陳勵坤，徐葉挺，王永鵬，何臨梓，曾 斌，艾沙江·買買提

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學園藝學院，烏魯木齊830000）（2 新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所）

梨火疫病是由淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的細菌性病害，對薔薇科果樹具有毀滅性的危害[1]，梨火疫病菌侵入寄主后對其造成永久性的結(jié)構(gòu)破壞，最終致其死亡。該病傳播能力極強，美國、荷蘭、德國等世界多地的林果產(chǎn)業(yè)都曾受其嚴重危害[2-3]。2016 年梨火疫病入侵我國新疆地區(qū)[4]，破壞原有生態(tài)，嚴重阻礙了林果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，抗病種質(zhì)資源篩選培育的問題亟待解決。

藥物施用與果樹修剪可作為緊急方案短期內(nèi)應對梨火疫病的侵害[5-6]，抗病品種篩選培育是當前最有效的長期防治手段。前人對梨和蘋果抗火疫病品種鑒定已進行大量研究，先后從野生資源中鑒定出了Solanka、Prairie Gem、Chancleer 等表現(xiàn)為高抗的梨品種[7-9]，野生資源與馴化品種多代雜交培育出了高抗的CG 系列蘋果砧木[10]。Paprstein 等[11]對試管幼苗采用剪切接菌法，發(fā)現(xiàn)感病品種幼苗會產(chǎn)生病斑，滲出白色菌膿。Piotr 等[12]采用葉片浸泡法，成功鑒定出了Malus J-2003-05、Malus Early Szampion 2 個高抗品種。李洪濤等[13]采用枝條針刺接菌的方法，比較了不同菌株致病力的差異。前人研究表明，花朵、幼苗噴施接菌法同樣可用于抗性鑒定[14]。

新疆梨是我國5 個主栽梨系統(tǒng)之一[15]，由西洋梨與東方梨雜交而來[16]?？够鹨卟』虻倪z傳和積累對后代的抗性水平有顯著影響[17]。本研究通過對31 個新疆梨品種的嫩葉、嫩枝接種梨火疫病菌，置于適宜環(huán)境中離體培養(yǎng)，對其感病性觀察記錄，分析品種間的抗性差異，初步探討供試品種對火疫病的抗性及新疆梨系統(tǒng)整體抗性水平，為后續(xù)抗病梨種質(zhì)資源的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗接種所用的梨火疫病菌（E.amylovora）由南京農(nóng)業(yè)大學胡白石教授惠贈，菌株分離于新疆庫爾勒沙依東園藝場，寄主為庫爾勒香梨。供試的31 個梨品種均屬于新疆梨系統(tǒng)（表1），供試材料來源于新疆農(nóng)業(yè)科學院輪臺果樹資源圃，選擇樹體健康、長勢良好的梨樹采集所需嫩葉、嫩枝。

表1 供試新疆梨品種

新疆梨接種火疫病菌的發(fā)病情況Incidence of Pyrus sinkiangensis Yu inoculated with Erwinia amylovora

1.2 試驗處理與方法

1.2.1 火疫病菌的培養(yǎng)

采用平板劃線法將病菌接種至NA 培養(yǎng)基，密封之后置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落接種于NB 培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫搖床中150 r/min 培擴繁24 h，肉眼觀察為純白色，OD600＝0.4 為標準接種菌液。

1.2.2 嫩葉接菌

采集完全展開的幼嫩健康葉片，置于保鮮箱中備用；純水清洗葉片后，用紫外線殺菌20 min，將多余葉柄剪去保留0.5 cm 左右，在超凈工作臺中用微量注射器吸取2 μL 菌液從葉片背面刺入主葉脈；將濕潤的無菌濾紙置于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌牙簽搭三角架，葉片背面朝上置于牙簽三角架上，防止葉片沾水褐化，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個品種接種3 片葉，每隔24 h 觀察1 次葉片發(fā)病情況，并記錄各時間段葉片主葉脈的病變長度，共觀察記錄96 h。

對供試31 個梨品種葉片各時間段主葉脈平均病變長度進行聚類分析，評價其抗性。

1.2.3 嫩枝接菌

選取健康的當年生嫩枝，采集后枝條下端用濕潤紗布包裹備用；純水清洗枝條后，用紫外線殺菌20 min；在完全展開的第2 片葉基部的主莖上，用微量注射器斜向下刺孔，將2 μL 菌液滴入嫩梢中；將枝條置于室內(nèi)培養(yǎng)，下端放入水中培養(yǎng)，每個品種接種3 根枝條，每隔24 h 觀察記錄枝條的病變長度，共觀察記錄96 h。

根據(jù)李洪濤等[13]制定的火疫病接種離體枝條病情分級，將枝條病變長度與枝條總長之比作為病級代表值：0 級，枝條無病變現(xiàn)象；1 級，病變長度占接種枝條長度的1%～5%；3 級，病變長度占接種枝條長度的6%～15%；5 級，病變長度占接種枝條長度的16%～30%；7 級，病變長度占接種枝條長度的31%～50%；9 級，病變長度占接種枝條長度的50%以上。

病情指數(shù)＝［∑（各級發(fā)病枝條數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總枝條數(shù)×最高級代表值）］×100

根據(jù)相同時間內(nèi)的病情指數(shù)，將供試品種離體枝條抗病能力分為4 個等級，高抗（HR）：病情指數(shù)為1～15；中抗（MR）：病情指數(shù)為16～35；中感（MS）：病情指數(shù)為36～69；高感（HS）：病情指數(shù)≥70。

1.2.4 幼果接菌

采集幼果后保存于10 ℃左右的環(huán)境中，盡量保證果皮蠟質(zhì)層不被破壞；將果實整體浸入75%酒精溶液中2 min 左右，進行表面消毒，用無菌濾紙吸干表面殘留的酒精后，將果實縱剖為兩半，在果實每一個剖面靠近果核周圍選擇6 個接菌點，用微量注射器每個接菌點注入2 μL 菌液。接菌后將果實放在鋪有濕潤無菌紗布的瓷盤中，并用保鮮膜覆蓋，置于28 ℃左右恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h 觀察1 次果實剖面變化，共觀察記錄96 h。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2010 整理試驗數(shù)據(jù)，用SPSS 26 軟件進行差異顯著性分析檢驗及聚類分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片病變分析

2.1.1 葉片發(fā)病進程

由圖版2-A 可以看出，梨葉片被火疫病菌侵染后，主葉脈發(fā)生病變褐化，病變長度隨時間逐漸增加。從表2 可以看出，供試的31 個梨品種接菌后24、48、72、96 h 主葉脈平均病變長度分別為0.57、1.24、2.12、2.92 cm，相鄰2 個時間點病變長度差分別為0.57、0.67、0.88、0.80 cm。經(jīng)方差分析，4個時間段的主葉脈平均病變長度差異顯著。從整體可以看出，梨葉片接種梨火疫病菌后48～72 h 主葉脈病變最快。

表2 供試梨品種嫩葉對火疫病抗性測定結(jié)果

續(xù)表2

供試梨品種葉片接菌24 h 后，主葉脈平均病變長度為0.57 cm，其中棉梨最短（0.24 cm），沙03最長（0.91 cm），二者差異顯著；接菌后48 h，主葉脈平均病變長度為1.24 cm，其中棉梨最短（0.80 cm），沙02 最長（2.04 cm），二者差異顯著；接菌后72 h，主葉脈平均病變長度為2.12 cm，其中綠梨最短（1.33 cm），沙02 最長（3.57 cm），二者差異顯著；接菌后96 h，主葉脈平均病變長度為2.92 cm，其中綠梨最短（1.82 cm），庫爾勒香梨最長（4.65 cm），二者差異顯著（表2）。

最終結(jié)果表明，葉片接菌96 h 后發(fā)病最輕的是綠梨，發(fā)病最嚴重的是庫爾勒香梨。綠梨在接菌后24、48、72、96 h 主葉脈病變長度分別為0.36、0.86、1.33、1.82 cm，相鄰2 個時間點主葉脈病變長度差分別為0.36、0.50、0.47、0.49 cm，可見接菌后0～24 h 病變最慢，24～48 h 病變最快，各時間段病變速度平穩(wěn)相近。庫爾勒香梨在接菌后24、48、72、96 h 主葉脈病變長度分別為0.71、1.55、3.52、4.65 cm，相鄰2 個時間點主葉脈病變長度差分別為0.71、0.84、1.97、1.13 cm，接菌后0～24 h 病變最慢，48～72 h 病變最快，各時間點病變增速差異明顯。接菌后4 個時間點庫爾勒香梨主葉脈病變長度分別是綠梨的1.97、1.80、2.65、2.55 倍（表2）。

2.1.2 葉片抗病等級分析

對供試31 個梨品種各時間點主葉脈病變長度進行歐氏距離聚平均法連鎖聚類分析，如圖1 所示，當連鎖距離為3 時，被分為4 個類群。也歷克阿木特、棉梨、霍城冬黃梨等16 個品種聚為A 類，主葉脈綜合平均病變長度為1.31 cm，為高抗品種；酸秤砣、庫爾勒黃酸梨、綠梨等7 個品種聚為B 類，主葉脈綜合平均病變長度為1.72 cm，為中抗品種；伊犁紅句句梨、黑酸梨和沙01 聚為D 類，主葉脈綜合平均病變長度為2.26 cm，為中感品種；庫爾勒香梨、奎克阿木特、株選1 號等5 個品種聚為C 類，主葉脈綜合平均病變長度為2.68 cm，為高感品種（圖1）。

圖1 供試梨品種葉片發(fā)病情況聚類分析樹狀圖

2.2 枝條病變分析

2.2.1 嫩枝發(fā)病進程

梨嫩枝被火疫病菌侵染后發(fā)生病變，表現(xiàn)為由接菌點逐步向下褐化變黑（圖版2-B）。如表3 所示，供試梨品種接菌后24、48、72、96 h 嫩枝平均病變長度分別為1.12、2.73、4.88、8.75 cm，相鄰2個時間點嫩枝病變長度差分別為1.12、1.61、2.15、3.87 cm。經(jīng)方差分析，4 個時間點之間嫩枝平均病變長度差異顯著。從整體可看出，嫩枝接菌后72～ 96 h 病變最快。

表3 供試梨品種嫩枝對火疫病抗性測定結(jié)果

如表3 所示，接種火疫病菌后供試31 個梨品種的嫩枝在各時間點的發(fā)病程度差異明顯。接菌后24 h，嫩枝平均病變長度為1.12 cm，其中綠梨嫩枝無病變，沙01 最長（2.39 cm）；接菌后48 h，嫩枝平均病變長度為2.73 cm，其中綠梨最短（0.40 cm），株選1 號最長（5.26 cm），二者差異顯著；接菌后72 h，嫩枝平均病變長度為4.88 cm，其中綠梨最短（0.63 cm），褐色句句梨最長（12.23 cm），二者差異顯著；接菌后96 h，嫩枝平均病變長度為8.75 cm，其中綠梨最短（1.03 cm），褐色句句梨最長（22.49 cm），二者差異顯著。

由表3 可以看出，嫩枝接菌96 h 后發(fā)病最輕的是綠梨，最嚴重的是褐色句句梨。綠梨在接菌后24、48、72、96 h 嫩枝病變長度分別為0、0.40、0.63、1.03 cm，相鄰2 個時間點嫩枝病變長度差分別為0、0.40、0.23、0.40 cm，可見接菌后0～24 h 病變最慢，24～48 h 與72～96 h 2 個時間段病變最快，整體病變幅度較小，趨勢平緩。褐色句句梨在接菌后24、48、72、96 h 病變長度分別為1.58、4.82、12.23、22.49 cm，相鄰2 個時間點嫩枝病變長度差分別為1.58、3.24、7.41、10.26 cm，可見接菌后0～24 h病變最慢，72～96 h 病變最快，各時間點嫩枝病變增長速度有較大差別。接菌后在48、72、96 h 褐色句句梨的嫩枝病變長度分別是綠梨的12.05、19.41、21.83 倍。

2.2.2 枝條抗病等級分析

對接菌后24、48、72、96 h 嫩枝發(fā)病情況進行統(tǒng)計分析，各品種的綜合病情指數(shù)及抗性等級如表4 所示，綜合病情指數(shù)最低的是綠梨，為30.56，最高的是句句梨，達72.22。棉梨、也歷克阿木特和綠梨3 個梨品種表現(xiàn)為中抗，句句梨表現(xiàn)為高感，其他27 個梨品種均表現(xiàn)為中感。

表4 供試梨品種病情指數(shù)和抗性等級

2.3 果實病變

梨幼果剖面接菌后，抗病品種幼果剖面始終無明顯變化，只存在少量白色小菌膿；感病品種接菌后24 h 之內(nèi)，接菌點開始滲出白色菌膿，后形成大片菌膿并逐漸變黃發(fā)褐，果實也隨之出現(xiàn)皺縮甚至開裂的現(xiàn)象。如圖版2-C 所示，棉梨、也歷克阿木特和句句梨3 個梨品種幼果接菌后72 h 的剖面表現(xiàn)，可明顯看出抗病品種棉梨和也歷克阿木特果實剖面只有極少量白色菌膿；感病品種句句梨果實剖面被大片菌膿覆蓋，同時幼果逐漸褐化、皺縮。

3 討論與結(jié)論

抗病資源的鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)[18]，室內(nèi)接菌是最為常用的品種抗病水平鑒定手段。前人所用的接菌方法及指標也各有不同，花朵噴施菌液、剪切接菌、浸泡接菌、果柄注射接菌等[11,19]，花朵被病菌侵染后其發(fā)病程度難以量化，難適用于多品種抗性水平的鑒定中?？剐詸z測中菌液的量可能會影響發(fā)病進程，前人研究中少有對菌液定量的案例，本試驗中采用微量注射器定量注射菌液，以“接菌口有菌液珠但不溢出”為準，經(jīng)多次預試驗確定嫩葉、嫩枝、幼果的接菌量，進一步準確鑒定品種的抗病水平。

本研究結(jié)果表明，棉梨和也歷克阿木特在葉片鑒定中表現(xiàn)為高抗，在枝條鑒定中表現(xiàn)為中抗，與其他品種相比抗性較強；綠梨抗性次之，其在葉片和枝條鑒定中均表現(xiàn)為中抗。據(jù)前人研究植株受脅迫后體內(nèi)SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量會提高[20-23]，后續(xù)研究可測定接菌后棉梨、也歷克阿木特和綠梨植株內(nèi)上述物質(zhì)含量，進一步驗證抗病水平。供試的31 個新疆梨品種對于梨火疫病抗性表現(xiàn)具有顯著性差異，整體抗病水平偏低。前人研究表明，火疫病抗性受基因控制[24]，抗病性由雙親遺傳給下一代，新疆梨系統(tǒng)是由西洋梨和東方梨雜交而來，西洋梨對火疫病表現(xiàn)為易感[25]，新疆梨可能受西洋梨的遺傳影響，整體上表現(xiàn)為感病。

本研究中，棉梨、也歷克阿木特和綠梨對梨火疫病的抗性綜合表現(xiàn)較好，其中綠梨的單花藥花粉量多、花粉活力強且萌發(fā)率高[26]，果實硬度小，種子多，是優(yōu)良的育種材料。將高抗基因遺傳積累是雜交育種培育抗病材料的整體思路[27]。Evrenoso?lu等[28]研究表明，梨火疫病抗性為多基因遺傳，母本遺傳效應高于父本，但植株抗火疫病的表型在很大程度上受到環(huán)境變化的影響，因此在后續(xù)雜交培育抗病材料的方案中需因地制宜。綜上，棉梨、也歷克阿木特和綠梨可作為后續(xù)抗梨火疫病育種研究的材料。