范曉航，劉麗琴，胡伊瑤，趙雪紅，李泉，王穎

[1.湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)部，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（襄陽市中心醫(yī)院）腫瘤科，湖北 襄陽 441021；3.海南省人民醫(yī)院（海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院）麻醉科，海南 海口570311]

重癥肺炎是常見的進(jìn)展性呼吸系統(tǒng)危重疾病，除低氧血癥及進(jìn)行性呼吸困難等表現(xiàn)外，還可發(fā)展至全身性感染，甚至危及生命[1]。曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ）是一種代謝調(diào)節(jié)劑，常作為抗心肌缺血、改善心肌代謝藥物使用，可用于慢性肺源性心臟病的治療[2]。有研究顯示，TMZ 聯(lián)合中藥方劑治療心力衰竭合并肺部感染的有效率達(dá)96.67%，推測(cè)其具有肺保護(hù)作用[3]。然而，目前關(guān)于TMZ 治療重癥肺炎的療效及機(jī)制研究尚少。本研究通過復(fù)制重癥肺炎大鼠模型，觀察TMZ 的肺保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45 只SD 雄性大鼠，6 周齡，體重（200±20）g，購自上海昇敞生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2021-0002]，飼養(yǎng)于湖北奧菲生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2019-0109]。

1.2 菌株

肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株購自蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑鹽酸TMZ 片（南京恒生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20073969），哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）激活劑磷脂酸（phosphatidic acid,PA）（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司），CD4＋抗體、白細(xì)胞介素17（Interleukin-17,IL-17）抗體（上海研晶生物科技有限公司），白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（上海酶研生物科技有限公司），兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR 一抗（美國R&D 公司）。

1.3.2 儀器CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司），SAR-830 小動(dòng)物呼吸機(jī)（美國CWE 公司），DM500 光學(xué)顯微鏡（德國徠卡微系統(tǒng)有限公司），DYCZ-24 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 重癥肺炎模型的復(fù)制及分組模型復(fù)制前1 天制備細(xì)菌混懸液。將肺炎克雷伯菌株ATCC700603 接種至瓊脂糖平板，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)菌，采用比濁法經(jīng)無菌生理鹽水稀釋至含有400 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏幕鞈乙海? 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝粸?×1011CFU/L）。45 只SD 大鼠中隨機(jī)抽取35 只，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，頸部消毒備皮，暴露并切開大鼠上段氣管。采用24 G Y 型靜脈留置針氣管插管，拔除針芯后保持導(dǎo)管完全置入氣管，經(jīng)導(dǎo)管注入細(xì)菌混懸液0.35 mL（含有400 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝环窝卓死撞?，立起固定臺(tái)后緩慢注射，期間左右旋轉(zhuǎn)固定臺(tái)2 次，注射完成后縫合切口，常規(guī)消毒。模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后72 h 大鼠反應(yīng)遲鈍、呆滯；呼吸急促，雙側(cè)胸廓明顯運(yùn)動(dòng)；X 射線可觀察到兩肺有彌漫性滲出陰影；動(dòng)脈血氧分壓≤60 mmHg 或動(dòng)脈血氧飽和度＜90%[4]。35 只大鼠死亡5 只，模型復(fù)制成功30 只，隨機(jī)分為重癥肺炎（SP）組、TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組，每組10 只。余10 只注射無菌生理鹽水0.35 mL，設(shè)為對(duì)照組。

1.4.2 干預(yù)方式模型復(fù)制成功后，TMZ 組灌胃TMZ 生理鹽水溶液5 mL，劑量20 mg/kg，尾靜脈注射生理鹽水1 mL；TMZ 聯(lián)合PA 組灌胃TMZ 生理鹽水溶液5 mL，劑量20 mg/kg，尾靜脈注射PA 生理鹽水溶液1 mL，劑量1 mg/kg；對(duì)照組、SP 組分別灌胃、尾靜脈注射等體積生理鹽水[5]。各組1 次/d，連續(xù)干預(yù)6 d。

1.4.3 外周血輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17,Th17）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）檢測(cè)末次給藥后，禁食不禁水24 h。戊巴比妥鈉麻醉后抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，轉(zhuǎn)移至加有肝素的抗凝管中，等比例混合PBS 緩沖液，梯度離心，分離淋巴細(xì)胞，洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)/mL。取96 孔板，每孔加入淋巴細(xì)胞懸液100 μL 和刺激劑0.5 μL，每組設(shè)置同型對(duì)照，培養(yǎng)箱孵育1 h 后采用阻斷劑阻斷，繼續(xù)孵育12 h，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至流式管中，加入CD4 抗體0.5 μL，常溫遮光孵育20 min，PBS 洗滌后離心棄上清液，PBS 100 μL 重懸，加入固定破膜工作液，振蕩5 s，4℃遮光孵育35 min，加入破膜緩沖工作液2 mL，離心棄上清液，加入PBS 緩沖液至100 μL，重懸。在測(cè)定管中加入IL-17 抗體0.7 μL（檢測(cè)Th17 細(xì)胞）或Foxp3 抗體5 μL（檢測(cè)Treg 細(xì)胞），將等量、同型對(duì)照抗體加入對(duì)照管中，4℃遮光孵育40 min，洗滌后棄上清液，加入4%多聚甲醛重懸，4℃遮光保存，24 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg[6]。

1.4.4 肺功能指標(biāo)檢測(cè)抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL后取大鼠頸部正中切口，在第3 與第4 氣管環(huán)中進(jìn)行倒T 型切口插管，采用手術(shù)線系緊氣管插管，將大鼠置入體描箱，與呼吸機(jī)連接，通過AniRes 2005軟件記錄其肺容積變換量、靜息通氣量[7]。

1.4.5 ELISA 檢測(cè)肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）IL-1β、TNF-α水平肺功能指標(biāo)檢測(cè)完成后頸椎脫臼處死大鼠，迅速逐層分離頸部皮膚，暴露氣管取肺，手術(shù)線結(jié)扎、固定右肺；左肺經(jīng)37℃生理鹽水2 mL 灌洗3 次，回收后（回收率＞80%）離心收集BALF 上清液。采用ELISA 檢測(cè)BALF 中IL-1β、TNF-α 水平，實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書設(shè)計(jì)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、TNF-α 水平[8]。

1.4.6 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肺組織病理學(xué)變化取結(jié)扎未經(jīng)灌洗的右肺，分成2 份，一份用4%多聚甲醛固定，另一份在-80℃條件下保存。取4%多聚甲醛固定48 h 的肺組織，流水沖洗30 min，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，病理切片機(jī)切成4 μm 厚切片，HE 染色后用顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)變化[9]。

1.4.7 Western blotting 檢測(cè)肺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白的表達(dá)取-80℃保存的肺組織，RIPA 細(xì)胞裂解液裂解，冰上離心取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白含量。取50 μg 待測(cè)蛋白，按1∶5 與樣品緩沖液混合，金屬浴煮沸5 min，離心取上清液，上樣電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封 閉2 h，TBST 清洗，加入兔抗大鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 一抗（1∶500），4℃搖床孵育2 h，TBST 清洗，加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST 清洗，ECL 發(fā)光液顯色，置于暗室曝光，采用一體式凝膠成像系統(tǒng)分析，以Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較

對(duì)照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.766、16.254 和239.835，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，SP組外周血Th17 和Th17/Treg 升高（P＜0.05），Treg 降低（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組外周血Th17 和Th17/Treg 降低（P＜0.05），Treg 升高（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯(lián)合PA 組外周血Th17 和Th17/Treg 降低（P＜0.05），Treg 升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較（n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

Th17/Treg 0.29±0.03 1.16±0.12①0.69±0.08②0.44±0.05③239.835 0.000組別對(duì)照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值Th17/%1.45±0.20 3.39±0.48①2.46±0.37②1.89±0.28③57.766 0.000 Treg/%4.92±0.74 2.91±0.64①3.55±0.71②4.25±0.63③16.254 0.000

2.2 各組大鼠肺功能比較

對(duì)照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組肺容積變換量、靜息通氣量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.960 和47.149，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，SP 組肺容積變換量、靜息通氣量減少（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組肺容積變換量、靜息通氣量增加（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯(lián)合PA 組肺容積變換量、靜息通氣量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 （n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值肺容積變換量/mL 0.29±0.03 0.09±0.02①0.21±0.04②0.16±0.02③85.960 0.000靜息通氣量/（mL/min）3.30±0.47 1.46±0.28①2.70±0.36②2.13±0.31③47.149 0.000

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較

對(duì)照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組BALF中IL-1β、TNF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=186.449 和230.659，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，SP 組BALF中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與SP 組比較，TMZ 組BALF 中IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯(lián)合PA 組BALF 中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，±s）

表3 各組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

TNF-α 42.69±6.72 498.51±68.24①160.27±25.70②297.83±35.91③230.659 0.000組別對(duì)照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值IL-1β 75.24±12.69 563.97±79.32①195.23±28.02②301.81±45.50③186.449 0.000

2.4 肺組織病理學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)及支氣管壁清晰、完整，未觀察到明顯的炎癥浸潤；SP 組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡間隔擴(kuò)大，支氣管壁厚度明顯增加，可觀察到大量炎癥細(xì)胞浸潤；TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組較SP 組肺泡間隔縮小，支氣管壁厚度變小，炎癥細(xì)胞浸潤減少，其中TMZ 組病理變化改善程度優(yōu)于TMZ 聯(lián)合PA 組。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 （HE染色×200）

2.5 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較

對(duì)照組、SP 組、TMZ 組、TMZ 聯(lián)合PA 組肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=128.429 和246.000，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，SP組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 升高（P＜0.05）；與SP組比較，TMZ 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 降低（P＜0.05）；與TMZ 組比較，TMZ 聯(lián)合PA 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖2 各組大鼠肺組織p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較（n=10，±s）

表4 各組大鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較（n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與SP 組比較，P＜0.05；③與TMZ組比較，P＜0.05。

p-mTOR/mTOR 0.11±0.02 0.75±0.08①0.32±0.04②0.50±0.06③246.000 0.000組別對(duì)照組SP組TMZ組TMZ+PA組F 值P 值p-Akt/Akt 0.32±0.04 0.92±0.07①0.71±0.08②0.80±0.09③128.429 0.000

3 討論

目前肺炎仍是感染性疾病死亡的重要病因之一。統(tǒng)計(jì)資料顯示，重癥肺炎占肺炎的10%～20%，且病死率高達(dá)30%～50%[11]。有報(bào)道顯示，重癥肺炎不僅是病原菌與毒素直接損傷所致，而且與機(jī)體被病原體感染后炎癥反應(yīng)失控關(guān)系密切[12]。重癥肺炎發(fā)生時(shí)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)聚集于肺，形成“瀑布樣”炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致免疫功能紊亂。因此，抑制重癥肺炎炎癥反應(yīng)、改善免疫失衡是治療該病的重要思路。

本研究采用TMZ 干預(yù)重癥肺炎大鼠后發(fā)現(xiàn)，其外周血Th17、Th17/Treg 降低，Treg 升高，肺容積變換量、靜息通氣量增加，且BALF 中IL-1β、TNF-α水平降低，提示TMZ 可改善肺功能及Th17/Treg 平衡，減輕肺部炎癥反應(yīng)。Th17 細(xì)胞是一種經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt 調(diào)控的CD4+T 細(xì)胞，主要通過釋放炎癥因子IL-17 促進(jìn)炎癥反應(yīng)，在重癥肺炎中異常高表達(dá)[13]。Treg 細(xì)胞可抑制抗原呈遞細(xì)胞及T 細(xì)胞功能，減少炎癥細(xì)胞因子及抗體產(chǎn)生，減輕炎癥對(duì)機(jī)體的損傷。TMZ 可促進(jìn)葡萄糖發(fā)生有氧氧化，同時(shí)抑制脂肪酸β 氧化，減少ATP 生成過程中耗氧量；清除氧自由基、提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性；降低炎癥因子水平，維持自身免疫耐受及免疫內(nèi)環(huán)境平衡。COSGUN 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TMZ 離體給藥供體肺，可降低支氣管肺泡灌洗樣本中的硫代巴比妥酸水平及髓過氧化物酶活性，顯著改善移植后肺功能，提示TMZ 具有肺保護(hù)功能，與本研究結(jié)論相似。

本研究結(jié)果顯示，與SP 組比較，TMZ 組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 降低，且TMZ 與PA 聯(lián)用可減少TMZ 對(duì)重癥肺炎大鼠的肺功能保護(hù)作用，推測(cè)TMZ 對(duì)大鼠的治療作用可能通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活或抑制與多種病原體在宿主機(jī)體中增殖、致病過程密切相關(guān)。Akt、mTOR 是PI3K 下游關(guān)鍵效應(yīng)分子[15]。PI3K 活化生成mPIP3，可誘導(dǎo)Akt、mTOR 磷酸化，進(jìn)而抑制或激活一系列下游底物調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、遷移等行為。mTOR 是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活PI3K/Akt 信號(hào)通路的重要蛋白激酶，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及Th17/Treg 平衡中起到重要作用。ROSTAMZADEH 等[16]認(rèn)為mTOR 是負(fù) 向 調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞分化、擴(kuò)增的關(guān)鍵因子，抑制mTOR 活性可阻斷CD4＋T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的分化進(jìn)程，同時(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞分化。PA 是mTOR 的強(qiáng)效激活劑，可通過與mTOR 的結(jié)構(gòu)域FRB 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合激活mTOR1，從而增強(qiáng)PI3K/Akt 信號(hào)通路活性。

TMZ 治療重癥肺炎的機(jī)制研究彌補(bǔ)了以往研究的不足，具有一定創(chuàng)新性，為臨床重癥肺炎的治療提供了理論依據(jù)，并為該病的靶向治療藥物研究奠定基礎(chǔ)。