鄒琳，張昕，李麗

心肌梗死后左心室重構(gòu)是心力衰竭（心衰）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是左心室大小、形狀、功能、細(xì)胞和分子組成等復(fù)雜的短期和長期病理生理變化，這一進(jìn)程主要依賴于炎癥反應(yīng)和心肌纖維化[1]。心肌纖維化是受損的正常心肌組織被纖維化組織替代，喪失其正常的結(jié)構(gòu)、功能的病理性進(jìn)程，與膠原蛋白等心肌細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積有關(guān)，是獨(dú)立于射血分?jǐn)?shù)之外的心衰患者死亡的重要因素之一。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的多條信號(hào)通路參與，其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β/絲/蘇氨酸激酶受體（Smad）通路是啟動(dòng)心肌纖維化的核心通路[2]。通過抑制TGF-β/Smad 通路改善心肌纖維化水平，對(duì)治療心肌梗死后纖維化具有重要的研究及臨床意義。

鞣花酸是一種分子量為302.28 的多酚類化合物，其分子式為C14H6O8，廣泛存在于石榴等漿果與各類干果中，具有抗炎、抗氧化與抗癌作用。有研究表明，鞣花酸可通過抑制Wingless/Integrated（Wnt）信號(hào)通路減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[3]。同時(shí)研究表明，鞣花酸可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 通路誘導(dǎo)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（HCT-116）周期阻滯和凋亡[4]。此外鞣花酸還被證實(shí)為傳統(tǒng)蒙藥冠心舒通膠囊的有效成分之一[5]，而冠心舒通膠囊的抗心肌纖維化作用與其拮抗TGF-β/Smad 通路有關(guān)[6]。因此推測鞣花酸也可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 通路改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。本實(shí)驗(yàn)擬采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立大鼠心肌梗死模型，觀察鞣花酸是否可通過抑制TGF-β/Smad 通路減輕心肌纖維化程度，改善心臟功能。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：80 只SD 雄性大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量均為200～220 g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蒙）2016-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

主要藥物及試劑：鞣花酸（純度≥98%，貨號(hào)：E808704，購自上海麥克林生化科技有限公司）；吡非尼酮（購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司）；白細(xì)胞介素（IL）-6（貨號(hào)：CK-E30219）、Ⅰ型膠原蛋白α2（COL1α2，貨號(hào)：CK-E31131）、Ⅲ型膠原蛋白α1（COL3α1，貨號(hào)：CK-E37320）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：PICPI23223，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白預(yù)染Marker（貨號(hào)：SM1811，購自美國Fermentas 公司）；TGF-β1（貨號(hào)：Ab215715）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，貨號(hào)：Ab9485）抗體均購自美國 Abcam 公司；Smad2（貨號(hào)：#5339）、Smad3（貨號(hào)：#9523）抗體均購自美國CST 公司；引物由上海信帆生物科技有限公司合成；SYBR Green PCR 試劑盒（貨號(hào)：#K0223，購自美國Thermo Fisher Scientific公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：#K1622，購自美國Fermentas 公司）。

儀器：mini protean 3 cell 型電泳儀（購自美國BIO-RAD 公司）；TE77XP 型電轉(zhuǎn)儀（購自美國HOEFER 公司）；MK3 型酶標(biāo)儀（購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；Vivid E9 型心動(dòng)超聲儀器（購自美國 GE 公司）；Real-time 檢測儀（購自美國ABI公司）。

1.2 分組、建模及給藥

通過結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死模型。取雄性SD 大鼠80 只，按隨機(jī)數(shù)表法挑選20 只作為假手術(shù)組，其余60 只建模。大鼠術(shù)前禁食水12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（注射劑量0.4g/kg）。麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，連接心電圖儀器，備皮、消毒、經(jīng)喉氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸機(jī)數(shù)值。開胸，于左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間用6 號(hào)手術(shù)線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。當(dāng)結(jié)扎完大鼠體表心電圖Ⅱ?qū)?lián) ST段抬高≥0.1 mV 即表示冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功。抽出大鼠胸腔內(nèi)氣體，用3 號(hào)線縫合肋間隙等組織層，術(shù)后腹腔注射青霉素5 萬U/d 預(yù)防感染。建模后假手術(shù)組全部存活，其余60 只建模后存活47 只，13 只均于結(jié)扎后24 h 內(nèi)死亡。各組大鼠術(shù)后正常給予食水，成模大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為3 組：心肌梗死模型組（n=15）、吡非尼酮組（n=16）、鞣花酸組（n=16）。稱取300 mg 吡非尼酮和20 mg 鞣花酸，融入5 ml超純水中，造模4 d 后吡非尼酮組按照300 mg/kg 吡非尼酮，鞣花酸組按照20 mg/kg 鞣花酸，灌胃給藥，每日1 次，其余兩組給予等量超純水灌胃，共4 周。

1.3 大鼠心臟多普勒超聲檢測

大鼠末次給藥12 h 后，10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉。麻醉后固定、備皮，采用心臟多普勒超聲檢測大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）。每只大鼠測8個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。操作和分析由心功能科?？漆t(yī)師完成。

1.4 大鼠心肌組織處理

處死大鼠，剪下心臟，生理鹽水灌洗心腔，洗凈心腔內(nèi)殘余血液，將結(jié)扎處以下心室壁從心底到心尖切為三等份，分別用于ELISA、蛋白免疫印跡（Western blot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測。將處理好的心肌組織置于-80℃保存。

1.5 ELISA 檢測IL-6、COL1α2、COL3α1

取一部分凍存的心肌組織移入玻璃勻漿器，每1 g 心肌組織加入 5 ml（pH=7.4，濃度為10 mM）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS），置于冰上充分研磨，勻漿液5000 rpm/min，離心5 min，收集上清液。參考文獻(xiàn)[7]步驟，使用ELISA 試劑盒檢測大鼠心肌組織中IL-6、COL1α2、COL3α1 水平。每組取10 個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot 法檢測心肌組織中TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白水平

取-80℃保存的心肌組織，置于冰上研磨，加入裂解液。裂解后的樣品4℃ 12 000 rpm/min，離心15 min，取上清進(jìn)行BCA 蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心取上清上樣。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-多聚酰胺凝膠電泳分離，半干式轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入特異性一抗TGF-β1、Smad2、Smad3（稀釋倍數(shù)均為1:1000），和膜室溫孵育2 h；孵育一抗的膜用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5min，隨后1:1000 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h，用TBST 洗滌3 次，每次5 min。條帶用發(fā)光液發(fā)光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件分析。每組取4 個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 qPCR 法檢測心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)水平

取適量大鼠心肌組織，提取組織總RNA。將提取的總RNA 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采集熒光信號(hào)40 個(gè)循環(huán)。目的基因TGF-β1正向引物5' GGACTACTACGCCAAAGAAG 3'，反向引物5' TGTTGCTCCACAGTTGAC 3'；目的基因Smad 2 正向引物5' TCCATCTTGCCATTCACTC 3'，反向引物 5' TCCTGTCCATTCTGTTCTC 3'；目的基因Smad 3正向引物5' TTCACCCTGGGATGTAAG 3'，反向引物5' GGCTCCTCATTTCACAAC 3'；內(nèi) 參GAPDH 正 向引物 5' GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，反向引物 5'TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-△△CT表示。每組取3 個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（表1）

表1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（）

表1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（）

注：LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；FS：左心室短軸縮短率。與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與心肌梗死模型組比較△P＜0.05

與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠LVEDD、LVESD 均顯著增大（P均＜0.05），LVEF、FS 均顯著降低（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠的LVEDD、LVESD均顯著縮?。≒均＜0.05），LVEF、FS 均顯著升高（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的LVEDD（P=0.636）、LVESD（P=0.917）、LVEF（P=0.872）、FS（P=0.710）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 四組大鼠ELISA 檢測結(jié)果（表2）

表2 ELISA 法檢測四組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

表2 ELISA 法檢測四組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

注：ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；IL-6：白細(xì)胞介素-6，COL1α2：Ⅰ型膠原蛋白α2；COL3α1：Ⅲ型膠原蛋白α1。與假手術(shù)組比較 *P＜0.05，與心肌梗死模型組比較△P＜0.05

與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明顯降低（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明顯升高（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織IL-6（P=0.482）、COL1α2（P=0.994）、COL3α1（P=0.814）水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 四組大鼠qPCR 檢測結(jié)果（圖1）

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)水平

分析四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)情況，得到TGF-β1（F=127.124）、Smad2（F=284.247）、Smad3（F=103.582），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明顯升高（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明顯降低（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織中TGF-β1（P=0.132）、Smad2（P=0.077）、Smad3（P=0.769）mRNA 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 Western blot 檢測結(jié)果（圖2）

圖2 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平（n=4）

分析各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平情況，得到TGF-β1（F=107.624）、Smad2（F=353.296）、Smad3（F=74.287），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平

均明顯升高（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平均明顯降低（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織中TGF-β1（P=0.094）、Smad2（P=0.646）、Smad3（P=0.084）蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

鞣花酸是一種廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的多酚二內(nèi)酯，是沒食子酸的二聚衍生物。大量研究表明，鞣花酸具有抑制炎性反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激的作用[8-9]。此外研究表明[10]，鞣花酸可以抑制糖尿病大鼠心肌纖維化與心室重構(gòu)，改善其心臟功能。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈制備心肌梗死模型，以探討鞣花酸改善心肌纖維化的作用與機(jī)制。

結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支可模擬臨床急性心肌梗死患者的病理生理進(jìn)程，引起左心室心肌細(xì)胞凋亡及瘢痕形成，在心肌梗死早期即表現(xiàn)為心臟收縮與舒張功能障礙，通過多個(gè)細(xì)胞通路激活心室重塑進(jìn)程，被廣泛應(yīng)用于建立心肌纖維化的模型。本研究通過心臟多普勒超聲檢測大鼠心臟功能，結(jié)果顯示結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后，大鼠左心室腔擴(kuò)大，LVEF 和FS 明顯降低。與心肌梗死模型組相比，鞣花酸組大鼠左心室腔明顯縮小，LVEF 和FS明顯升高。提示應(yīng)用鞣花酸可改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

心肌纖維化是應(yīng)激、損傷或老化等多種因素引起心臟瘢痕形成的生理病理進(jìn)程，其特征是心臟成纖維細(xì)胞的異常增殖活化，在心肌中沉積過量的膠原基質(zhì)。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（Col1、Col3）是參與心肌纖維化主要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在生理狀態(tài)下，心肌成纖維細(xì)胞不斷合成細(xì)胞外基質(zhì)，使其分泌與分解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持正常的心臟環(huán)境。當(dāng)心肌梗死發(fā)生后，心臟成纖維細(xì)胞異常增殖活化以抵抗心肌細(xì)胞凋亡，并使膠原纖維大量分泌，合成大于分解，形成心肌纖維化[11]。本研究ELISA 結(jié)果提示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1 水平明顯增高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1 水平明顯降低。提示應(yīng)用鞣花酸可以減輕心肌梗死后的心肌纖維化進(jìn)程。

IL 是重要的炎性細(xì)胞因子，在心肌纖維化的進(jìn)程中扮演重要角色。有研究表明，敲除IL-6 基因可明顯降低心肌病小鼠的心肌纖維化程度[12]。本研究ELISA 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠血清中IL-6 水平明顯增高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠血清中IL-6 水平明顯降低。提示鞣花酸減輕心肌梗死后心肌纖維化進(jìn)程與其抗炎作用有關(guān)。

TGF-β/Smad 通路是調(diào)控心肌纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵性信號(hào)通路。TGF-β/Smad 信號(hào)通路參與心室重構(gòu)與炎癥、心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥厚、心肌纖維化等多種進(jìn)程有關(guān)[13]。研究表明，敲除心肌成纖維細(xì)胞TGF-β 受體1/2 可以抑制心肌纖維化進(jìn)程[14]。此外，敲除Smad3 也可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化進(jìn)程，同時(shí)減輕其心肌病理性肥厚和炎癥反應(yīng)[15]。另外TGF-β1 與Smad3 蛋白水平的下調(diào)可減輕慢性心衰兔模型的心肌纖維化程度，減少心肌細(xì)胞的凋亡[16]。本研究Western blot 和qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達(dá)均明顯升高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和mRNA 表達(dá)均明顯降低。提示鞣花酸改善心肌纖維化與抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路相關(guān)。

吡非尼酮可以降低TGF-βmRNA 水平，抑制TGF-β 蛋白的分泌，是經(jīng)典的TGF-β/Smad 信號(hào)通路抑制劑[17]。一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)表明，吡非尼酮可改善心衰患者的心肌纖維化[18]。本實(shí)驗(yàn)ELISA 結(jié)果顯示，與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平均明顯降低，與鞣花酸組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)Western blot 和qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達(dá)均明顯降低；鞣花酸組與吡非尼酮組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達(dá)均無明顯差異。提示TGF-β/Smad 信號(hào)通路參與了心肌梗死后心肌纖維化進(jìn)程，且在本實(shí)驗(yàn)劑量下鞣花酸與吡非尼酮在調(diào)控TGF-β/Smad 信號(hào)通路，改善心臟功能，抑制心肌纖維化的作用無明顯差異。

鞣花酸是多個(gè)中藥有效成分之一，在安全性上有其獨(dú)特的優(yōu)勢，現(xiàn)階段常作為藥品、保健食品的添加成分。綜上所述，鞣花酸可通過抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善心肌纖維化治療心肌梗死，改善心臟功能。為鞣花酸在臨床上的應(yīng)用提出了一定的理論依據(jù)與研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突