劉 鑫，付麗娟，于 靜，鄭鈉元，劉保東，丁國華*

(1 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025; 2 中國人民大學(xué) 附屬中學(xué)豐臺學(xué)校, 北京 100074)

隨著全球氣候變化的加劇，極端氣象事件的頻繁發(fā)生和降雨格局的變化加劇了區(qū)域尺度的干旱程度，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)大面積森林死亡，這對全球造成了嚴(yán)重的影響[1-2]。干旱對植物的傷害主要表現(xiàn)為光合下降、生長減慢、膜透性增加、細(xì)胞內(nèi)容物外滲和失水萎蔫，產(chǎn)生這些傷害的主要原因是活性氧的增加所造成的氧化傷害。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等是細(xì)胞抵御活性氧傷害的酶保護(hù)系統(tǒng)，逆境脅迫下的植物主要通過提高抗氧化酶活性清除體內(nèi)多余的活性氧，降低膜脂過氧化作用，增強(qiáng)植物對逆境脅迫的抵抗能力。

桫欏科(Cyatheaceae)植物起源于南美洲或澳大利亞的晚侏羅紀(jì)，是現(xiàn)存唯一的樹狀蕨類植物，其中筆筒樹(Sphaeropterislepifera)分布于中國廣東及福建的山坳中[10]。筆筒樹在生長發(fā)育過程中對環(huán)境要求苛刻，喜陰濕，忌強(qiáng)光。近年來，蕨類植物以其別具一格的觀賞性越來越受到人們的喜愛，但目前野生蕨類植物資源已受到嚴(yán)重破壞，引種馴化已成為一種既能滿足人們的觀賞需求又能進(jìn)一步保護(hù)種質(zhì)資源的途徑。干旱是引種馴化工作中需要解決的常見問題。如何提高筆筒樹的抗旱性成為影響其能否在含水量較低地區(qū)進(jìn)一步推廣的重要因素。為此，提升筆筒樹抗旱性和外界環(huán)境適應(yīng)性已成為當(dāng)前研究重點內(nèi)容。目前，應(yīng)用外源物質(zhì)提高蕨類抗旱性的研究鮮見報道。本研究以筆筒樹為材料，測定外源SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下筆筒樹幼苗的生長和生理特性的影響，為探究外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗的緩解效應(yīng)和生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

筆筒樹[Sphaeropterislepifera(Hook.) R. M. Tryon]孢子于2020年采自華南植物園，在4 ℃下保存；培養(yǎng)所用土壤取自黑龍江省尚志市帽兒山，土壤類型為暗棕壤；水楊酸購自哈爾濱化工化學(xué)試劑廠；氯化鈣購自黑龍江省阿城化學(xué)試劑廠；褪黑素、多效唑和2，4-表油菜素內(nèi)酯均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

參照檀龍顏等[11]的方法，將參試土壤過10目篩網(wǎng)后置于蒸汽高壓滅菌鍋中滅菌以除去蕨類及苔蘚孢子，滅菌條件為131 ℃、40 min，得到實驗用土。將所有實驗用土充分混勻，在電熱溫箱中烘干至恒重。取28個方形帶蓋1 L的培養(yǎng)盒，每盒加入300 g上述干土和160 mL蒸餾水(含水量約為35%)。按劉保東等[12]方法播種筆筒樹孢子。播種后每4 d噴施1次蒸餾水，保證土壤含水量在33%～37%，當(dāng)筆筒樹生長至孢子體時期，將28盒材料平均分為7組，分別進(jìn)行如下處理。CK為非干旱對照組，繼續(xù)每4 d噴施1次蒸餾水，使土壤含水量保持在 33%～37%；DCK為自然干旱對照組，不進(jìn)行噴施處理；DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR為外源物質(zhì)處理組，是在自然干旱的同時分別噴施1.0 mmol/L SA、150 μmol/L MT、100 mg/L PP333、2.5 mmol/L CaCl2和0.3 mg/L EBR溶液，外源物質(zhì)最適濃度通過預(yù)實驗的結(jié)果獲得。

噴施處理時將不同溶液裝入壓力噴壺，在幼苗上方5 cm處勻速噴霧，葉片表面均勻附著一層溶液即可。處理時間與CK組相同，即每4 d噴施1次，共噴施4次，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)8～10株幼苗。每次噴施處理后的次日上午取樣，設(shè)第1次噴施處理為第0天，則4次取樣的時間分別為第1、5、9和13天；在每處理組中隨機(jī)選取6株幼苗，測定生長量、光合特性指標(biāo)和相對電導(dǎo)率；在其余的幼苗中剪取生長狀況基本一致的充分展開葉，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于其他指標(biāo)的測定。取樣和測定生理指標(biāo)時各處理均進(jìn)行3次重復(fù)。

試驗期間每隔4 d取樣測定1次各處理土壤含水量(表1)，用公式(N-M)/N計算。式中：N表示烘干前土壤質(zhì)量(g)，M表示電熱溫箱烘干后土壤質(zhì)量(g)。由表1可知CK的土壤含水量保持在34%～37%，DCK、DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR的含水量均逐漸降低，處于干旱脅迫狀態(tài)。材料培養(yǎng)條件設(shè)置為：光照25 ℃/14 h，黑暗25 ℃/10 h，相對濕度為50%。

表1 試驗期間各處理土壤含水量Table 1 Soil moisture of each treatment during the test

1.3 測定指標(biāo)及方法

用游標(biāo)卡尺測定第1 天和第13 天植株地上部分和地下部分的長度，差值即為生長量，進(jìn)一步得到生長率，生長率(%)=(第13天長度-第1 天長度)/第1 天長度×100%[13]；在第1、5、9和13天采集葉片樣品，用Li-6400便攜式光合作用測定儀測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)，用雙波長法測定新鮮葉片的葉綠素含量(Chl)，浸提液為95%乙醇[14]。

同時，第1、5、9和13天葉片樣品的可溶性糖(SS)含量測定采用蒽酮比色法[15]，脯氨酸(Pro)含量測定采用磺基水楊酸法[16]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]，相對電導(dǎo)率(EL)采用電導(dǎo)率儀測定[18]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑法[18]，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[16]，過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫法[19]。

1.4 試驗數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗和相關(guān)性分析。將整理后的數(shù)據(jù)，用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換，再將各指標(biāo)隸屬函數(shù)值取平均值進(jìn)行相互比較。隸屬函數(shù)公式為：

U(Xi)=(Xi-Xmax)/(Xmax-Xmin)

式中U(Xi)為隸屬函數(shù)值，Xi為某項指標(biāo)測定值，Xmax和Xmin為所有處理中某一指標(biāo)的最大值和最小值[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長的影響

在自然干旱脅迫第13天時，觀察各處理筆筒樹幼苗表型(圖1)可知，與CK處理相比，DCK處理幼苗有較多的葉片出現(xiàn)黃化，底層葉片邊緣枯萎；與DCK處理相比，DCK+SA處理幼苗的葉片明顯復(fù)綠，生長狀態(tài)與CK接近；DCK+MT、DCK+Ca和DCK+PP333處理幼苗的個別葉片出現(xiàn)黃化，但是黃化程度都輕于DCK處理。

同時，對各處理筆筒樹幼苗生長指標(biāo)的測定結(jié)果(表2)顯示，干旱脅迫顯著抑制筆筒樹幼苗地上部分的生長，DCK處理幼苗地上部分的生長量比CK顯著降低了20.00%，其生長率較CK降低1.78%；各外源物質(zhì)處理組幼苗地上部分的生長量均顯著高于DCK處理，其中的DCK+SA和DCK+EBR處理又顯著高于其余處理，其生長量恢復(fù)至CK水平，生長率明顯高于CK。同時，干旱脅迫顯著促進(jìn)地下部分的生長，DCK處理幼苗地下部分的生長量比CK顯著增加了10.64%，其生長率較CK增加了0.87%；各外源物質(zhì)處理幼苗生長量和生長率均不同程度地高于DCK處理，其中的DCK+SA和DCK+EBR處理均較高，生長量增幅均達(dá)到顯著水平，生長率分別較DCK提高2.26%和2.31%。可見，外源物質(zhì)SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下筆筒樹幼苗地上和地下部分的生長都有一定促進(jìn)作用，并以SA和EBR處理的促進(jìn)效果更佳。

表2 不同處理下筆筒樹幼苗生長的變化Table 2 Variation of the growth of S. lepifera seedlings under different treatments

2.2 外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗光合特性的影響

圖2顯示，在干旱脅迫(DCK)條件下，筆筒樹幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量在各時期均比CK不同程度降低，且除第1天外降幅均達(dá)到顯著水平，各指標(biāo)在第13天時分別下降到CK的55.12%、72.41%、66.01%和34.72%(P<0.05)。從第5天開始，各外源物質(zhì)處理幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量均不同程度地高于同期DCK處理，且干旱脅迫時間越長增幅越大，在干旱脅迫第9和13天增幅均達(dá)到顯著水平，并多以DCK+SA、DCK+MT和DCK+EBR處理的表現(xiàn)更突出。其中，在處理第13天時，與DCK處理相比，筆筒樹幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量分別增加15.93%～39.82%、4.79%～25.40%、1.40%～24.25%和18.37%～34.93%?？梢?，各類外源物質(zhì)均能有效緩解干旱脅迫對筆筒樹幼苗葉片光合作用的抑制，并以適宜濃度的SA和MT處理的緩解效果更好。

2.3 外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗細(xì)胞膜傷害的影響

各時期干旱脅迫(DCK)筆筒樹幼苗葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量均比同期CK不同程度增加，且除了第1天外差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，在第13天時分別較CK顯著增加了64.12%和26.10%(圖3)。各外源物質(zhì)處理(DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR)幼苗葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量均比同期DCK處理不同程度降低，相對電導(dǎo)率在第9天、MDA含量在第5天開始降幅均達(dá)到顯著水平；在干旱脅迫第13天時，各處理葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量比DCK處理分別顯著下降13.17%～21.85%(圖3，Ⅰ)和11.99%～24.29%(圖3，Ⅱ)，并均以DCK+SA和DCK+EBR處理明顯較低，顯著低于其余處理。結(jié)果表明，外源物質(zhì)處理能夠顯著降低干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片的相對電導(dǎo)率和MDA含量，并以SA和EBR處理對植物細(xì)胞膜傷害的緩解效果較好。

2.4 外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

從圖4可知，隨著干旱脅迫時間的延長，干旱脅迫和各外源物質(zhì)處理筆筒樹幼苗的SOD和POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并均在第5天達(dá)到最大值，而它們的CAT活性均逐漸下降。在干旱脅迫第1天，DCK和各外源物質(zhì)處理幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均與CK無顯著差異。在脅迫第5～13天，DCK處理幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性在各時期大多比CK顯著降低；各外源物質(zhì)處理SOD、POD和CAT活性在各時期大多比DCK處理不同程度升高，且脅迫時間越長差異越明顯，并以DCK+SA、DCK+MT處理的酶活性明顯較高；在脅迫第13天時，DCK處理葉片的SOD、POD和CAT活性分別為同期CK的74.94%、87.64%和84.16%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；各外源物質(zhì)處理SOD、POD和CAT活性與DCK處理相比分別增加5.18%～18.79%、0.43%～9.33%、1.92%～7.84%，并均以DCK+SA和DCK+MT和DCK+EBR處理增幅較大，均達(dá)到顯著水平。由此可知，隨著干旱脅迫的加劇，筆筒樹幼苗葉片抗氧化酶活性下降，外源物質(zhì)處理可以有效緩解抗氧化酶活性降低，增強(qiáng)其抗旱性，并以噴施SA、MT和EBR的增強(qiáng)效果較好。

2.5 外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗滲透調(diào)節(jié)作用影響

由圖5可知，在干旱脅迫(DCK)下，筆筒樹幼苗葉片脯氨酸和可溶性糖含量在干旱脅迫處理第5～13天均比CK顯著增加，在第13天時增幅分別達(dá)到100%和28.08%(P<0.05)；干旱脅迫條件下，各外施外源物質(zhì)處理葉片的脯氨酸含量也均顯著高于同期CK，但與同期的DCK處理均無顯著性差異；與DCK處理相比較，各外源物質(zhì)處理葉片的可溶性糖含量在第5天無顯著變化，在第9～13天大多顯著降低，且以DCK+SA和DCK+MT處理相對較低；在脅迫處理第13天時，各外源物質(zhì)處理葉片可溶性糖含量分別較DCK處理顯著降低了12.39%、11.99%、5.48%、8.02%和11.76%(P<0.05)，而其脯氨酸含量降低幅度不顯著。以上結(jié)果表明，各外源物質(zhì)均能顯著降低干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片可溶性糖含量，有效緩解其積累，并以EBR處理效果最好，但5種外源物質(zhì)對脯氨酸積累都沒有顯著影響。

2.6 外源物質(zhì)對筆筒樹幼苗干旱脅迫傷害緩解作用的綜合評價

根據(jù)單一指標(biāo)評價外源物質(zhì)對干旱脅迫下筆筒樹幼苗傷害的緩解效應(yīng)，難以真實準(zhǔn)確地反映緩解效果。本研究通過隸屬函數(shù)法將每個指標(biāo)值轉(zhuǎn)換為(0, 1)的純數(shù)，優(yōu)化了不同指標(biāo)之間的可比性，對不同處理下的幼苗13個相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，最后根據(jù)各處理平均隸屬度值的由大到小進(jìn)行排序，位次越靠前，處理的緩解效果越好。結(jié)果(表3)表明，5種外源物質(zhì)對筆筒樹干旱脅迫的緩解效果表現(xiàn)為：SA>MT>EBR>Ca>PP333，這與各處理幼苗葉片的表型觀察結(jié)果相似。

表3 各外源物質(zhì)處理下指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 3 Membership function value of indicators under the treatment of various exogenous substances

3 討 論

干旱脅迫是對植物生長產(chǎn)生負(fù)面影響的主要威脅之一，可能導(dǎo)致ROS積累與抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡，造成氧化損傷。干旱脅迫還會抑制植物的生長發(fā)育，處于生殖生長階段的植物對干旱脅迫高度敏感。

本研究的結(jié)果表明，干旱脅迫顯著抑制筆筒樹地上部分生長，促進(jìn)地下部分生長，證明當(dāng)土壤水分條件發(fā)生變化時，筆筒樹幼苗會發(fā)生形態(tài)的變化來適應(yīng)干旱環(huán)境。隨著干旱脅迫時間的延長，筆筒樹幼苗的地上部分生長量減少，地下部分生長量增加，可能是由于干旱脅迫抑制了植物的細(xì)胞分裂，生物量分配傾向于地下部分，導(dǎo)致植株地上部分矮小、生長緩慢[21]。植物生長通常具有“旱長根、水長苗”的特性，蕨類植物筆筒樹幼小的孢子體的生長也遵循這一規(guī)律。研究表明，EBR在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞形態(tài)和生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。通過對一種BR合成缺陷突變體cpd(constitutive photomorphogenic dwarf)的研究中證明，BR 在植物生長中所起到的作用，揭示了 BRs 在有絲分裂調(diào)控中的作用[22]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下噴施5種外源物質(zhì)對筆筒樹幼苗的生長具有促進(jìn)作用。也表明干旱脅迫下經(jīng)SA、MT、CaCl2和EBR處理的植株株高和根長均較未處理對照顯著增加[23-26]。

同時，本研究中干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長量的下降可能是由于ROS的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致膜穩(wěn)定性降低和MDA含量升高[27]，加劇脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和葉綠素的損傷，并最終減少植物生物量積累。本研究中外源施用SA、MT、PP333、CaCl2和EBR可以提高筆筒樹幼苗的抗旱性，這可能與提高了筆筒樹葉片光合作用效率和葉綠素含量、增強(qiáng)了葉片的氣體交換屬性、促進(jìn)了抗氧化酶活性、降低了相對電導(dǎo)率和MDA含量有關(guān)。此前，有一些研究報道了干旱對許多植物生長都具有破壞性影響，破壞的范圍因脅迫的嚴(yán)重程度和植物生長階段而不同。也有研究表明SA、MT、PP333、CaCl2和EBR在干旱脅迫下對不同植物的生長性狀有重要的改善作用。

植物在遭受干旱脅迫時，為了減少水分損失和細(xì)胞內(nèi)CO2濃度而減少氣孔開度，造成光合作用中的氣孔限制。同時，光合系統(tǒng)接收的過多光能由于無法正常耗散而造成細(xì)胞的受損，細(xì)胞中累積 ROS 轉(zhuǎn)而造成葉綠素的消解并攻擊光合作用機(jī)構(gòu)，造成不可逆的傷害，從而導(dǎo)致光合作用效率總體下降。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤水分含量降低，筆筒樹幼苗葉片的Pn、Gs、Tr和葉綠素含量出現(xiàn)下降的趨勢，說明干旱脅迫下Pn和Gs的下降，嚴(yán)重影響水分利用和氣體交換。葉面噴施SA、MT、PP333、CaCl2和EBR均緩解了這些指標(biāo)的下降趨勢。Habibi等[28]研究表明，干旱脅迫大麥植株葉片的Pn、Gs和Tr顯著降低，而噴施SA處理能顯著提高這些參數(shù)。其他研究結(jié)果也表明，適當(dāng)施用MT、PP333、CaCl2和EBR能顯著抑制干旱條件下植物葉片Pn、Gs、Tr和葉綠素含量降低的幅度，對葉片光合作用有積極的緩解作用[24, 29-31]。

另外，植物還通過調(diào)節(jié)生理代謝抵御或緩解干旱脅迫造成的傷害，這些自發(fā)的調(diào)節(jié)體現(xiàn)著植物本身的耐旱性。脯氨酸和可溶性糖是干旱脅迫下植物滲透調(diào)節(jié)過程中非常重要的物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加，增強(qiáng)了自身適應(yīng)逆境的能力，與王雨婷等[32]在葡萄上的研究結(jié)果一致。經(jīng)過SA、MT、PP333、CaCl2和EBR處理的筆筒樹幼苗葉片的可溶性糖含量增加較緩，可能與這些物質(zhì)在干旱前期減輕了植株受損強(qiáng)度等因素有關(guān)，與前人的研究結(jié)果一致[40-41]。而本研究中5種外源物質(zhì)對筆筒樹幼苗葉片脯氨酸含量無顯著影響，可能是由于脯氨酸在蕨類植物的滲透調(diào)節(jié)過程中不起主要作用，或脯氨酸的合成和降解只與筆筒樹水分狀況有關(guān)。

4 結(jié) 論

干旱脅迫限制了筆筒樹幼苗的正常生長。外施SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下幼苗生長的緩解作用是多個生理活動相互作用的結(jié)果，本研究對13個相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性和隸屬函數(shù)分析，根據(jù)綜合得分位次得出，SA對干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長的緩解效果最好，其后依次為MT、EBR、Ca和PP333。這些外源物質(zhì)可以減緩筆筒樹幼苗光合系統(tǒng)遭受的破壞，維持幼苗正常生長；通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，減輕膜脂過氧化損傷，降低MDA含量和相對電導(dǎo)率，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在一定程度上提高了筆筒樹的抗旱能力。

劉鑫是本研究的實驗設(shè)計者和實驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；于靜，鄭鈉元協(xié)助實驗進(jìn)行；付麗娟，劉保東參與實驗設(shè)計；丁國華是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。