阿衣其來(lái)克·托合托遜，布左熱·吾守

（克孜勒蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿圖什市 845350）

牦牛養(yǎng)殖中非常容易感染大腸桿菌，有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與牦牛敗血癥、腸毒血癥等疾病存在著密切聯(lián)系，極易增加牦牛的病死率，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1～2]。目前主要使用疫苗和抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，但由于大腸桿菌具有多種血清型的特點(diǎn)，僅靠疫苗不能達(dá)到良好的防治效果。同時(shí)，由于不合理使用抗生素，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷增多，治療效果也不理想。因此，需深入分析西藏地區(qū)牦牛大腸桿菌的耐藥情況，對(duì)菌株的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，以確保臨床用藥的安全性[1～2]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年5 月至2021 年5 月，在克州烏恰縣、克州阿克陶縣、克州阿圖什市哈拉峻鄉(xiāng)，選取牦牛糞便樣品120份，放在4℃環(huán)境內(nèi)儲(chǔ)存。

1.2 菌株的分離與純化

無(wú)菌環(huán)境下，選取樣品5 g，放置在37℃搖床內(nèi)的NB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。然后劃線接種在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h。選取菌落劃線在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板上，菌落為粉紅色、圓形，再次放在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。最后選擇1 個(gè)大腸桿菌疑似菌落放在MH 瓊脂培養(yǎng)基平板上，純化3 代后直接接種在NB 液體培養(yǎng)基中。為了確保后續(xù)使用，需用30%甘油將液體封存，放置在-70℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 菌株鑒定

選用細(xì)菌脫氧核醣核酸（DNA）提取試劑盒提取菌液DNA，菌株來(lái)源于成都Foregene 生物公司。反應(yīng)條件為95℃，預(yù)變性一般設(shè)置5 min。其中共有40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中的溫度在94℃時(shí)都會(huì)出現(xiàn)變形，變形時(shí)間可以達(dá)到1 min。54℃退火45 s，72℃需進(jìn)行延伸，延伸時(shí)間1 min。最后72℃時(shí)延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行觀察，保存觀察內(nèi)容便于后續(xù)使用。PCR 產(chǎn)物需送到武漢擎科生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)定，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（GenBank）中輸入測(cè)序序列，隨后對(duì)比基本局部比對(duì)搜索工具（BLAST）使用情況。

1.4 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)方式為紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B 法)。試驗(yàn)需在非常干凈的工作臺(tái)上進(jìn)行，操作中用蒸餾水稀釋細(xì)菌液體；麥?zhǔn)媳葷岷笥脽o(wú)菌棉棒蘸取菌液，均勻涂抹在整個(gè)MH 瓊脂平板上。涂抹后需立即蓋上培養(yǎng)皿，使其處于干燥狀態(tài)，時(shí)間一般控制在5 min。用無(wú)菌鑷子將藥敏片均勻放置在存有菌瓊脂板的表面上，藥敏片種類(lèi)包括頭孢曲松鈉、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素、氧氟沙星等。恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。選用ATCC25922 的大腸桿菌為質(zhì)控菌株。

1.5 ESBLs 基因型和基因亞型檢測(cè)

ESBLs 基因型以及基因亞型檢測(cè)采用PCR 完成，引物序列和反應(yīng)方法詳見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌耐藥基因和毒力基因引物序列

1.6 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

采用PCR 對(duì)菌株的耐藥基因和毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，引物同樣由武漢擎科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

在120 份樣品中采用鑒別培養(yǎng)、PCR 檢測(cè)、堿基序列比對(duì)等方式進(jìn)行試驗(yàn)，共分離出103 株大腸桿菌，分離率可達(dá)到86.41%。

2.2 藥敏試驗(yàn)

在已經(jīng)分離出的103 株大腸桿菌中，諾氟沙星、頭孢噻呋、慶大霉素、安普霉素耐藥率分別達(dá)到99.6%、100.00%、54.60%和55.8%，磺胺類(lèi)藥物、新諾明耐藥率也在96%以上。所有藥敏片測(cè)試中，慶大霉素、安普霉的耐藥率分別為54.60%和55.8%，是所有耐藥中最低的。

2.3 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

在已經(jīng)分離出的103 株大腸桿菌中，11 株至少攜帶1 種表型耐藥基因。與藥敏試驗(yàn)的最終結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，藥敏試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)共有31 株耐藥菌株。其中，19 株經(jīng)專(zhuān)業(yè)人員檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有出現(xiàn)耐藥基因。但是有2 個(gè)以上耐藥基因菌株，在藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在多重耐藥的基本特征。

毒力基因檢出率32.6%，40 株菌株中至少有1 種攜帶了1 種以上毒力基因。其中，10 株菌株攜帶2 種或2 種以上毒力基因；3株菌株中發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶外膜蛋白A（ompA）和內(nèi)皮素受體A（etrA）。

3 結(jié)論

對(duì)120 份樣品進(jìn)行鑒別培養(yǎng)、PCR 檢測(cè)、堿基序列對(duì)比等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共分離出大腸桿菌89 株，分離率高達(dá)86.41%，可以直觀說(shuō)明地區(qū)存在大腸桿菌嚴(yán)重污染。不合理使用抗生素治療和預(yù)防大腸桿菌感染，會(huì)造成耐藥菌株、耐藥譜出現(xiàn)逐漸擴(kuò)大趨勢(shì)[3]。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，毒力基因ompA 檢出率最高，達(dá)到25.00%；其次是etrA，檢出率達(dá)到22.50%；ESBLs 檢出率最低。另外，分離出的103 株大腸桿菌中對(duì)頭孢他啶和氧氟沙星較敏感。本次試驗(yàn)獲取的牦牛源大腸桿菌流行病學(xué)特點(diǎn)，可為臨床用藥的合理性提供可靠數(shù)據(jù)參考。