宋鶯麗，李安章，徐帥帥，馬立安，朱紅惠*

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東廣州 510070）（2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州 434025）

膽固醇與人體的健康息息相關(guān)，是人體細(xì)胞重要的組成部分，同時也是誘發(fā)心血管疾病的危險因素之一。人體膽固醇濃度過高會誘發(fā)高脂血癥，進(jìn)而造成膽固醇動脈壁結(jié)塊、動脈粥樣硬化、冠心病、腦梗、中風(fēng)等嚴(yán)重的心血管疾病[1]。調(diào)查表明，美國每年由心血管疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)3154億美元[2]。據(jù)統(tǒng)計，預(yù)計至2030年，全球范圍內(nèi)死于心血管疾病的人數(shù)將達(dá)到約3000萬左右[3]。雖然近年來治療高脂血癥及其相關(guān)的心血管疾病的藥物不斷涌現(xiàn)，但是這些藥物普遍價格昂貴且伴有嚴(yán)重的副作用，長期療效并不顯著[4,5]。

益生菌是一類能定植于宿主體內(nèi)且有利于宿主健康的活性微生物的總稱[6]。乳酸菌因能產(chǎn)生抑制有害微生物的物質(zhì)且有利于宿主腸道健康而作為常見的益生菌，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品以及醫(yī)藥行業(yè)中[7]。早在2001年，世界衛(wèi)生組織就提出了益生菌可有效治療高脂血癥[8]，它不僅可以降低機(jī)體的血脂水平，還能調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，從而降低心腦血管疾病發(fā)病的風(fēng)險[9-11]。以上研究表明，篩選出具有降膽固醇功能的菌株是近幾年的研究熱點。黃燕燕等[12]、李雅迪等[13]利用體外篩選試驗證實益生菌具有體外降膽固醇的作用；Fei等[14]、El-Gawad等[15]、Zhu等[16]利用動物模型證明了益生菌具有體內(nèi)降膽固醇的作用；Jones等[17-19]、Liong等[20,21]利用一系列體外和體內(nèi)試驗證明了益生菌可降低機(jī)體中膽固醇的含量。益生菌降膽固醇的作用機(jī)制主要有兩個觀點：一個是Frand等[22]最先提出的共沉淀理論，即膽鹽水解酶能將結(jié)合型膽鹽水解成游離型膽鹽，游離型膽鹽可與膽固醇共沉淀排出體外，從而達(dá)到降低膽固醇的目的；另一個是Gilliland等[23]提出的同化吸收理論，即膽固醇能被乳酸同化并吸附在細(xì)胞膜表面，從而降低體內(nèi)膽固醇的含量。

本研究從健康鱸魚腸道中篩選既能產(chǎn)膽鹽水解酶又能降膽固醇的乳酸菌，并對其進(jìn)行菌株鑒定，通過耐酸、耐膽鹽及抑菌性等指標(biāo)評估菌株的益生作用，為后續(xù)體內(nèi)試驗及輔助降脂益生菌制劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

篩選目標(biāo)菌株的樣品取自本實驗室養(yǎng)殖的健康鱸魚腸道內(nèi)容物，植物乳桿菌（GDMCC 1.140）、大腸桿菌（GDMCC 1.180）、金黃色葡萄球菌（GDMCC 1.1220）、沙門氏菌（GDMCC 1.237）由廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物有限公司；

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂；

BSH篩選培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加瓊脂2%，牛膽鹽0.3%，巰基乙酸鈉0.2%，氯化鈣0.037%；

MRS-CHOL培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加3%膽鹽和1%膽固醇。

1.1.3 試劑與儀器

牛膽鹽、革蘭氏染液，廣東環(huán)凱微生物有限公司；巰基乙酸鈉、膽固醇，上海麥克林生化科技有限公司；二硫蘇糖醇、茚三酮，北京索萊寶科技有限公司；?；撬?、?；悄懰徕c、鄰苯二甲醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒，廣州美基生物科技有限公司；氯化鈣、氯仿、二甲苯，廣州化學(xué)試劑廠。

HVE-50高壓蒸汽滅菌器，日本Hirayama公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AEP厭氧工作箱，英國Electrotek公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；3-18KS臺式冷凍離心機(jī)、GSX1梯度PCR儀，德國Sigma公司；Multiskan Go酶標(biāo)儀，上海巴玖實業(yè)有限公司；VCX-130超聲波細(xì)胞破碎儀，美國Sonics公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ST3100 pH計，奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化

取1 g新鮮的樣品放入9 mL滅菌生理鹽水中，混合搖勻后將所得到的樣品懸濁液按10倍梯度稀釋，選取合適的3個稀釋梯度，吸取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。觀察涂布平板的菌落形態(tài)特征，選擇生長有50～150個單菌落的平板，根據(jù)菌落的形態(tài)特征選擇不同形態(tài)的單菌落，在MRS平板上多次劃線純化，直至獲得菌落形態(tài)特征一致的純培養(yǎng)單菌。將分離純化出來的菌株用25%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油于-80 ℃冷凍保存。

1.2.2 產(chǎn)膽鹽水解酶（BSH）菌株的定性篩選與酶活力測定

1.2.2.1 產(chǎn)BSH菌株的定性篩選

參考滕躍等[24]、瑪麗娜·庫爾曼等[25]定性篩選產(chǎn)BSH菌株的方法，將含有目標(biāo)菌株的BSH篩選培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h，若觀察到濾紙片周圍產(chǎn)生白色沉淀，則說明該菌株產(chǎn)生BSH。同時，以不產(chǎn)生BSH菌株作為陰性對照，以菌株GDMCC 1.140作為陽性對照。

1.2.2.2 產(chǎn)BSH菌株的酶活力測定

將菌株按3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后離心10 min（8000 r/min，4 ℃）收集菌體，將收集的菌體用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌2次，在600 nm下調(diào)整菌體濃度為1.0后備用。參考Tanaka等[26]、李昵等[27]的方法測定菌株BSH酶活力，菌株GDMCC 1.140作為陽性對照，以?；撬釢舛龋é蘭ol/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A570nm）為縱坐標(biāo)，制得牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.2286x-0.0041，R2=0.9923。

BSH（總）酶活定義為：單位時間、單位體積的粗酶使結(jié)合膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的物質(zhì)的量，單位：μmol/(h·mL)

1.2.3 體外降膽固醇能力測定

1.2.3.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考賀珊珊等[28]的方法，以膽固醇的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值（A500nm）為縱坐標(biāo)，制得膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=24.393x-0.0125，R2=0.9944。

1.2.3.2 樣品的制備與測定

將上述產(chǎn)BSH的菌株活化后，用未接菌的MRS肉湯培養(yǎng)基在600 nm下調(diào)整菌體濃度為1.0，調(diào)整后的菌懸液按照3%的接種量接種到MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL發(fā)酵液，8000 r/min離心10 min取上清液，以菌株GDMCC 1.140作為陽性對照，采用鄰苯二甲醛法[29,30]測定上清液中膽固醇含量，按照公式（1）計算膽固醇去除率。

式中：

B——接種菌株前培養(yǎng)基中膽固醇濃度；

A——菌株發(fā)酵后培養(yǎng)基中膽固醇濃度。

1.2.4 菌株鑒定

將挑選出的膽鹽水解酶活性且體外降膽固醇能力較好的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA鑒定。

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將活化好的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及簡單染色，鏡檢觀察菌株的形態(tài)并拍照做記錄。

1.2.4.2 16S rDNA鑒定

用DNA試劑盒提取基因組，釆用通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：DNA模版1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：94 ℃、3 min；變性：94 ℃、30 s；退火：55 ℃、30 s；延伸：72 ℃、1 min；30個循環(huán)；4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴(kuò)增合格的樣品送天一輝遠(yuǎn)公司或金唯智公司測序。測序得到的16S rDNA序列使用DNAMAN 8軟件進(jìn)行拼接后，與NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對初步確定其屬種，再利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定篩選得到的菌株與參比菌株之間的進(jìn)化關(guān)系[31]。

1.2.5 菌株耐酸性測定

分別調(diào)整MRS肉湯培養(yǎng)基的pH為3.0和6.0（其中pH 6.0的培養(yǎng)基作為對照組），將菌種按3%的接種量分別接種于上述兩種培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)0、2、4、6、8 h取樣，用酶標(biāo)儀測定菌株的OD600值，按照公式（2）計算菌株的耐酸存活率[32]。

1.2.6 菌株膽鹽耐受性測定

以不加膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基為對照組，加入0.3%膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基為試驗組，將菌株按3%的接種量分別接種于上述兩種培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)0、2、4、6、8 h取樣，用酶標(biāo)儀測定菌株的OD600值，按照公式（3）計算菌株的耐膽鹽存活率[33]。

1.2.7 菌株疏水性的測定

參考Kotzamanidis等[34]的方法測定菌株的疏水性，在波長600 nm處測量其吸光度A，按照公式（4）計算菌株的疏水率。

式中：

A0——與氯仿（或二甲苯）混合前菌液在波長600 nm處測量的吸光值；

A——與氯仿（或二甲苯）混合后菌液在波長600 nm處測量的吸光值。

1.2.8 菌株自凝聚力測定

參考溫賀等[35]的方法測定菌株的自凝聚力，將菌液在試管中靜置1、24、48 h后，取1 mL上清液測定光密度值，按照公式（5）計算菌株的自凝聚力：

式中：

A0——時間為0 h時測得的光密度值；

At——時間分別為1、24、48 h時測得的光密度值。

1.2.9 代謝物抑菌性評價

參考何江波等[36]的方法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為指示菌，用牛津杯法測定目標(biāo)菌株的抑菌能力，將含有目標(biāo)菌株的培養(yǎng)皿37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和Origin 2017對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖表繪制，用SPASS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)p＜0.05時，差異是有意義的，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)膽鹽水解酶（BSH）菌株的定性篩選與酶活力測定

膽鹽水解酶（BSH）能水解結(jié)合膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸，游離膽汁酸能與膽固醇結(jié)合形成復(fù)合體排出體外，從而降低血液中膽固醇的含量。因此，膽鹽水解酶可以作為降膽固醇菌株篩選的一個重要指標(biāo)[37]。從鱸魚腸道中共分離純化出30株細(xì)菌，用BSH篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果在體視顯微鏡（SZX2-ILLT）下拍照觀察，由圖1可知，以不產(chǎn)BSH的菌株ZGLLu02和ZR2YLu03為陰性對照，以已報道的產(chǎn)BSH的菌株植物乳桿菌（GDMCC 1.140）為陽性對照，篩選出9株產(chǎn)BSH的菌株，菌株編號分別為DM2YLu01、DM2YLu05、DMYLu01、DMYLu03、DMYLu07、SYLu7-2、YLu-1、ZG2YLu05、ZGYLu02。由圖2可知，在9株產(chǎn)BSH的菌株中，ZG2YLu05的BSH活性最高，其粗酶活為0.82 μmol/(h·mL)，顯著高于陽性對照菌株GDMCC 1.140的粗酶活。

圖1 菌株膽鹽水解酶的定性篩選 Fig.1 Qualitative screening of bile salt hydrolase from strains

圖2 不同菌株膽鹽水解酶的定量測定 Fig.2 Quantitative determination of bile hydrolase from different strains

2.2 體外降膽固醇能力測定

如圖3所示，采用鄰苯二甲醛法測定上述產(chǎn)BSH菌株的體外降膽固醇能力。其中膽固醇去除率小于20%有3株菌，膽固醇去除率在20%～30%有5株菌，膽固醇去除率高于40%以上有1株菌，其中菌株ZG2YLu05的膽固醇去除率最高為50.09%，顯著高于陽性對照菌株GDMCC 1.140和其他菌株。關(guān)于降膽固醇乳酸菌的研究中，目前研究已發(fā)現(xiàn)多種不同的菌株，包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等多種菌株[24]。如萬婧倞等[30]從喙鯨內(nèi)臟中篩選出一株膽固醇去除率48.82%的植物乳桿菌，黃燕燕等[12]從開菲爾粒和陳年泡菜水中篩選出一株膽固醇去除率37.58%的植物乳桿菌。由此可見，在關(guān)于降膽固醇乳酸菌的現(xiàn)有研究中，菌株ZG2YLu05的膽固醇去除率處于較高水平，具有一定的研究價值，因此選取該菌株進(jìn)行下一步試驗。

圖3 不同菌株體外膽固醇去除率 Fig.3 In vitro cholesterol removal rate of different strains

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株ZG2YLu05在MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如圖4a、4b所示，菌株ZG2YLu05的菌落直徑約0.5～2 mm，菌落濕潤，為白色圓形，隆起，邊緣光滑。挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色并在油鏡100×10倍數(shù)下觀察菌體形態(tài)，結(jié)果如圖4c所示，菌株細(xì)胞為短桿狀，單個、成對或成串聚集，無芽孢，無鞭毛，為革蘭氏陽性菌。

圖4 菌株ZG2YLu05的形態(tài)學(xué)觀察 Fig.4 Morphological observation of strain ZG2YLu05

2.3.2 16S rDNA鑒定

用試劑盒提取菌株ZG2YLu05的基因組后，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長度在1500 bp左右，擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果在NCBI上做同源序列比對，用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示ZG2YLu05與戊糖乳桿菌的親緣關(guān)系最近。因此，鑒定ZG2YLu05為戊糖乳桿菌。

圖5 菌株ZG2YLu05的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZG2YLu05

2.4 菌株耐酸性測定

通常人體進(jìn)食后胃部pH在3.0～5.0之間[38]，且食物一般在胃中只停留2～4 h[39]。如圖6所示，菌株ZG2YLu05在pH 3.0的條件下，經(jīng)過8 h的培養(yǎng)，其存活率仍高達(dá)83.33%，說明菌株ZG2YLu05對低pH的酸性環(huán)境有很好的耐受性，由此判定此菌株可以適應(yīng)人體腸道酸性環(huán)境并發(fā)揮作用。

圖6 菌株ZG2YLu05的耐酸性測定 Fig.6 Determination of acid resistance of strain ZG2YLu05

2.5 菌株膽鹽耐受性測定

有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)哪扄}濃度會促進(jìn)乳酸菌對膽固醇的吸收[40]，而人體腸道膽鹽濃度一般在0.03%～0.3%之間[41]，因此測定菌株膽鹽耐受性是衡量菌株能否在腸道發(fā)揮作用的一個重要指標(biāo)。如圖7所示，菌株ZG2YLu05在膽鹽濃度0.3%的條件下，經(jīng)過8 h的培養(yǎng)，其存活率仍高達(dá)89.31%，說明菌株ZG2YLu05對膽鹽有很好的耐受性，可以進(jìn)入人體腸道并在其中發(fā)揮作用。

圖7 菌株ZG2YLu05的膽鹽耐受性測定 Fig.7 Bile salt tolerance determination of strain ZG2YLu05

2.6 菌株疏水性的測定

疏水性和自凝聚力與菌株對腸上皮細(xì)胞的黏附能力有關(guān)[42]，有研究表明疏水性高的乳酸菌對腸上皮細(xì)胞具有強(qiáng)的黏附性[43]。分別以氯仿和二甲苯為吸附劑研究菌株的疏水性，由表1可知，菌株ZG2YLu05在二甲苯中的疏水性比在氯仿中的疏水性高，達(dá)46.82%，超過了陳明等[44]篩選的菌株疏水性（31.92%），說明菌株ZG2YLu05具有較好的疏水性，有一定的黏附能力。

表1 菌株ZG2YLu05的疏水性測定 Table 1 Hydrophobicity determination of strain ZG2YLu05

2.7 菌株自凝聚力測定

菌株的自凝聚力由疏水性決定，同時與上皮細(xì)胞的黏附能力有關(guān)[45]。由表2可知，菌株ZG2YLu05的自凝聚力隨著時間的延長而提高，在靜置24 h后，ZG2YLu05的菌懸液上層明顯呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，自凝聚力高達(dá)92.93%，高于瑪麗娜·庫爾曼等[25]研究的副干酪乳桿菌S-8的自凝聚力（88.42%），說明菌株ZG2YLu05具有良好的自凝聚力，在腸道中可以穩(wěn)定定植。

表2 菌株ZG2YLu05的自凝聚力測定 Table 2 Determination of self-cohesion of strain ZG2YLu05

2.8 代謝物抑菌性評價

大量研究成果表明，乳酸菌會產(chǎn)生乳酸、乙酸、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物抑制腸道病原菌[46]。本研究以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為指示菌，用牛津杯法評估菌株ZG2YLu05的抑菌能力。如表3所示，菌株ZG2YLu05對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑分別為17.85、12.67和16.16 mm，其中對大腸桿菌的抑制能力最好，其次是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，說明菌株ZG2YLu05產(chǎn)生的代謝物質(zhì)具有一定的抑菌活性，對腸道健康具有一定的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

3.1 血清中過高的膽固醇是引起動脈壁結(jié)塊、動脈粥樣硬化、腦梗、中風(fēng)等心腦血管疾病的主要原因，而乳酸菌作為常見的降膽固醇益生菌，是目前研究的熱點菌群。大量研究者用體外和體內(nèi)試驗已證實一些乳酸菌具有降膽固醇的作用。在進(jìn)行降膽固醇乳酸菌的篩選試驗中，菌株除了需要具備產(chǎn)BSH和體外降膽固醇的能力外，還應(yīng)適應(yīng)人體腸道的特殊環(huán)境，需要對其耐酸、耐膽鹽、疏水性、自凝聚力和代謝物抑菌性進(jìn)行測定，以便得到性狀優(yōu)良的潛在益生菌。

3.2 基于以上試驗背景，本研究從健康鱸魚腸道中分離純化得到一株降膽固醇能力較好的菌株ZG2YLu05，其膽鹽水解酶（BSH）粗酶活和膽固醇去除率分別為0.82 μmol/(h·mL)和50.09%，在現(xiàn)有的降膽固醇乳酸菌的研究中，其降膽固醇能力處于較高水平，具有一定的研究價值。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA 鑒定其為戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）。耐酸、耐膽鹽、疏水性、自凝聚力和代謝物抑菌性評價的試驗結(jié)果表明，菌株ZG2YLu05具有適應(yīng)腸道環(huán)境并發(fā)揮作用的潛力，是一株安全高效的降膽固醇乳酸菌，可作為潛在益生菌用于后期輔助降脂益生菌制劑的研發(fā)。由于本研究僅對乳酸菌的體外降膽固醇能力進(jìn)行了探究，后期還需進(jìn)行動物試驗更進(jìn)一步驗證菌株ZG2YLu05降膽固醇的能力。