胡國君，張尊平，范旭東，任 芳，翟秀麗，時曉燕，董雅鳳

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城125100）（2 赤峰市森林草原保護發(fā)展中心）

我國是世界上最大的鮮食葡萄生產(chǎn)國和消費國，葡萄因其色豐、味美而深受消費者的喜愛。病毒病害在葡萄上時有發(fā)生，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、精細(xì)化管理的推進(jìn)，病毒病越來越受到種植者的關(guān)注。葡萄主要通過枝條嫁接等無性方式進(jìn)行繁殖，導(dǎo)致葡萄植株攜帶的病毒廣泛傳播，嚴(yán)重制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1-2]。皺木復(fù)合病是一種重要的葡萄病毒病害，在世界各葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，一般可產(chǎn)生4 種癥狀類型：在Kober 上產(chǎn)生莖溝和栓皮化，在LN33 上產(chǎn)生莖溝，以及在沙地葡萄上產(chǎn)生莖痘。感病后，葡萄產(chǎn)量減少14%～70%，嫁接成活率降低40%，生長量減少30%，危害重大[3-4]。已有研究表明，沙地葡萄莖痘伴隨病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）與沙地葡萄上的莖痘產(chǎn)生有關(guān)[5-7]。

GRSPaV 是分布最廣的葡萄病毒，除了可以引起沙地葡萄莖痘外，還可引起霞多麗、品麗珠、Baco Blanc 和雜交LN33 等葡萄品種或砧木的葉脈壞死，此外，還與西拉葡萄衰退病有關(guān)，主要表現(xiàn)為嫁接口結(jié)合處膨脹，開裂和溝槽，有時在秋天還與葡萄葉片變紅有關(guān)[8]，給葡萄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響，亟待加強對該病毒的防控。GRSPaV 隸屬于β線性病毒科（Betaflexiviridae）凹陷病毒屬（Foveavirus），基因組全長約8.7 bp，3′末端含聚合A 尾，含有5 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。其中，ORF1 推測編碼復(fù)制酶蛋白，ORF2～4 編碼三基因框，具有運動蛋白活性，ORF5 編碼病毒的外殼蛋白[9]。該病毒為韌皮部限制性病毒，主要通過嫁接傳播[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，GRSPaV 的基因組具有廣泛的遺傳多樣性，存在大量的分子變種[9]。不僅在不同的葡萄品種中，甚至在同一株葡萄的不同部位也可能存在不同的分子變種。據(jù)報道，1 株葡萄中可能含有4 個GRSPaV 分子變種，其中接穗中含有2～4個，砧木上有1 個[12]。高效靈敏的檢測技術(shù)不僅可以及時、有效地對病毒病的發(fā)生進(jìn)行監(jiān)測，同時作為精準(zhǔn)鑒定苗木是否攜帶病毒的重要手段對于葡萄病毒病的防控具有重要意義。然而，大量分子變種的存在給GRSPaV 的檢測效率造成嚴(yán)重影響，尤其對脫毒種苗的鑒定。為了提高檢測的準(zhǔn)確性，在葡萄病毒檢測和脫毒種苗鑒定中經(jīng)常針對一種病毒選用2 對以上的檢測引物或檢測反應(yīng)[13-14]。這樣檢測效率得到了保障，但同時檢測成本等也相應(yīng)提高。因此，建立準(zhǔn)確、高效、低成本的GRSPaV 檢測技術(shù)體系需求迫切。本研究在GRSPaV 的2 個基因上同時進(jìn)行巢式擴增，通過體系優(yōu)化，建立雙重巢式RT-PCR 檢測方法，以期在保證GRSPaV 檢測效率的基礎(chǔ)上，降低檢測成本，為該病毒病的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感染GRSPaV 的葡萄樣品京秀、達(dá)米娜、里扎馬特和87-1 以及陰性對照無病毒貝達(dá)砧木均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心的保存圃。供檢樣品為實驗室保存的84 份葡萄樣品的試管苗和25 份田間葡萄樣品。

1.2 試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α等，購自寶生物工程（大連）有限公司；莫洛尼鼠白血病病毒（maloney-Murine leukemia virus，M-MLV），購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；膠回收純化試劑盒，購自愛思進(jìn)公司（Axygen）；pTOPO-TA Vector 載體，購自北京艾德萊生物科技有限公司；gel red 核酸染料，購自Biotium 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計

參照NCBI 上的GRSPaV 全基因組序列（105條），設(shè)計了2 組巢式擴增引物：repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2（表1）。

表1 GRSPaV 的PCR 擴增用引物

1.4 擴增片段的克隆轉(zhuǎn)化和測序分析

將引物組合repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 的擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化，連接到載體pTOPO-TA Vector 上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑選單一的菌落進(jìn)行搖菌，并進(jìn)行菌液PCR 驗證，最后挑選陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。

1.5 總RNA 提取

1.6 cDNA 合成

取上述總RNA 3 μL、6 堿基隨機引物1 μL、DEPC 處理去離子水6 μL 于一離心管中，混勻后在沸水中變性6 min，然后放冰上3 min。向上述溶液中依次加入：5×RT buffer 2 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，用水補足總體系為20 μL。將上述溶液混勻后42 ℃10 min，37 ℃50 min，70 ℃滅活5 min，冰上3 min，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 普通PCR 擴增

取上述cDNA 模板2 μL 加到如下PCR 擴增體系中：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL，RSP 52/53（或RSP 9F/9R）（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，最后加水定容至25 μL。

引物RSP 52/53 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

引物RSP 9F/9R 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴增結(jié)束后，取6 μL PCR 產(chǎn)物和1 μL 6×Loading buffer（含gel red 染料）在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，在BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)中，觀察擴增結(jié)果。

1.8 單一巢式PCR 擴增

第1 輪PCR 擴增體系：取合成的cDNA 2 μL，依次加入10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL、引物repF1/R1 或cpF1/R1（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加水定容至25 μL。

引物repF1/R1 擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

引物cpF1/R1 擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

觀察組：在對照組的治療基礎(chǔ)上同時給予患者雙黃連口服液（生產(chǎn)單位：河南天地藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z41021468；規(guī)格：每支裝10 mL），同樣以棉簽蘸取雙黃連口服液，于潰瘍處及其周圍進(jìn)行涂抹，每日3次，鹽酸雷尼替丁膠囊用于雙黃連口服液之后，用法與對照組相同，均連續(xù)服用2周。

第2 輪PCR 擴增體系：以第1 輪PCR 擴增的產(chǎn)物為模板，用量為1 μL，依次加入10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL、引物repF2/R2 或cpF2/R2（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加水定容至25 μL。

引物repF2/R2 擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

引物cpF2/R2 擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

第2 輪擴增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 雙重巢式PCR 擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化

第1輪PCR體系：cDNA、10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs、引物組合repF1/R1-cpF1/R1（10 μmol/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），定容至25 μL。其中，引物組合repF1/R1-cpF1/R1 設(shè)置0.2/0.2-0.6/0.6、0.4/0.4-0.4/0.4、0.6/0.6-0.2/0.2 μL 3 個用量，dNTPs 設(shè)置1.0、0.7、0.4 μL 3 個用量，Taq DNA 聚合酶設(shè)置0.25、0.15、0.05 μL 3 個用量，cDNA 設(shè)置4.0、3.0、2.0 μL 3 個用量。

引物組合repF1/R1-cpF1/R1 擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

第2 輪PCR 體系：以第1 輪PCR 擴增產(chǎn)物為模板，用量為1 μL，其余成分為10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs、引物組合repF2/R2-cpF2/R2（10 μmol/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），定容至25 μL。其中引物組合repF2/R2-cpF2/R2 設(shè)置0.3/0.3-0.3/0.3、0.2/0.2-0.4/0.4、0.4/0.4-0.2/0.2 μL 3個用量，dNTPs 設(shè)置1.0、0.75、0.5 μL 3 個用量，Taq DNA 聚合酶設(shè)置0.25、0.15、0.05 μL 3 個用量。

引物組合repF2/R2-cpF2/R2 擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

第2 輪擴增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 檢測效果比較

利用普通RT-PCR、單一巢式RT-PCR 和雙重巢式RT-PCR 分別對84 份葡萄試管苗進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的驗證

由圖1 可知，所設(shè)計的2 組巢式引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2均能在陽性樣品中擴增出單一且與預(yù)期片段大小一致的條帶，而陰性對照中沒有擴增條帶。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化及測序分析，并將獲得的病毒序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對。結(jié)果顯示，巢式引物repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 分別特異性地擴增GRSPaV 復(fù)制酶和外殼蛋白基因序列，片段的大小分別為902 bp 和438 bp。

圖1 2 組巢式引物的PCR 擴增結(jié)果

2.2 雙重巢式PCR 擴增中第1 輪PCR 體系的優(yōu)化

分別對引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和cDNA的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，引物組合repF1/R1-cpF1/R1 的用量（10 μmol/L）為0.4/0.4-0.4/0.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 的用量為0.7 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶的用量為0.05 μL、cDNA 的用量為2 μL 時（表2），第2 輪擴增效果最佳。

2.3 雙重巢式PCR 擴增中第2 輪PCR 體系的優(yōu)化

分別對引物、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，引物組合repF2/R2-cpF2/R2的用量（10 μmol/L）為0.3/0.3-0.3/0.3 μL（圖2）、2.5 mmol/L dNTPs 的用量為1.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶的用量為0.25 μL 時（表2），擴增產(chǎn)物無雜帶干擾，瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)2 條清晰的條帶，且2條帶的亮度一致。

表2 GRSPaV 的雙重巢式PCR 擴增體系

圖2 雙重巢式PCR 擴增中引物組合用量的優(yōu)化

2.4 檢測效果比較

分別采用普通、單一巢式和雙重巢式RT-PCR對葡萄試管苗樣品進(jìn)行病毒檢測，結(jié)果顯示，2 對普通引物RSP 52/53 和RSP 9F/9R 對GRSPaV 的檢出率均為51.4%，合計為65.1%；2 對巢式引物rep F1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 對GRSPaV的檢出率分別為88.1%和80.7%，總和為93.6%；而雙重巢式引物組合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2 對GRSPaV 的檢出率與2 個單一巢式RTPCR 的檢測率總和一致，較2 個普通RT-PCR 的總和提高28.5 個百分點（表3）。

表3 不同方法的GRSPaV 檢測效果

3 結(jié)論與討論

本研究利用GRSPaV 的2 組單一巢式擴增引物repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2，通過對兩輪PCR 擴增體系的優(yōu)化，建立了GRSPaV 雙重巢式RT-PCR 檢測技術(shù)體系，其檢出率與2 個片段單一巢式PCR 的檢出率總和相同，有效保證了檢測的準(zhǔn)確性。

以核酸檢測為基礎(chǔ)的RT-PCR 和巢式PCR 方法，具有簡單、易操作、敏感性高、特異性強、結(jié)果直觀等優(yōu)點，已成為病原檢測的重要手段，在果樹病毒的檢測中被廣泛應(yīng)用[7,13-14,17]。尤其是巢式RTPCR 技術(shù)，可顯著提高果樹病毒的檢測效率，有效避免非目的片段的擴增[18-20]。然而，對于GRSPaV等一些序列變異較大的病毒，仍然存在假陰性的風(fēng)險，需要通過增加檢測頻率或采用不同檢測引物的方法來提高檢測的準(zhǔn)確度[13-14]。

針對GRSPaV 的2 個基因片段同時進(jìn)行檢測，一般單一巢式PCR 需要進(jìn)行4 個PCR 反應(yīng)，而本研究通過2 個PCR 反應(yīng)便完成了巢式擴增，不僅減少了2 個PCR 反應(yīng)及對應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳，試劑用量也相應(yīng)減少，該檢測方法實現(xiàn)了GRSPaV 檢測的節(jié)本、精準(zhǔn)和高效，滿足大規(guī)模樣品快速、準(zhǔn)確的檢測需要，而且操作簡單，適用于田間樣品的病毒種類鑒定，以及無病毒葡萄種苗生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)的病毒鑒定等。