王雪，李乾，劉彩紅，古麗丹·塔勒達吾，劉鳳蘭，龍陽，王靜*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

（2.新疆林科院經(jīng)濟林研究所，新疆烏魯木齊 830063）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬植物，主要分布在寧夏、新疆、內(nèi)蒙古等地。目前，新疆已成為我國枸杞重點主產(chǎn)區(qū)[1]。枸杞具有降血糖、抗衰老、增強免疫力和保護細(xì)胞等作用，是藥食兩用的進補佳品[2,3]。當(dāng)前干制枸杞在市場上占主要地位，但是近幾年隨著大眾對不同口味的需求，加之精河枸杞鮮果色澤飽滿、甘甜味美、營養(yǎng)豐富越來越受消費者青睞。然而精河縣“寧杞七號”枸杞鮮果屬于呼吸躍變型漿果[4]，在貯藏、運輸及銷售過程中，易出現(xiàn)褐變反應(yīng)和軟化的現(xiàn)象導(dǎo)致果實營養(yǎng)成分降低，甚至完全喪失商品價值，造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。果蔬貯藏過程中的褐變反應(yīng)主要是酶促褐變的底物和酶的接觸反應(yīng)[6]。研究報道，正常細(xì)胞中酚類物質(zhì)與酚氧化酶成區(qū)域化分布。但是當(dāng)植物細(xì)胞受到破壞，酚類物質(zhì)則作為底物與酶接觸，發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，逐漸變成黑褐色聚合物，引起果蔬褐變[7]。另有研究報道，活性氧代謝失調(diào)、自由基積累，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂過氧化，增加有關(guān)酶類與酚類底物的接觸，從而加速果實褐變[8-10]。有研究表明，冰溫貯藏結(jié)合塑料盒包裝可以抑制“寧杞1號”枸杞鮮果呼吸速率，提高貯藏品質(zhì)[11]；馬麗敏[12]發(fā)現(xiàn)采用酸性氧化電位水清洗、真空預(yù)冷并結(jié)合氣調(diào)包裝的方式可有效保持枸杞鮮果較高的商品價值，延長貨架期；趙建華等[13]采用不同貯藏溫度對“寧杞3號”枸杞鮮果進行研究，發(fā)現(xiàn)4±1 ℃貯藏通過維持枸杞活性氧代謝平衡達到延緩果實褐變的目的。但是采用NO對枸杞采后熏蒸延長其保鮮期的研究尚不多見。

有研究報道，外源NO熏蒸可以提高果蔬的抗氧化能力，延緩果蔬褐變[14]。降低采后龍眼果皮[15]、竹筍[16]、鮮切桃片[17]和鮮切板栗仁[18]的褐變度，提高貯藏品質(zhì)。另有研究表明，徐福樂等[19]采用外源NO熏蒸番茄，通過降低H2O2含量和O2-·生成速率，提高SOD和CAT等相關(guān)活性氧代謝酶活力來減輕膜脂過氧化，延緩褐變進程；張政等[20]選用木納格葡萄為試驗材料，使用外源NO間歇熏蒸，提高貯藏過程中SOD、APX、CAT及POD活力，抑制H2O2和O2-·生成，維持活性氧代謝平衡，延緩果實衰老褐變；劉立芹[21]使用外源NO熏蒸鴨梨，減緩鴨梨果心褐變發(fā)生。但以枸杞鮮果為試材，采用外源NO氣體熏蒸抑制枸杞鮮果褐變尚不多見。

李乾等[22]采用0、200、300 μL/L和400 μL/L的NO氣體對“寧杞七號”熏蒸處理，發(fā)現(xiàn)300 μL/L的NO熏蒸處理對冷藏枸杞鮮果貯藏品質(zhì)的保持效果較佳。因此本試驗選用產(chǎn)自新疆博樂市的“寧杞七號”枸杞鮮果為試材，采用300 μL/L的外源NO氣體熏蒸枸杞，探究經(jīng)NO熏蒸后枸杞鮮果褐變和活性氧代謝的變化，以期為外源NO熏蒸在枸杞鮮果保鮮方面的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“寧杞七號”枸杞鮮果產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)博樂市精河縣托里鄉(xiāng)，于2019年7月3日進行人工采摘，采摘時保留果柄和萼片。在當(dāng)?shù)?±0.5 ℃冷庫中預(yù)冷24 h后運送至新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)3±0.5 ℃冷庫，挑選出無腐爛、發(fā)霉和遭受機械損傷的果實。將樣品均分為2組，分別用0、300 μL/L NO氣體（濃度為99.99%）熏蒸枸杞3 h，熏蒸后的鮮果裝入帶孔黃色塑料框中，每框枸杞約2 kg，體積不超過框體三分之一，置于3±0.5 ℃低溫冷庫貯藏，每6 d取一次樣，共取樣7次。

聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通X-100、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、丙酮、濃硫酸、四氯化鈦、鹽酸、濃氨水、L-蛋氨酸、氮藍四唑、核黃素、三氯乙酸、二硫代苯甲酸、抗壞血酸、氧化性谷胱甘肽、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉，均為分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Solarbio（貨號BC1108）試劑盒，Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTT-A+200電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；752 N紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；D3024R冷凍離心機，上海珂淮儀器有限公司；JEA系列電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；玻璃儀器氣流烘干器，河南省予華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 褐變度

枸杞鮮果褐變度測定參考周宏勝等[23]的方法略作改動。將20 g果肉打漿，從中稱取1 g加預(yù)冷蒸餾水5 mL，低溫研磨勻漿，以4000 r/min，4 ℃離心15 min，在波長410 nm處測定上清液的吸光度值A(chǔ)，褐變度結(jié)果以10×A表示。以上步驟重復(fù)三次。

以下所有指標(biāo)測定均先取20 g果肉打漿，其余步驟按照相應(yīng)參考文獻進行測定。

1.3.2 過氧化氫含量和超氧陰離子生成速率

采用曹建康[24]的方法測定貯藏過程中過氧化氫（H2O2）含量的變化。

式中：

n——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的溶液中過氧化氫物質(zhì)的量，μmol；

V——樣品提取液總體積，mL；

Vs——吸取樣品液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

采用曹建康[24]的方法測定枸杞貯藏過程中超氧陰離子生成速率。

式中：

n——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的溶液中超氧陰離子的物質(zhì)的量，μmol；

V——樣品提取液總體積，mL；

Vs——吸取樣品液體積，mL；

t——樣品與羥胺反應(yīng)的時間，min；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 還原型和氧化型谷胱甘肽含量測定

還原型谷胱甘肽含量（GSH）采用曹建康[24]的方法進行測定，結(jié)果用μmoL/g FW表示。

式中：

n——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的溶液中還原型GSH物質(zhì)的量，μmol；

V——樣品提取液總體積，mL；

Vs——吸取樣品液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

氧化型谷胱甘肽含量（GSSG）嚴(yán)格按照Solarbio（貨號BC1108）試劑盒說明書步驟測定，單位μg/g。

式中：

Y——樣本濃度，μg/mL；

W——樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 還原型和氧化型抗壞血酸含量的測定

還原型（ASA）和氧化型抗壞血酸（DHA）含量均采用分光光度計法[24]測定。

式中：

V——樣品提取液總體積，mL；

m’——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的抗壞血酸的質(zhì)量，μg；

Vs——滴定時所用樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力測定

采用愈創(chuàng)木酚法[24]測定過氧化物酶（POD）活力，單位U=ΔOD470·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD470——每分鐘反應(yīng)混合物吸光度變化值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Δt——反應(yīng)時間，min；

Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

采用曹建康[24]的方法測定枸杞過氧化氫酶（CAT）活力。

式中：

ΔOD240——每分鐘反應(yīng)混合物吸光度變化值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Δt——反應(yīng)時間，min；

Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

采用曹建康[24]的方法測定枸杞超氧化物歧化酶（SOD）活力，內(nèi)容稍作改動。

SOD活力測定時把日光燈下反應(yīng)時間延長至40 min，其余步驟與曹建康測定方法相同。

式中：

ODC——照光對照管反應(yīng)混合液的吸光度值；

ODS——樣品管反應(yīng)混合液的吸光度值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；

t——光照反應(yīng)時間，min；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活力測定

采用曹建康[24]的方法測定枸杞鮮果貯藏過程中抗壞血酸過氧化物酶（APX）活力的變化。單位U=0.01ΔOD290·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD290——每分鐘反應(yīng)混合物吸光度變化值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Δt——反應(yīng)時間，min；

Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

采用曹建康[24]的方法測定枸杞鮮果在貯藏過程中谷胱甘肽還原酶（GR）活力的變化。單位U=0.01ΔOD340·g-1·min-1FW。

式中：

ΔOD340——每分鐘反應(yīng)混合物吸光度變化值；

V——樣品提取液總體積，mL；

Δt——反應(yīng)時間，min；

Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上試驗均設(shè)定3個重復(fù)，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19處理并進行相關(guān)性分析，由Origin 2018制圖。

2 結(jié)果分析

2.1 NO熏蒸對果實褐變癥狀和褐變度的影響

褐變度是反映枸杞鮮果外觀和品質(zhì)最直觀的指標(biāo)。由圖1可知，在整個貯藏過程中，對照組和NO處理組的枸杞鮮果褐變度均隨貯藏時間的延長呈上升趨勢。和對照組相比較，處理組枸杞褐變度變化較為平穩(wěn)。枸杞的褐變主要表現(xiàn)為果面亮度降低、色澤飽滿度下降、由鮮紅逐漸轉(zhuǎn)變成暗紅色，導(dǎo)致褐變度增加[6]，在貯藏末期（30～36 d）對照組枸杞褐變度顯著高于處理組（p＜0.01），貯藏至第36 d，對照組褐變度比處理組高27.66%。經(jīng)方差分析結(jié)果表明，貯藏6 d時，對照組和處理組枸杞褐變度開始出現(xiàn)差異，且貯藏6 d后褐變速率加大，處理組褐變度始終顯著低于對照組（p＜0.05），對照組褐變速度增加較快，這與宋康華等[25]對鮮切粉葛褐變度研究結(jié)果相似。說明NO熏蒸可以顯著抑制枸杞鮮果貯藏期間褐變度的上升，且在貯藏后期降低枸杞鮮果褐變度的作用更顯著。

圖1 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果褐變度的影響 Fig.1 Effects of NO fumigation on the browning degree of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

2.2 NO熏蒸對果實H2O2含量和O2-生成速率的影響

H2O2是評價采后果蔬活性氧代謝的重要指標(biāo)，H2O2含量越高，表明活性氧代謝越旺盛[26]。由圖2a可以看出，自貯藏開始至結(jié)束，兩組枸杞H2O2含量均呈現(xiàn)下降趨勢，且處理組H2O2含量始終低于對照組。貯藏第6 d和第24 d時處理組與對照組枸杞鮮果中H2O2含量差異顯著（p＜0.05）。謝晶等[26]發(fā)現(xiàn)硝普納處理（硝普納可以產(chǎn)生NO）對荔枝中H2O2含量有抑制作用，從而更好地保持荔枝的品質(zhì)，延長其貯藏期。本試驗研究表明NO熏蒸處理可以抑制冷藏枸杞鮮果貯藏過程中H2O2含量，減少活性氧的積累。

圖2 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果H2O2含量（a）和O2-生成速率（b）的影響 Fig.2 Effect of NO fumigation on H2O2 content (a) and O2- production rate (b) of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

超氧陰離子是一種活性氧自由基，加速組織膜脂過氧化，促進果蔬衰老褐變。由圖2b可以看出，貯藏0～30 d內(nèi)兩組枸杞鮮果O2-生成速率大致呈上升趨勢，說明褐變加劇與活性氧的積累密切相關(guān)。除貯藏第24 d和30 d外，處理組枸杞O2-生成速率顯著低于對照組（p＜0.05）；貯藏30～36 d，對照組和NO處理組枸杞O2-生成速率出現(xiàn)快速下降的趨勢，這可能是SOD歧化反應(yīng)消耗更多的O2-，故而減少了枸杞果實內(nèi)O2-積累；兩組果實O2-產(chǎn)生速率整體上呈“下降-上升-再下降”的趨勢，O2-作為SOD的底物，在處理組中O2-產(chǎn)生速率始終低于對照組，這可能與NO能提升枸杞鮮果SOD活力有關(guān)，與謝晶等[26]對采后荔枝O2-產(chǎn)生速率研究結(jié)果相似。由此表明，NO熏蒸可以顯著抑制枸杞鮮果貯藏期間O2-生成速率上升且在貯藏前期效果顯著（p＜0.05）。

2.3 NO熏蒸對果實GSH、GSSG含量及其比值的影響

GSH可直接清除活性氧自由基或通過ASA-GSH循環(huán)達到間接清除自由基的目的[27]。由圖3a可看出整個貯藏過程中兩組枸杞中GSH含量整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并且NO處理組枸杞GSH含量始終高于對照組，至貯藏結(jié)束處理組枸杞中GSH含量比對照組高32.65%（p＜0.05）。說明NO可以直接參與自由基清除的過程，NO熏蒸處理能延緩GSH的氧化消耗，維持ASA-GSH循環(huán)的穩(wěn)定性與還原能力，維持枸杞鮮果的抗氧化能力。

貯藏前24 d兩組枸杞鮮果中GSSG含量均呈現(xiàn)下降趨勢（除對照組的第18 d外）；在整個貯藏過程中對照組枸杞中GSSG含量均高于處理組。貯藏第36 d，對照組枸杞GSSG含量比處理組高18.97%（圖3b）。

圖3 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果GSH（a）、GSSG（b）和GSH/GSSG（c）的影響 Fig.3 Effect of NO fumigation on GSH (a), GSSG content (b) and GSH/GSSG ratio (c) of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

GSH/GSSG可以反映枸杞鮮果氧化還原情況。如圖3c所示，GSH/GSSG 變化趨勢與GSH含量趨勢相仿，呈現(xiàn)“升-降-升-降”的趨勢，且整個貯藏期間處理組枸杞GSH/GSSG比值始終大于對照組，貯藏前期（6～18 d）效果顯著（p＜0.05）。由此表明NO處理可以提高GSH含量，維持較低水平GSSG含量從而提高GSH/GSSG比值，以此達到保護細(xì)胞膜，延緩褐變的目的。

2.4 NO熏蒸對果實ASA、DHA含量及其比值的影響

ASA和GSH是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑，保障ASA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的正常運作，加速H2O2分解，消除H2O2對細(xì)胞造成的傷害[28]。如圖4a所示，隨著貯藏時間的延長，兩組枸杞ASA含量總體呈現(xiàn)上升趨勢且處理組ASA含量始終高于對照組。除貯藏第6 d外，NO處理組枸杞中ASA含量均顯著高于對照組（p＜0.05）。表明外源NO熏蒸可以提高枸杞ASA含量，加快H2O2分解速度，防止過量活性氧自由基對果實產(chǎn)生毒害。這與王靜[29]對哈密瓜ASA含量研究結(jié)果一致。由此表明，NO處理有助于提高枸杞貯藏期間ASA含量。

APX以ASA為電子供體，可直接清除H2O2，同時ASA被氧化形成DHA，氧化過程中產(chǎn)生的酶可協(xié)同作用將DHA再生成ASA[30]，加速H2O2分解。如圖4b所示，兩組枸杞DHA含量均呈現(xiàn)“升-降-升-降”動態(tài)變化，其中處理組浮動程度較大。在整個貯藏過程中，除第18 d外處理組枸杞中DHA含量均顯著高于對照組（p＜0.05）。

貯藏0～12 d，處理組ASA/DHA比值先快速下降出現(xiàn)最低值后快速上升。第18 d時處理組枸杞ASA/DHA達到峰值，比對照組高11.77%。由此表明，NO處理提高枸杞貯藏期間ASA含量，保持較高的ASA/DHA（圖4c）。

2.5 NO熏蒸對果實POD、CAT和SOD活力的影響

SOD、POD、CAT和APX是清除活性氧自由基重要的酶類[31]，可以協(xié)助CAT清除H2O2[30]。由圖5a可知，處理組和對照組鮮果中POD活性在貯藏0～6 d快速下降，且貯藏第6 d時，處理組枸杞POD活力顯著高于對照組（p＜0.05）；貯藏6～36 d，兩組枸杞POD活力整體呈上升趨勢，處理組POD活力始終高于對照，在貯藏24～30 d，效果顯著（p＜0.05）。由此表明，NO熏蒸提高了冷藏枸杞鮮果POD活力，有助于H2O2的清除。

圖5 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果POD（a）、CAT（b）和SOD（c）活力的影響 Fig.5 Effect of NO fumigation on POD (a), CAT (b) and SOD (c) activity of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

CAT是清除活性氧自由基的主要酶類，可以將H2O2分解為H2O，使組織細(xì)胞中H2O2始終維持較低水平[32]。由圖5b可知，處理組枸杞的CAT活性變化與對照組相似，整個貯藏期間均處于下降趨勢，且處理組枸杞一直均保持較高的CAT活力。在貯藏第30 d，CAT活力出現(xiàn)小幅度的上升，但隨后繼續(xù)下降。方差分析結(jié)果表明，NO熏蒸可有效抑制枸杞鮮果貯藏期間CAT活力下降，在貯藏前期效果更為顯著（p＜0.05）。由此可見，NO處理可抑制CAT活性下降，促進H2O2分解（圖2a），防止H2O2積累對細(xì)胞產(chǎn)生的破壞[33]，較好維持相對穩(wěn)定的細(xì)胞形態(tài)，有效抑制枸杞褐變發(fā)生，與外源NO熏蒸芥蘭結(jié)果類似[34]。

SOD可以催化O2-歧化生成H2O2和O2，為植物細(xì)胞清除活性氧自由基[32]。由圖5c可以看出，兩組枸杞鮮果中SOD活性大致呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但整個貯藏過程中，處理組枸杞SOD活力始終高于對照組，且貯藏中期（12～24 d）效果顯著（p＜0.05），表明NO有助于提高SOD活力，從而加快O2-降解（圖2b），延緩鮮果貯藏前期褐變進程；結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)貯藏第12 d NO處理組枸杞褐變度比對照組低18.41%，可能是因為NO熏蒸誘導(dǎo)SOD基因表達上升，從而加快清除活性氧自由基的速度[35]，保持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而降低褐變度。該現(xiàn)象與NO熏蒸獼猴桃的結(jié)論相似[36]。由此可見，NO熏蒸可有效維持枸杞貯藏過程中SOD活力，加快活性氧自由基清除速率，保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而延緩果實褐變。

2.6 NO熏蒸對果實APX和GR活力的影響

為盡可能減少甚至消除活性氧自由基的傷害，植物體內(nèi)存有ASA-GSH循環(huán)。APX是一種輔助抗氧化酶[37]，通過氧化ASA來清除植物體內(nèi)H2O2[38]。APX存在于葉綠體基質(zhì)中，與CAT協(xié)同清除H2O2減輕膜脂過氧化的傷害[39]。由圖6a可以看出，對照組與處理組枸杞鮮果在貯藏期間APX活性呈現(xiàn)動態(tài)變化。貯藏0～6 d，對照組枸杞中APX高于處理組；但貯藏18～36 d，處理組枸杞APX活力始終高于對照組，與CAT、POD協(xié)同作用，加速H2O2分解，在圖3a中得到驗證。由此說明，NO熏蒸在貯藏中后期（18～36 d）可以有效提高枸杞鮮果貯藏期間APX活性。

GR是GSH和ASA重要的再生酶[38]。由圖6b可以看出，貯藏0～6 d，處理組枸杞GR活力低于對照組；貯藏18～36 d，兩組枸杞鮮果中GR活力出現(xiàn)不穩(wěn)定的波動，但NO處理組枸杞GR活力始終高于對照組（p＜0.05），加快貯藏后期GSSG還原進程（圖3b），維持充足的GSH含量（圖3a）。ASA和GSH是重要的抗氧化物質(zhì)，其中GSH可通過自身氧化從而還原ASA達到清除H2O2的目的[38-40]。說明18～36 d，GR在催化GSSG還原成GSH方面起到一定作用。本試驗研究表明，貯藏后期（24～36 d）處理組枸杞鮮果中GR活力顯著高于對照組（p＜0.01）。由此說明，NO熏蒸可以顯著提高枸杞鮮果在貯藏后期的GR活力。

圖6 NO熏蒸對冷藏枸杞鮮果APX（a）和GR（b）活力的影響 Fig.6 Effect of NO fumigation on APX (a) and GR (b) activity of fresh Lycium barbarum fruits during cold storage

3 結(jié)論

在3±0.5 ℃的貯藏條件下，NO熏蒸處理可有效抑制冷藏枸杞鮮果的活性氧代謝和褐變衰老，從而維持果實良好的品質(zhì)。綜上所述，外源NO熏蒸通過提高冷藏枸杞鮮果POD、貯藏0～24 d SOD酶活力以及貯藏12～36 d APX和GR酶活力，抑制CAT酶及貯藏24～36 d SOD酶活力下降，提高ASA和GSH抗氧化物質(zhì)含量，加快枸杞中活性氧自由基的分解；同時抑制O2-生成速率、H2O2含量的積累和GSSG還原速度，維持自由基代謝平衡，保持細(xì)胞完整結(jié)構(gòu)從而減緩枸杞鮮果褐變進程。本研究為外源NO熏蒸在枸杞鮮果保鮮方面的應(yīng)用提供理論參考。