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        甘草酸對(duì)大鼠急性肺水腫的影響*

        2022-08-31 07:11:46雷艷麗張俊黎偉華楊麗
        關(guān)鍵詞:肺水腫功能模型

        雷艷麗,張俊,黎偉華,楊麗

        (寧夏醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,寧夏 銀川 750004)

        急性肺損傷由膿毒癥、肺炎、急性胰腺炎及外傷等造成[1-2]。其伴有急性炎癥、微血管損傷,增加肺血管和上皮細(xì)胞通透性,引起呼吸衰竭,可能發(fā)展為致命性急性呼吸窘迫綜合征[3]。甘草作為經(jīng)典的呼吸疾病治療中藥,具有鎮(zhèn)咳祛痰、治療咳嗽、支氣管炎等作用。甘草酸又名甘草甜素,是甘草的甜味成分亦是含量最高的苷類化合物[4],主要用于抗肝炎病毒、抗艾滋病毒、抗癌、防癌、增強(qiáng)免疫力等領(lǐng)域[5-6]。有關(guān)研究表明,甘草酸保護(hù)急性肺損傷的主要機(jī)制是通過其類激素樣抗炎作用[7],關(guān)于甘草酸對(duì)呼吸參數(shù)的影響尚未見到文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過氯化胺誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型,觀察模型大鼠肺功能指標(biāo)的變化,探討甘草酸對(duì)大鼠急性肺水腫的影響。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        DSI Buxco PFT 肺功能檢測(cè)儀(美國(guó)DSI 公司),ABS210S 電子天平(德國(guó)Sartorius 公司),ASP200S 全自動(dòng)密閉組織脫水機(jī)、HistoCore Arcadia組織包埋機(jī)、RM2245 半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司),Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。甘草酸原料藥(批號(hào)JZ20131026,純度90%,南京景竹生物科技有限公司),氯化銨(批號(hào)20170806,上海光諾化學(xué)科技有限公司),0.9%氯化鈉注射液(山東科倫藥業(yè)有限公司),4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技術(shù)有限公司),實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

        1.2 動(dòng)物

        SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,18 只,6~8 周齡,體重180~220 g,購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(寧)2020-0001,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(寧)2020-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18~22℃,濕度40%~70%,保持自然晝夜節(jié)律光照(12 h/12 h),大鼠自由攝食飲水。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組與藥物處理將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、甘草酸預(yù)防組[8-9]。甘草酸組灌胃100 mg/kg 的甘草酸7 d,對(duì)照組和模型組口服灌胃等體積水。模型組和甘草酸組大鼠第8 天腹腔注射6%氯化胺(100 g/0.6 mL),復(fù)制急性肺水腫模型;對(duì)照組注射等體積生理鹽水。注射30 min 后,觀察各組大鼠的狀態(tài)、行為。

        1.3.2 大鼠肺功能檢測(cè)待行為學(xué)觀察結(jié)束后,大鼠腹腔注射10%烏拉坦,麻醉后切開頸部皮膚,鈍性分離暴露氣管,氣管T 字開口并插管,采用手術(shù)縫合線結(jié)扎開口(保證密閉性),將大鼠放入肺功能儀自帶密閉腔體中,氣管插管與氣路連接,通過DSI Buxco PFT 肺功能檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠肺功能指標(biāo),包括一般指標(biāo)[10-11]:肺功能殘氣量(FRC)、最大變化壓力(DPmax)、最大變化體積(DVmax)、阻塞時(shí)間(Tocclude);肺內(nèi)壓力-容積:靜態(tài)肺順應(yīng)性(Cchord)、深吸氣量(IC)、肺活量(VC);肺內(nèi)呼氣流速-容積:最大呼氣流速(PEF)、用力肺活量(FVC)、用力呼吸殘氣量(FERV)和20 毫秒用力呼氣容積(FEV0.02)和100 毫秒用力呼氣容積(FEV0.1)。

        1.3.3 動(dòng)物取材打開大鼠胸腔,完整剪取肺組織,用預(yù)冷生理鹽水沖洗,使用濾紙吸干、拍照。再將肺組織分為左、右葉。右葉肺組織用4%多聚甲醛固定,蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色,左肺組織上葉用電子天平稱濕重后置于玻璃皿中測(cè)定肺含水量,左肺組織下葉于-80℃冰箱冷凍保存,用于其他指標(biāo)的檢測(cè)[12-13]。

        1.3.5 肺損傷及其肺水腫評(píng)估根據(jù)SD 大鼠肺葉組織的濕重/干重(W/D)評(píng)估肺水腫程度[14]。①濕重測(cè)量:取出處死大鼠右肺下葉組織,使用無菌紗布吸取表面組織液體,天平測(cè)量其濕重;②干重測(cè)量:將處理后的肺葉組織放入80℃恒溫烤箱烘烤48 h,待其衡重后稱重。肺組織含水率(%)=(肺組織濕重-肺組織干重)/肺組織濕重×100%。

        1.3.6 肺組織病理學(xué)觀察取右葉肺組織,用4%多聚甲醛溶液固定,固定組織應(yīng)充分展開,切勿擠壓和冷凍,室溫固定3 d后,切取肺組織塊2~4 mm,常規(guī)脫水,石蠟包埋、切片、HE 染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺泡間隔病變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管瘀血狀況等組織病理學(xué)變化[12-13]。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠肺功能一般指標(biāo)比較

        各組大鼠FRC、DPmax、DVmax比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組低于正常組和甘草酸組。各組大鼠Tocclude 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 各組大鼠肺功能一般指標(biāo)比較 (n=6,±s)

        表1 各組大鼠肺功能一般指標(biāo)比較 (n=6,±s)

        組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值FRC/mL 8.993±0.152 6.619±0.854 9.304±0.411 31.991 0.000 DPmax/cmH2O 34.013±1.119 18.729±1.586 19.967±0.844 167.552 0.000 DVmax/mL 0.340±0.009 0.128±0.041 0.202±0.012 59.501 0.000 Tocclude/s 5.533±0.173 6.608±0.193 5.977±0.724 1.255 0.320

        2.2 各組大鼠肺內(nèi)壓力-容積比較

        各組大鼠肺Cchord、IC、VC 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組低于正常組、甘草酸組。見表2。

        表2 各組大鼠肺內(nèi)壓力-容積比較 (n=6,±s)

        表2 各組大鼠肺內(nèi)壓力-容積比較 (n=6,±s)

        組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值Cchord/(mL/cmH2O)1.443±0.039 0.737±0.253 0.964±0.014 18.404 0.000 IC/mL 18.961±0.491 11.813±1.425 12.896±0.096 60.780 0.000 VC/mL 21.730±0.397 13.242±1.835 15.650±0.080 50.522 0.000

        2.3 各組大鼠肺內(nèi)呼氣流速-容積比較

        各組大鼠PEF、FVC、FERV、FEV0.1比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組PEF、FERV、FEV0.1高于正常組,但低于甘草酸組,模型組FVC低于正常組、甘草酸組。各組大鼠FEV0.02比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

        表3 各組大鼠肺內(nèi)呼氣流速-容積比較 (n=6,±s)

        表3 各組大鼠肺內(nèi)呼氣流速-容積比較 (n=6,±s)

        組別正常組模型組甘草酸組F 值P 值PEF/(mL/s)81.349±2.769 100.833±7.358 118.473±1.490 57.679 0.000 FVC/mL 19.699±0.260 12.310±1.801 14.748±0.035 40.049 0.000 FERV/mL 0.228±0.095 0.649±0.343 1.912±0.102 67.949 0.000 FEV0.02/mL 0.574±0.384 0.766±0.373 1.014±0.022 2.564 0.118 FEV0.1/mL 6.790±0.684 8.350±1.258 10.157±0.081 16.449 0.000

        2.4 各組大鼠肺組織變化

        正常組大鼠呼吸均勻,無異常現(xiàn)象,解剖無異常。模型組注射6%氯化銨后,大鼠口角流出血色泡沫,解剖發(fā)現(xiàn)呼吸道內(nèi)充滿泡沫液體,說明血漿透過肺血管進(jìn)入呼吸道。模型組肺組織外形腫大,中間有淤血,部分肺組織邊緣還有明顯的損傷或壞死。甘草酸組大鼠口角未見太多泡沫,活動(dòng)正常,解剖發(fā)現(xiàn)肺組織水腫程度明顯降低,出血點(diǎn)顯著減少或消失,且未見模型組中所觀察到的肺損傷或壞死現(xiàn)象。見圖1。

        圖1 各組大鼠肺組織變化

        2.5 各組大鼠W/D比較

        正常組、模型組、甘草酸組大鼠肺組織含水率分別為(4.56±1.57)%、(7.83±0.86)%、(5.24±0.66)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.796,P=0.004),模型組高于正常組、甘草酸組。

        2.6 各組大鼠肺組織的病理切片

        正常組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)完整、紋理清晰、肺泡腔完全無水腫,無特殊的改變。模型組大鼠肺中出現(xiàn)大量水腫,肺泡壁斷裂,肺泡隔顯著變大。口服甘草酸預(yù)防治療后,上述現(xiàn)象得到了改善。見圖2。

        圖2 各組大鼠肺組織病理切片 (HE染色)

        3 討論

        氯化銨會(huì)引起心動(dòng)過速,進(jìn)而使得注入左心室的血液無法充分排出,逐漸增大其舒張期末壓力,導(dǎo)致右心房壓力提高而產(chǎn)生淤血于肺靜脈中。在過往研究中,肺水腫可致動(dòng)物在呼吸過程中,產(chǎn)生難以消除的泡沫,泡沫形成速度快,嚴(yán)重影響呼吸,進(jìn)而導(dǎo)致呼吸異常甚至致死[14-15]。所以清除呼吸道內(nèi)的泡沫可減輕呼吸阻塞,改善呼吸,進(jìn)而挽救生命。肺水腫是急性肺損傷最顯著的特征[16]。肺水腫導(dǎo)致的頑固性低氧血癥對(duì)患者影響嚴(yán)重,目前尚無有效的藥物治療,僅有小潮氣量肺保護(hù)性通氣和俯臥位通氣2 種方法有明顯療效[17-19]。

        我國(guó)傳統(tǒng)中藥甘草的主要活性成分為甘草酸,其為五環(huán)三萜皂苷類。臨床上用于治療急性、慢性病毒性肝炎,可用于保肝等[20]。文獻(xiàn)報(bào)道,甘草酸對(duì)ALL 具有良好的保護(hù)作用,主要是通過降低肺水腫的致死率[5,21-23]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)甘草酸預(yù)防給藥的復(fù)制肺水腫模型大鼠肺部炎癥明顯緩解。甘草酸具有類激素樣受體的抗炎作用,文獻(xiàn)報(bào)道,糖皮質(zhì)激素改善急性肺損傷小鼠肺功能,可以延緩氣道壓力升高,增加肺容積、氣道阻力、2 秒末用力呼氣容積、最大呼氣中期流速、用力最大呼氣流速,減少最大吸氣流量、最大呼氣中期時(shí)間[24-25]。

        綜上所述,SD 大鼠給予氯化銨后,肺功能檢測(cè)儀可全面觀測(cè)到大鼠肺功能指標(biāo)的變化。甘草酸可通過改善肺通氣量,減弱肺表面的水腫程度來緩解大鼠急性肺水腫,減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

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