 g脂肪。肌肉部分和肥丁部分的MUFA（單不飽和脂肪酸）和PUFA（多不飽和脂肪酸）經(jīng)過10 d的儲藏期后，均顯著提高，這與總游離脂肪酸的變化是相似的，這表明經(jīng)過10 d的儲藏期，不飽和脂肪酸的生成速度大于降解速度。

圖2 廣式臘腸中瘦肉部分(a)和肥丁部分(b)總游離脂肪酸含量（mg/g脂肪） Fig.2 The total free fatty acid (TFFA) contents of muscle tissue (a) and fat tissue (b) in Cantonese sausages (mg/g fat)

游離脂肪酸在肉制品風味形成中具有重要的作用。肉制品中脂質(zhì)降解后形成游離脂肪酸，后者在氧化條件下進一步形成風味物質(zhì)[23]。棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸是臘腸中主要的游離脂肪酸?；ㄉ南┧嶂辉诩∪獠糠謾z測出，肥丁部分未檢測出花生四烯酸，這兩者之間的差異可能是由于磷脂酶活力的不同造成的[3,24]。

在0 d，空白對照組樣品的總游離脂肪酸含量與亞硝組和桑椹多酚組并無顯著差異（p＞0.05）。然而，在儲藏末期（10 d），未添加抗氧化劑組的總游離脂肪酸含量在各組中最高。游離脂肪酸是脂肪水解和氧化的關(guān)鍵產(chǎn)物，其含量主要取決于其自身的形成和分解速率[25]。亞硝酸鈉和桑椹多酚可能通過抑制脂質(zhì)水解和氧化，從而減緩了游離脂肪酸的積累。盡管添加亞硝酸鈉和桑椹多酚的臘腸游離脂肪酸含量上存在顯著差異，但是二者在游離脂肪酸種類上未表現(xiàn)出明顯差別，這表明桑椹多酚的添加主要影響脂質(zhì)的水解和氧化的速度，但不會造成游離脂肪酸種類上的差異。

2.3 桑椹多酚對廣式臘腸中游離氨基酸的影響

臘腸儲藏期游離氨基酸含量的變化結(jié)果如表3所示。肉制品中游離氨基酸的含量主要取決于pH、鹽濃度、微生物的組成和加工條件（時間、溫度和水活度），而這些參數(shù)主要是通過影響氨肽酶活力來控制蛋白質(zhì)的水解和游離氨基酸的釋放[26]。

由表3中的數(shù)據(jù)可以看出，添加桑椹多酚的臘腸中，大多數(shù)游離氨基酸的含量顯著高于空白對照組（p＜0.05），這說明桑椹多酚的加入可能會促進蛋白質(zhì)的水解。與此相似，Cheng等[27]研究中也指出桑椹多酚會與肉蛋白相互作用，促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在各組中，除肌肽等個別氨基酸外，儲藏末期（10 d）的臘腸中大多數(shù)游離氨基酸含量顯著高于儲藏初期（0 d）。Santos等[28]的研究結(jié)果也表明，隨著儲藏時間的延長，干發(fā)酵香腸中的游離氨基酸含量呈上升趨勢。在10 d的儲藏期后，添加了桑椹多酚的臘腸必需氨基酸、非必需氨基酸與空白對照組相比，均顯著提高，尤其是1.0 g/kg桑椹多酚組。這再次表明桑椹多酚促進了臘腸中游離氨基酸的釋放。除了蛋白質(zhì)的氧化降解，肉制品中蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶作用下的水解是形成游離氨基酸的重要途徑[18]。在內(nèi)源酶（如鈣蛋白酶和組織蛋白酶）的作用下，蛋白質(zhì)被初步分解，產(chǎn)生中等大小的肽，然后這些肽進一步被細菌肽酶水解成游離氨基酸[18]。從該角度上說，桑椹多酚可能是通過影響內(nèi)源酶、細菌肽酶的代謝從而影響臘腸中蛋白質(zhì)的降解，促進了游離氨基酸的釋放。同時，蛋白質(zhì)氧化會造成氨基酸側(cè)鏈的改變，也會造成氨基酸含量的下降，多酚可能是因為通過抑制蛋白質(zhì)氧化，進而降低氨基酸側(cè)鏈的修飾，從而提高了臘腸中游離氨基酸的含量[28]。

從儲藏末期氨基酸的組成來看，Ala、Arg、Ans、Glu、Lys是臘腸中主要的氨基酸。其中，Ala、Glu和Arg是肉制品中主要的呈味氨基酸。Arg會影響干腌肉制品的風味[28]，Ala可以帶來甜味[18]，Glu可以帶來鮮美的味道。在儲藏初期（0 d），添加桑椹多酚組臘腸的Glu和Arg含量顯著低于空白對照組；然而，隨著儲藏期的延長，桑椹多酚組的Glu和Arg逐漸積累，在儲藏末期顯著高于空白對照組。這表明，在臘腸的儲藏過程中，桑椹多酚促進了Glu和Arg這兩種呈味氨基酸的釋放。這可能是因為前期加工過程中桑椹多酚與肉蛋白的結(jié)合提高了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)的降解與水解受到了抑制；然而，隨著儲藏期的延長，桑椹多酚逐漸被釋放和降解，造成蛋白質(zhì)更多活性位點的暴露，因此蛋白質(zhì)的水解作用得到增強[29]。

2.4 感官評價

對廣式臘腸的感官評價如表3所示，由于亞硝酸鈉具有護色和發(fā)色的功能，使臘腸呈現(xiàn)亮紅色，沒有添加亞硝酸鈉的空白組臘腸顏色暗紅，而添加了桑椹多酚的臘腸呈暗紫色，與傳統(tǒng)的臘腸顏色差別較大。但是，添加1.0 g/kg桑椹多酚組的氣味得分要顯著地高于空白對照組，感官評價小組成員普遍反映添加了桑椹多酚之后的臘腸的肉腥味比空白組和亞硝酸鈉組低，這可能是因為桑椹多酚的本身的氣味可以掩蓋肉的腥味，Xu等[10]的研究也得出了相似的結(jié)果。相關(guān)研究指出，己醛是兔肉中腥味的主要來源[30]，表1和圖1的結(jié)果表明桑椹多酚可以顯著降低臘腸中己醛的含量，這可能是添加桑椹多酚組臘腸腥味得到改善的重要原因。桑椹多酚總體的可接受度雖然低于亞硝酸鈉組，但是顯著高于空白對照組?？傮w來說，桑椹多酚的添加雖然會對廣式臘腸的色澤產(chǎn)生不利的影響，但是會對臘腸的感官特性產(chǎn)生一定的有利影響。

圖1 廣式臘腸中揮發(fā)性風味物質(zhì)的豐度 Fig.1 The abundance of volatile flavor compounds of Cantonese sausages

表3 廣式臘腸的感官評價 Table 3 The sensory analysis of Cantonese sausages

3 結(jié)論

本文首次探究了桑椹多酚對廣式臘腸風味的影響。研究發(fā)現(xiàn)，桑椹多酚可能會通過抑制脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化和水解來改變臘腸風味物質(zhì)的組成和含量。桑椹多酚的添加雖然未能使廣式臘腸呈現(xiàn)原有的晶瑩剔透的外觀，抑制某些揮發(fā)性風味物質(zhì)的產(chǎn)生，但是可以通過抑制己醛等腥味物質(zhì)的產(chǎn)生從而弱化臘腸中的肉腥味。具體而言，添加桑椹多酚后臘腸中游離脂肪酸的合成和積累受到了限制，但呈味氨基酸（如Glu和Arg）的釋放得到了顯著提高。在儲藏末期（10 d）添加了0.5 g/kg桑椹多酚的臘腸的Glu、Arg含量分別達到了101.11、55.83 mg/100 g臘腸。該研究結(jié)果有助于豐富人們關(guān)于植物多酚對肉制品品質(zhì)的影響的認識，指導食品工作者合理地將植物多酚作為一類天然肉制品氧化調(diào)節(jié)劑用于食品加工。