楊帆,鄧璐,陳睦虎
(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.急診科,2.甲狀腺外科,四川 瀘州 646000)
肺巨噬細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種,能夠吞噬外來病原體及人體衰老的細(xì)胞,同時(shí)肺巨噬細(xì)胞參與特異性免疫,刺激細(xì)胞因子的分泌[1-2]。多種肺疾病的病理特征均由炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子導(dǎo)致,在其發(fā)病過程中,肺巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為肺巨噬細(xì)胞在一些細(xì)菌或有害物質(zhì)的刺激下,分泌大量炎癥因子,部分因子又可趨化中性粒細(xì)胞等向肺部遷移,最終引起氣道炎癥或損傷,加重疾病[3]。因此,有效抑制炎癥因子的釋放對(duì)肺疾病的治療具有重要意義。自噬是調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的重要機(jī)制,能夠調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞自噬。目前有多項(xiàng)研究表明,肺損傷及炎癥反應(yīng)與肺巨噬細(xì)胞炎性小體有關(guān),因此推測(cè)肺巨噬細(xì)胞的自噬過程能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)[5-6]。二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)在肺巨噬細(xì)胞中大量表達(dá),參與細(xì)胞免疫、自噬等多種生物學(xué)過程,目前DPP-4 對(duì)趨化因子及細(xì)胞因子的調(diào)控作用已得到證實(shí)[7-8]。本研究探究DPP-4 通過CXCR4/mTOR 通路對(duì)小鼠肺巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。
小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S 購自上海酶研生物科技有限公司。取出液氮凍存的MH-S 細(xì)胞,恢復(fù)至室溫后轉(zhuǎn)移至25 mL 培養(yǎng)瓶,同時(shí)加入15 mL 含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)培養(yǎng)液,在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
1.2.1 主要試劑DPP-4 表達(dá)病毒、si-DPP-4 病毒載體(上海鈺博生物科技有限公司),白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司),轉(zhuǎn)染試劑盒(上海研卉生物科技有限公司),TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(上海一研生物科技有限公司),DPP-4、mTOR 兔抗大鼠一抗(1 mg/mL)及山羊抗兔二抗(1 mg/mL)(上海圻明生物科技有限公司),CXCR4兔抗大鼠一抗(1 mg/mL)及山羊抗兔二抗(1 mg/mL)(上??道噬锟萍加邢薰荆?。
1.2.2 主要儀器倒置熒光顯微鏡(型號(hào):Echo Revolve,北京普邁精醫(yī)科技有限公司),酶標(biāo)儀(型號(hào):LONZA ELx808,北京澤平科技有限責(zé)任公司),全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào):PUZS-300,上海帝博思生物科技有限公司)。
取對(duì)數(shù)生長期的MH-S 細(xì)胞,接種于6 孔板,每孔取1×105個(gè)細(xì)胞繼續(xù)貼壁生長,當(dāng)細(xì)胞融合75%~85%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別設(shè)置PBS 組、LPS 組、DPP-4 組,si-DPP-4 組、DPP-4 + BafA1 組及si-DPP-4+BafA1 組。
PBS 組僅為PBS 培養(yǎng)的MH-S 細(xì)胞;LPS 組在MH-S 細(xì)胞中加入100 ng/mL LPS,誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h;DPP-4 組在LPS 組的基礎(chǔ)上,加入100 nmol/L DPP-4表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染MH-S 細(xì)胞;si-DPP-4 組在LPS 組的基礎(chǔ)上,加入100 nmol/L si-DPP-4 病毒載體轉(zhuǎn)染MH-S 細(xì)胞;DPP-4 + BafA1 組 在LPS 組的基礎(chǔ)上,在DPP-4 表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染MH-S 細(xì)胞中加入自噬抑制劑BafA1 干預(yù);si-DPP-4 + BafA1 組在LPS 組的基礎(chǔ)上,在si-DPP-4 病毒載體轉(zhuǎn)染的MH-S 細(xì)胞中加入自噬抑制劑BafA1 干預(yù)。
根據(jù)細(xì)胞分組進(jìn)行操作,每孔加入1 mL 病毒稀釋液(病毒感染復(fù)數(shù)=100,DMEM 培養(yǎng)液1∶99),具體操作步驟參考轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,轉(zhuǎn)染48 h 后,采用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)轉(zhuǎn)染效率>70%時(shí),可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。
取各組MH-S 細(xì)胞培養(yǎng)液,離心取上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)MH-S 細(xì)胞IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 水平,向稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品中加入MH-S 細(xì)胞上清液50 μL,混勻后于恒溫水浴鍋中溫育0.5 h,分別加入50 μL 酶標(biāo)志物、50 μL 顯色劑A、50 μL 顯色劑B 及50 μL 終止液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm 處吸光度,根據(jù)IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其相應(yīng)濃度[10]。每組有4 個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,取均值。
取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MH-S 細(xì)胞,接種于12 孔板上,孔內(nèi)鋪放細(xì)胞爬片,加入攜帶mRFP-GFP-LC3的腺病毒,進(jìn)行貼壁生長,當(dāng)細(xì)胞融合度為70%時(shí),移除上清液,PBS 沖洗3 次,加入4%多聚甲醛固定,再?zèng)_洗3 次,加入抗熒光猝滅封片液進(jìn)行封片,于熒光顯微鏡下觀察自噬流的變化,即GFP、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其合并通道(黃色)[11]。GFP 減弱表明自噬小體與溶酶體融合,形成自噬溶酶體。
取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MH-S 細(xì)胞,采用TRIzol 試劑盒提取MH-S 細(xì)胞總RNA,檢測(cè)RNA 濃度及純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,以RNA 為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄得到cRNA。設(shè)置20 μL 的PCR 反應(yīng)體系:cDNA模板1 μL,SYBR 10 μL,正、反向引物各0.5 μL,純水8 μL;反應(yīng)體系設(shè)置完成后進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算DPP-4、CXCR4、mTOR 相對(duì)表達(dá)量[12],引物序列見表1。
表1 qRT-PCR引物序列
取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MH-S 細(xì)胞,加入適量裂解液裂解混勻,裂解MH-S 細(xì)胞,1 500 r/min 離心20 min,取上清液進(jìn)行免疫凝膠電泳,分離CXCR4、mTOR 蛋白條帶,并采用濕膜法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,將PVDF 膜分別在含有一抗(1∶500 稀釋)及二抗(1∶1 000 稀釋)的孵育盒中孵育,孵育后PBS 沖洗3 次進(jìn)行顯影、定影,分析相應(yīng)灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白/β-actin 灰度值[13]。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
正常MH-S 細(xì)胞形態(tài)均勻,呈梭形,而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞一般成簇存在,呈漩渦樣生長,經(jīng)綠色熒光蛋白標(biāo)記后,細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈綠色熒光。見圖1。
圖1 MH-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖 (左圖:×100,右圖:×200)
各組IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:LPS 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于PBS 組(P<0.05);DPP-4 組與LPS 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);si-DPP-4 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于LPS 組(P<0.05);si-DPP-4組和DPP-4 + BafA1 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于DPP-4 組(P<0.05);si-DPP-4 + BafA1 組IL-1β、IL-6高于si-DPP-4 組(P<0.05)。見表2。
表2 各組MH-S細(xì)胞上清液炎癥因子水平比較(ng/mL,±s)
表2 各組MH-S細(xì)胞上清液炎癥因子水平比較(ng/mL,±s)
注:①與PBS組比較,P<0.05;②與LPS組比較,P<0.05;③與DPP-4組比較,P<0.05;④與si-DPP-4組比較,P<0.05。
TNF-α 0.17±0.02 0.40±0.05①0.22±0.03 0.63±0.07②③0.96±0.10③0.77±0.08 66.532 0.000組別PBS組LPS組DPP-4組si-DPP-4組DPP-4+BafA1組si-DPP-4+BafA1組F 值P 值IL-1β 0.24±0.03 0.87±0.10①0.78±0.09 1.59±0.17②③1.27±0.13③1.83±0.19④36.789 0.000 IL-6 0.13±0.02 1.43±0.15①0.80±0.09 2.06±0.22②③1.18±0.13③2.81±0.30④53.456 0.000
各組MH-S 細(xì)胞GFP、RPF 及Merge 數(shù)量比 較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:LPS 組GFP、RPF 及Merge 數(shù)量高于PBS 組(P<0.05);DPP-4 組GFP、RPF 及Merge 數(shù)量高于LPS 組(P<0.05);si-DPP-4 組GFP、RPF 及Merge 數(shù)量低于LPS 組(P<0.05);si-DPP-4 組和DPP-4+BafA1 組GFP、RPF 及Merge 數(shù)量低于DPP-4組(P<0.05);si-DPP-4 + BafA1 組GFP、RPF 及Merge數(shù)量低于si-DPP-4 組(P<0.05)。見表3和圖2。
圖2 各組MH-S細(xì)胞自噬流的變化 (×400)
表3 各組MH-S細(xì)胞GFP、RPF及Merge數(shù)量比較 (個(gè)/細(xì)胞,±s)
表3 各組MH-S細(xì)胞GFP、RPF及Merge數(shù)量比較 (個(gè)/細(xì)胞,±s)
注:①與PBS組比較,P<0.05;②與LPS組比較,P<0.05;③與DPP-4組比較,P<0.05;④與si-DPP-4組比較,P<0.05。
組別PBS組LPS組DPP-4組si-DPP-4組DPP-4+BafA1組si-DPP-4+BafA1組F 值P 值Merge 104.83±10.68 171.66±17.83①199.67±20.56②97.68±9.96②③138.34±15.75③77.98±8.02④318.456 0.000 GFP 106.68±0.07 169.70±0.08①221.64±0.17②95.75±0.04②③133.58±0.17③79.45±8.17④364.897 0.000 RPF 156.97±16.86 201.55±22.64①274.75±30.54②138.73±14.47②③189.29±18.68③119.68±21.65④495.588 0.000
各組DPP-4、mTOR、CXCR4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:LPS 組CXCR4、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量高于PBS 組(P<0.05);DPP-4 組DPP-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于LPS 組(P<0.05),CXCR4、mTOR mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于LPS 組(P<0.05);si-DPP-4 組DPP-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于DPP-4 組(P<0.05),CXCR4、mTOR mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于DPP-4 組(P<0.05);DPP-4 + BafA1 組CXCR4、mTOR mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于DPP-4 組(P<0.05);si-DPP-4 + BafA1 組CXCR4、mTOR mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于si-DPP-4 組(P<0.05)。見表4。
表4 各組M H-S細(xì)胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
表4 各組M H-S細(xì)胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
注:①與PBS組比較,P<0.05;②與LPS組比較,P<0.05;③與DPP-4組比較,P<0.05;④與si-DPP-4組比較,P<0.05。
mTOR mRNA 0.83±0.09 1.26±0.13①1.02±0.10②1.58±0.16②③1.34±0.13③1.86±0.18④49.656 0.000組別PBS組LPS組DPP-4組si-DPP-4組DPP-4+BafA1組si-DPP-4+BafA1組F 值P 值DPP-4 mRNA 0.68±0.07 0.70±0.08 1.64±0.17②0.33±0.04②③1.58±0.17 0.35±0.04 132.456 0.000 CXCR4 mRNA 0.74±0.08 1.15±0.12①0.92±0.10②1.47±0.15②③1.23±0.13③1.73±0.18④73.456 0.000
各組CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:LPS 組CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于PBS 組(P<0.05);DPP-4組CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于LPS組(P<0.05);si-DPP-4 組 和DPP-4 + BafA1 組CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于DPP-4組(P<0.05);si-DPP-4 + BafA1 組CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-DPP-4 組(P<0.05)。見表5和圖3。
圖3 各組MH-S細(xì)胞CXCR4/mTOR通路蛋白的表達(dá)
表5 各組MH-S細(xì)胞CXCR4/mTOR通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
表5 各組MH-S細(xì)胞CXCR4/mTOR通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)
注:①與PBS組比較,P<0.05;②與LPS組比較,P<0.05;③與DPP-4組比較,P<0.05;④與si-DPP-4組比較,P<0.05。
p-mTOR/mTOR蛋白0.28±0.03 0.48±0.05①0.31±0.04②0.87±0.09②③0.83±0.09③0.97±0.10④104.567 0.000組別PBS組LPS組DPP-4組si-DPP-4組DPP-4+BafA1組si-DPP-4+BafA1組F 值P 值CXCR4蛋白0.23±0.04 0.62±0.07①0.47±0.05②0.79±0.09②③0.81±0.09③0.93±0.10④89.457 0.000
細(xì)胞自噬是機(jī)體重要的生物學(xué)過程,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝平衡,促進(jìn)增殖分化等,在非生理狀態(tài)下自噬作用被激活,能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[14]。肺巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)研究認(rèn)為,肺巨噬細(xì)胞的自噬作用在動(dòng)脈粥樣硬化、塵肺及癌癥等多種疾病中均有積極作用[15]。DPP-4 在肺巨噬細(xì)胞中大量表達(dá),在細(xì)胞自噬過程中具有一定作用。在鄭文彬[16]的研究中,DPP4 抑制劑(西格列汀)具有降糖作用,同時(shí)還可以通過抑制NF-κB 和JNK/AP1 通路減輕肝臟炎癥,上調(diào)AMPK/mTOR 信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞自噬作用,進(jìn)而改善肝脂肪變性,表明DPP-4 參與細(xì)胞炎癥及自噬作用的調(diào)節(jié)過程。國外有研究顯示,DPP-4 對(duì)mTOR 通路有一定的調(diào)控作用[17],因此推測(cè)DPP-4可能通過mTOR 通路介導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S自噬。CXCL12 是DPP-4 底物中的一種,而CXCR4是CXCL12 的特異性受體,在肺巨噬細(xì)胞中高表達(dá),相關(guān)研究表明,CXCR4/mTOR 信號(hào)能夠?qū)δ[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用[18]。
在馬曉娟等[19]研究中顯示,DPP-4 抑制劑能有效降低血糖并抑制血清肺巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子水平,從而發(fā)揮抗炎作用,對(duì)糖尿病合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者起到一定的保護(hù)作用。黃玉芳等[20]研究顯示,DPP-4 抑制劑能夠下調(diào)小鼠肺巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng),其作用機(jī)制與PKA/NF-κB 通路有關(guān)。上述研究均顯示,DPP-4 對(duì)小鼠肺巨噬細(xì)胞具有一定的抗炎作用。本研究中同樣對(duì)各組MH-S 細(xì)胞炎癥因子水平進(jìn)行檢測(cè),其中LPS 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 明顯高于PBS組,表明MH-S 細(xì)胞在LPS 的誘導(dǎo)下激活細(xì)胞炎癥反應(yīng),釋放大量炎癥因子,分析其原因?yàn)長PS 是內(nèi)毒素的主要成分,能夠與細(xì)胞中多種受體結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與LPS 組比較,DPP-4 組炎癥因子水平呈下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而si-DPP-4 組炎癥因子水平升高,說明DPP-4 對(duì)細(xì)胞炎癥水平具有一定的抑制作用,但抑制作用較弱,導(dǎo)致各組炎癥因子變化不明顯,而抑制DPP-4 表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與DPP-4 組比較,si-DPP-4 組和DPP-4 + BafA1 組IL-1β、IL-6 及TNF-α 升高,提示抑制DPP-4 表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng),DPP-4 在自噬抑制劑的作用下,同樣有促炎作用,反向說明DPP-4 高表達(dá)和細(xì)胞自噬均有抗炎作用。與si-DPP-4 組比較,si-DPP-4 + BafA1 組IL-1β、IL-6 降低,表明在DPP-4 低表達(dá)情況下,抑制細(xì)胞自噬作用相較于炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用更強(qiáng),進(jìn)一步說明DPP-4 高表達(dá)與細(xì)胞自噬均有抗炎作用。
CXCL12/CXCR4 通路在腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥、免疫等過程中發(fā)揮重要作用。國外有研究顯示,抑制DPP-4表達(dá)能夠通過CXCL12/CXCR4/mTOR 通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,加速乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,且能夠增加乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥性[21-22]。本研究對(duì)MH-S 細(xì)胞自噬流、CXCR4/mTOR 通路mRNA 和蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,經(jīng)過LPS 誘導(dǎo),細(xì)胞自噬流升高,mTOR mRNA、CXCR4 mRNA、p-mTOR 蛋白、CXCR4 蛋白表達(dá)上調(diào),表明在炎癥反應(yīng)的刺激下,CXCR4/mTOR 通路部分被激活,而在DPP-4 過表達(dá)的情況下,自噬流進(jìn)一步升高,通路mRNA 和蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),表明DPP-4 能夠有效激活CXCR4/mTOR 通路,促進(jìn)細(xì)胞自噬;而在DPP-4 低表達(dá)的情況下,自噬作用受到抑制。另外本研究在DPP-4 過表達(dá)及低表達(dá)的情況下給予自噬抑制劑,結(jié)果顯示,兩種情況下細(xì)胞自噬流及通路蛋白表達(dá)均下調(diào),進(jìn)一步說明DPP-4 能夠通過CXCR4/mTOR 通路對(duì)MH-S 細(xì)胞自噬作用進(jìn)行調(diào)控。
綜上所述,DPP-4 能夠通過調(diào)控小鼠肺巨噬細(xì)胞自噬作用影響細(xì)胞炎癥因子分泌,其作用機(jī)制與CXCR4/mTOR 通路有關(guān),未來可對(duì)DPP4 抑制劑的抗炎作用進(jìn)行深入研究,為炎癥性疾病的治療提供新的研究思路。
中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志2022年16期