李燦，李振峰，馬劉正，張偉，李曉冬，VIJAYA Raghavan，胡建東，4*

（1.河南省農(nóng)業(yè)激光技術(shù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南問道光電科技有限公司，鄭州 450002；3.McGill大學(xué)生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾H9X3V9；4.小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

雖然大部分農(nóng)業(yè)工作者已經(jīng)遵從精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)、科學(xué)施肥的原則，但在某些地區(qū)依然存在施肥過度的問題，目前我國化肥消耗量約占世界的35%，過量的氮、磷導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，嚴(yán)重威脅人類賴以生存的水資源。我國不同類型土壤對于不同的作物目標(biāo)產(chǎn)量需要不同的施肥量，過量化學(xué)肥料施用不僅對生態(tài)環(huán)境造成破壞，還影響到作物產(chǎn)量。長期過量施肥還會引起土壤理化性狀惡化，加速土壤酸化。據(jù)第二次全國土壤面源污染調(diào)查報(bào)告顯示，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)引起的河湖流域總氮、總磷面源污染量分別占總污染量的36.79%、50.23%。因此實(shí)施科學(xué)施肥，不僅有助于糧食產(chǎn)量提高，而且能極大地降低農(nóng)田面源氮、磷污染。只有全面掌握土壤養(yǎng)分分布狀況，才能根據(jù)肥料釋放規(guī)律和作物養(yǎng)分吸收特點(diǎn)等針對性地施肥，從而提高肥料利用率。

土壤氮、磷測量典型的方法有質(zhì)譜法、色譜法、電化學(xué)法和分光光度法等，其中質(zhì)譜法和色譜法的測試結(jié)果精確，但測試成本高，且需專業(yè)的操作人員。電化學(xué)方法的檢測速度快，但是檢測結(jié)果易受到待測樣品中其他離子的干擾，尤其是待測樣品中有機(jī)分子對其影響較大。紫外可見分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）盡管操作繁雜，但方法成熟，測試結(jié)果可靠，所以仍是實(shí)驗(yàn)室檢測氮、磷的主要方法。目前，隨著光電探測技術(shù)和自動(dòng)控制技術(shù)的進(jìn)步，流動(dòng)分析方法在土壤氮、磷自動(dòng)化測試方面最具有潛力。按照傳質(zhì)過程和化學(xué)反應(yīng)發(fā)生條件進(jìn)行分類，流動(dòng)分析方法有擴(kuò)散對流（Dispersion convection）和強(qiáng)制對流（Forced convection）兩種。市場化的流動(dòng)分析方法普遍采用智能機(jī)器手或者注射泵實(shí)現(xiàn)微量土壤氮、磷樣品自動(dòng)化進(jìn)樣，不僅使試劑消耗量降低了90%以上，而且減少了紫外可見分光光度法中由于操作者帶來的操作誤差。但現(xiàn)有流動(dòng)分析方法由于追求多樣品的測試速度而沒有考慮化學(xué)反應(yīng)的徹底性，導(dǎo)致被測對象的回收率低。為此，本研究提出擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析法，在測試系統(tǒng)中增加集成化學(xué)反應(yīng)腔，不僅滿足土壤樣品快速測試，而且最大限度地保證了化學(xué)反應(yīng)完全徹底地進(jìn)行。擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析法通過多通道切換閥連接多個(gè)土壤有效態(tài)氮、磷樣品和試劑，實(shí)現(xiàn)土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷依次自動(dòng)連續(xù)測量。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

檸檬酸鈉、鉬酸銨購自天津永大化學(xué)試劑有限公司；水楊酸鈉、硝普鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸、氫氧化鈉、二氯異氰脲酸鈉、N-1-萘基乙二胺鹽酸、硫酸鋅、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、濃硫酸、氯化鈷、十二烷基硫酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Brij-35 購自合肥千盛生物科技有限公司；十水二磷酸鈉、硫酸肼購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、磺胺購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)過程所用的水均為去離子水。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自北京海岸鴻蒙有限公司。

1.2 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法

擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法構(gòu)建方案如圖1所示，其構(gòu)建思想是采用化學(xué)反應(yīng)腔和模塊化光電探測單元，實(shí)現(xiàn)流動(dòng)分析穩(wěn)態(tài)測量。被測樣品和試劑通過注射泵精確定量化后依反應(yīng)先后順序注入化學(xué)反應(yīng)腔，反應(yīng)集中在化學(xué)反應(yīng)腔內(nèi)進(jìn)行。然后程序控制蠕動(dòng)泵正反轉(zhuǎn)，提供化學(xué)反應(yīng)所需要的混合動(dòng)力，空氣從化學(xué)反應(yīng)腔的底部泵入推動(dòng)樣品和試劑循環(huán)擾動(dòng)，加速其化學(xué)反應(yīng)過程，待反應(yīng)完成后流入光電探測單元。

圖1 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤氮、磷測試原理示意圖Figure 1 Schematic diagram of the principle of soil nitrogen and phosphorus testing by perturbation diffusion flow analysis

擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法涉及到復(fù)雜物理化學(xué)過程，如擾動(dòng)力學(xué)、流體擴(kuò)散、對流和化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等。首先被測樣品被注射泵注入到化學(xué)反應(yīng)腔，然后依次根據(jù)反應(yīng)對象和條件注入相應(yīng)的試劑。蠕動(dòng)泵正轉(zhuǎn)抽取化學(xué)反應(yīng)腔中反應(yīng)物進(jìn)入均勻螺旋環(huán)發(fā)生擴(kuò)散反應(yīng)，再高速反轉(zhuǎn)使其泵回化學(xué)反應(yīng)腔中發(fā)生湍流運(yùn)動(dòng)，加速化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。反復(fù)擾動(dòng)化學(xué)反應(yīng)腔中的反應(yīng)物使其化學(xué)反應(yīng)到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，最后流入模塊化光電探測單元進(jìn)行土壤氮、磷含量測試。與常見流動(dòng)分析方法只能進(jìn)行瞬態(tài)測試相比，擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法提供了一種全新的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)分析方法。

擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)中化學(xué)反應(yīng)腔和螺旋管中樣品和試劑混合反應(yīng)以擴(kuò)散和對流為主。根據(jù)菲克第一定律（Fick’s first law），化學(xué)反應(yīng)腔中反應(yīng)物徑向和軸向質(zhì)量擴(kuò)散通量為：

式中：為溶液擴(kuò)散系數(shù)，m·s；為溶液擴(kuò)散濃度，kg·m；為軸向距離，m；為徑向距離，m；和分別為軸向和徑向質(zhì)量擴(kuò)散通量，kg·m·s。“-”號表示擴(kuò)散方向?yàn)闈舛忍荻鹊姆捶较?，即擴(kuò)散組元由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴(kuò)散。

在直流管道流動(dòng)過程中，無量綱雷諾數(shù)用于判斷液體流動(dòng)形式為層流或湍流，當(dāng)雷諾數(shù)超過2 100時(shí)，液體管道流動(dòng)形式為湍流，反之則為層流，雷諾數(shù)計(jì)算公式為：

在層流條件下，所有溶液流動(dòng)都遵循平行于主方向流線，不同直徑方向流速計(jì)算公式為：

由于液體擴(kuò)散系數(shù)值非常低，通常約為10～10m·s，因此擴(kuò)散通量相比于對流質(zhì)量傳質(zhì)通量來說，其值也非常低。在擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)中，蠕動(dòng)泵推進(jìn)液體進(jìn)行擾動(dòng)，流量小于5 mL·min，管半徑為0.3～0.8 mm，液體流動(dòng)形式為層流（＜150）。根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定管子直徑、長度和各器件位置合理布局等。氣泡分割測試溶液成多段，實(shí)現(xiàn)樣品多次連續(xù)測量，使擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法測試土壤氮、磷自動(dòng)化。

1.3 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.3.1 系統(tǒng)組成與結(jié)構(gòu)

基于擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤氮、磷測定系統(tǒng)如圖2所示，由3個(gè)單元組成，分別是樣品和試劑量化取樣單元、化學(xué)反應(yīng)腔單元和模塊化光電探測單元。

圖2 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析法土壤氮、磷測試系統(tǒng)組成及結(jié)構(gòu)Figure 2 Composition and structure of soil nitrogen and phosphorus testing system by perturbation diffusion flow analysis

被測樣品和試劑取樣單元由多通道電磁閥組、儲液環(huán)、微量注射泵（分辨率0.041 5 μL）和超聲液位傳感器組成。多通道電磁閥組包括試劑和樣品溶液切換電磁閥。土壤樣品溶液和試劑的切換由八通道電磁切換閥實(shí)現(xiàn)，電磁切換閥點(diǎn)到點(diǎn)的速度為300 ms，最大驅(qū)動(dòng)力1.6 N，完成待測樣品的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷依次測量。儲液環(huán)由內(nèi)徑1.5 mm 和外徑2.5 mm 的塑料軟管制成圓環(huán)形狀，樣品和試劑提取完成后，儲液環(huán)內(nèi)充滿去離子水，防止交叉污染。微量注射泵每次抽取液體最大容量為5 mL，步進(jìn)電機(jī)步距角為0.9°，額定行程為30 mm，步數(shù)為120 000步，線性范圍為0.017～5.000 mm·s，控制分辨率為0.002 5 mm。最小進(jìn)樣量為0.041 5 μL，速度為1～50 r·min，重復(fù)性誤差為3‰～7‰。

1.3.2 化學(xué)反應(yīng)腔

化學(xué)反應(yīng)腔是擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)最重要的單元。樣品和試劑通過注射泵精確提取之后，蠕動(dòng)泵反復(fù)擾動(dòng)化學(xué)反應(yīng)腔中反應(yīng)物，使其充分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，然后流入光電探測單元。化學(xué)反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)如圖3 所示，包括頂端蓋、霧化噴頭、化學(xué)反應(yīng)混合筒和下端蓋?；瘜W(xué)反應(yīng)腔為石英玻璃材質(zhì)，內(nèi)壁涂覆疏水涂層使液體匯集成液滴，減少液體內(nèi)壁殘留。通過控制蠕動(dòng)泵流量使霧化噴頭噴射到化學(xué)反應(yīng)腔內(nèi)壁，液體最高點(diǎn)距頂端蓋尺寸適中。程序控制蠕動(dòng)泵首先抽取化學(xué)反應(yīng)腔內(nèi)反應(yīng)物，然后再反轉(zhuǎn)，使溶液全部泵回化學(xué)反應(yīng)腔，接著泵入一段空氣，使化學(xué)反應(yīng)腔中樣品和試劑充分?jǐn)_動(dòng)并達(dá)到反應(yīng)平衡。

圖3 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析法化學(xué)反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)Figure 3 Chemical reaction chamber structure of perturbation diffusion flow analysis method

1.3.3 模塊化光電探測單元

模塊化光電探測單元由微流池、光源控制電路、信號處理電路、光電信號采集與傳輸電路組成。光源控制電路板和光電信號采集電路板分別安裝在微流池兩端，信號處理電路板置于微流池側(cè)面，各板之間信號以RS485 總線協(xié)議與主控制器通訊。由于土壤速效氮、磷含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，不同地域不同時(shí)期土壤速效氮、磷含量差別較大，如低施肥和森林土壤速效氮、磷含量普遍較低。為了滿足不同情況下測試精度要求，微流池可組成10、20 mm 和30 mm 3種不同光程長，組合LED 光源波長有405、440、515、550、640、880 nm和660 nm等供選擇。

2 結(jié)果及討論

2.1 樣品和試劑取樣誤差

擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法采用微量注射泵和儲液環(huán)精確提取土壤速效氮、磷樣品和試劑，樣品和試劑定量化提取的準(zhǔn)確性直接影響到擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析測試結(jié)果。為了評測取樣誤差，在操作系統(tǒng)中設(shè)定提取量分別為0.2、0.4 mL 和1.0 mL 的去離子水，經(jīng)過注射泵注入到化學(xué)反應(yīng)腔后，采用標(biāo)準(zhǔn)體積量具從化學(xué)反應(yīng)腔端接提取液，分別重復(fù)5次，測試結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取樣品最大絕對偏差和最大相對偏差分別為0.006 mL 和1.56%，滿足擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法對取樣精度要求。

表1 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析取樣誤差Table 1 Sampling errors of perturbation diffusion flow analysis

2.2 蠕動(dòng)泵流量校正

為了減少擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤速效氮、磷測定系統(tǒng)中液體在管道中殘留，同一個(gè)樣品被氣泡分割多段進(jìn)入流動(dòng)系統(tǒng)，氣泡的引入和樣品流動(dòng)穩(wěn)定性不僅影響氣泡大小，而且影響數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性。擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)中使用了多個(gè)蠕動(dòng)泵，為了使不同蠕動(dòng)泵的流量保持一致，設(shè)計(jì)了蠕動(dòng)泵流量校正程序，校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。校正后，平均流量值為4.075 mL·min，最大絕對標(biāo)準(zhǔn)偏差和最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.029 mL·min和0.71%。

表2 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析進(jìn)樣誤差Table 2 Injection errors of perturbation diffusion flow analysis

2.3 實(shí)際樣品測量

采集湖北省國家農(nóng)業(yè)環(huán)境潛江觀測實(shí)驗(yàn)站同一地區(qū)不同點(diǎn)的10 個(gè)水稻土土壤樣品，對土樣中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮和水溶性磷含量進(jìn)行測定。土壤樣品取樣深度為20 cm。銨態(tài)氮測定基于靛酚藍(lán)反應(yīng)方法和納氏試劑反應(yīng)方法，硝態(tài)氮測定基于重氮偶合反應(yīng)方法，水溶性磷測定基于抗壞血酸還原鉬藍(lán)反應(yīng)方法。選擇擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤氮、磷測試模塊化光電探測單元光程長20 mm，設(shè)定PID 控制器控制溫度為37 ℃。土壤待測樣品分別分成2份，一份用擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行測量，另一份采用紫外可見分光光度計(jì)測量。用于建立銨態(tài)氮測量標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、1.2、1.8、2.6 mg·L和3.2 mg·L，土壤標(biāo)準(zhǔn)硝態(tài)氮濃度分別為0、2、4、5 mg·L和6 mg·L，土壤標(biāo)準(zhǔn)水溶性磷溶液濃度分別為0、0.6、1.2、2.0 mg·L和2.6 mg·L。首先對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，建立擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析測試吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校準(zhǔn)曲線，如圖4所示。圖4a基于靛酚藍(lán)反應(yīng)方法吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性相關(guān)系數(shù)為0.992 8，基于納氏試劑反應(yīng)銨態(tài)氮擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法相關(guān)系數(shù)為0.998 1?；谙鯌B(tài)氮重氮偶合反應(yīng)擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析測量方法相關(guān)系數(shù)為0.994 2，基于水溶性磷鉬藍(lán)反應(yīng)擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析測量方法相關(guān)系數(shù)為0.997 9。

圖4 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤速效氮、磷校準(zhǔn)曲線Figure 4 Perturbation diffusion flow analysis of soil effective state nitrogen and phosphorus calibration curve

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立之后，分別采用兩種方法進(jìn)行對比測量。紫外可見分光光度法采用275 nm和220 nm測定土壤速效氮磷含量。首先連續(xù)進(jìn)行5 次空白溶液測試，然后測量實(shí)際樣品。擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤速效氮磷測量值與紫外可見分光光度計(jì)測量值之間的相關(guān)性如圖5所示。

由圖5a 可知，基于硫酸鈉和碳酸氫鈉聯(lián)合浸提納氏試劑反應(yīng)集成流動(dòng)分析銨態(tài)氮測量值與常規(guī)測量值之間的相關(guān)系數(shù)為0.915 5，基于氯化鈣浸提的土壤銨態(tài)氮靛酚藍(lán)反應(yīng)、硝態(tài)氮重氮偶合反應(yīng)和水溶性磷鉬藍(lán)反應(yīng)集成反應(yīng)流動(dòng)分析測試值與常規(guī)方法測量值之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 5、0.990 1和0.991 1（圖5b～圖5d）?？梢姅_動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析測試與常規(guī)方法具有很好的相關(guān)性。擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析能夠滿足不同浸提及測量方法體系自動(dòng)化分析，其通用性和可移植性將使其具有很好的應(yīng)用前景。

圖5 擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析土壤速效氮、磷樣品相關(guān)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Figure 5 Experimental validation of correlation of soil effective state nitrogen and phosphorus samples by perturbed diffusion flow analysis

2.4 檢出限與精密度

測定11 次空白溶液的吸光度，計(jì)算各指標(biāo)的檢出限（LOD），計(jì)算公式為LOD=3·，（為11 次測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，為接近LOD 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）。通過計(jì)算，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷的檢出限分別為0.055 4、0.020 3 mg·L和0.008 4 mg·L，平均值分別為0.018 0、0.011 1 mg·L和0.008 5 mg·L，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.002 6、0.001 6 mg·L和0.000 3 mg·L。

擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)土壤速效氮磷分析儀在進(jìn)行銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷重復(fù)性測定中的結(jié)果顯示，其平均值（=7）分別為1.98、2.05 mg·L和2.02 mg·L，標(biāo)準(zhǔn)偏差（=7）分別為0.035、0.099 mg·L和0.019 mg·L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，=7）分別為1.8%、4.8%和1.0%，滿足現(xiàn)場測試要求。

2.5 與AA3（Seal Analytical）連續(xù)流動(dòng)分析方法對比

分別取銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品為0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L，硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品為0.50、1.00、2.00、4.00 mg·L進(jìn)行測試（=5），對比擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析法與AA3連續(xù)流動(dòng)分析方法，測試結(jié)果如表3、表4所示。

表3 兩種方法銨態(tài)氮測試結(jié)果對比Table 3 Comparison of ammonium nitrogen test results between the two methods

表4 兩種方法硝態(tài)氮測試結(jié)果對比Table 4 Comparison of nitrate nitrogen test results between the two methods

根據(jù)測試結(jié)果，在銨態(tài)氮檢測方面，AA3 連續(xù)流動(dòng)分析方法的最大誤差是50.80%，本方法的最大誤差是6.00%，在檢測硝態(tài)氮方面，AA3 連續(xù)流動(dòng)分析方法的最大誤差是3.60%，本方法的最大誤差是6.00%，說明這兩種方法具有可比性。AA3 型流動(dòng)分析方法采用機(jī)器手自動(dòng)化定量取樣，而本方法采用注射泵程序化定量取樣，因此，在確保取樣量化精度上，本測試方法構(gòu)建成本極大降低。

3 結(jié)論

（1）本研究對新穎的擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法進(jìn)行了理論分析，構(gòu)建了擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由樣品和試劑量化取樣單元、化學(xué)反應(yīng)腔單元和模塊化光電探測單元三部分組成。

（2）采用來自于不同地區(qū)的土壤樣品對擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)土壤樣品分析使用的紫外可見分光光度法的測定結(jié)果進(jìn)行了對比，結(jié)果表明，兩者測定結(jié)果有較高的相關(guān)性。擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析系統(tǒng)不需要人工參與操作，極大地減少了操作人員帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。

（3）采用標(biāo)準(zhǔn)樣品與基于常規(guī)流動(dòng)分析方法的AA3 型儀器進(jìn)行對比，結(jié)果表明，兩種方法均能夠自動(dòng)化完成樣品測試，在低濃度范圍內(nèi)，本文提出的擾動(dòng)擴(kuò)散流動(dòng)分析方法具有較高的測試精度。