陳翠英，程 宇，王 懿，范春蘭，鐘文杰，陳創(chuàng)思，李遠(yuǎn)友，王樹(shù)啟*

（1.汕頭大學(xué)海洋生物研究所 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515063；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510642）

0 引言

高不飽和脂肪酸（HUFA）也稱長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）是脊椎動(dòng)物維持正常生長(zhǎng)發(fā)育的必需脂肪酸（EFA），主要包括22∶6n-3（DHA），20∶5n-3（EPA）及20∶4n-6（ARA）[1-2].由于缺乏Δ12與Δ15脂肪酸去飽和酶（Fad），脊椎動(dòng)物自身不能從頭合成C18PUFA，必須從食物中攝取，特別是18∶2n-6與18∶3n-3[2]，但能在多種Fad與碳鏈延長(zhǎng)酶（Elovl）的催化下，利用C18PUFA合成碳鏈更長(zhǎng)及雙鍵更多的LC-PUFA.Fads可將烯基引入脂肪酸的碳鏈中，增加其不飽和度[3].哺乳動(dòng)物中的Fads家族有關(guān)的基因有fads1、fads2與fads3三種[4]，而研究表明在魚(yú)類(lèi)中只有fads2基因決定了其Fad的活性[5]，但能表達(dá)Δ4、Δ5、Δ6、Δ8 Fad等多種去飽和酶[6].

黃斑藍(lán)子魚(yú)（Siganus canaliculatu）是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有LC-PUFA合成能力的海水魚(yú)類(lèi)，其LC-PUFA合成途徑的關(guān)鍵酶基因，包括去飽和酶（Δ6Δ5 Fads2、Δ4 Fads2）和碳鏈延長(zhǎng)酶（Elovl4、Elovl5、Elovl8b）基因均已被克隆與鑒定[7-10].其中，Δ6Δ5 Fads2是參與藍(lán)子魚(yú)LC-PUFA內(nèi)源性合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，分別能將18∶3n-3（ALA）和18∶2n-6（LA）轉(zhuǎn)化為18∶4n-3和18∶3n-6[10-11]，故被稱為L(zhǎng)C-PUFA生物合成途徑的限速酶，其表達(dá)量和酶活性影響著魚(yú)類(lèi)體內(nèi)LC-PUFA生物合成的水平.然而，目前尚無(wú)魚(yú)類(lèi)相關(guān)的Fads2抗體，無(wú)法深入研究魚(yú)類(lèi)LC-PUFA合成調(diào)控機(jī)制.因此，本文擬通過(guò)構(gòu)建藍(lán)子魚(yú)Δ6Δ5 Fads2蛋白原核表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)與純化，制備Δ6Δ5 Fads2蛋白多克隆抗體并分析其特異性，為深入探討藍(lán)子魚(yú)Δ6Δ5 Fads2的生物學(xué)功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)條件，從而有助于研發(fā)提高魚(yú)體內(nèi)源性LC-PUFA合成能力的方法，降低養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)飼料中魚(yú)油添加比例，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 材料

黃斑藍(lán)子魚(yú)基因組DNA和感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體pGEX-6p-1與動(dòng)物組織蛋白裂解液購(gòu)于上海生工科技有限公司；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用引物由上海生工科技有限公司合成；膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)于Omega公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I和T4 DNA Ligase均購(gòu)于Takara公司；弗氏佐劑、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、ELISA試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)及化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；其余試劑均為分析純?cè)噭?小鼠購(gòu)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.2 方法

1.2.1 Δ6Δ5 fads2基因片段的克隆

從NCBI中獲取黃斑藍(lán)子魚(yú)的Δ6Δ5 fads2基因ORF全長(zhǎng)序列，使用Blast與DNAStar軟件包中的Protean程序?qū)ζ渚幋a蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，選取了合適氨基酸序列（360～444 aa）作為克隆表達(dá)對(duì)象，該基因片段分布在Δ6Δ5 fads2基因的1 078～1 332 bp.針對(duì)該基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)）：5’-AGAGGATCCCAAGCCACCTGTAATGT-3’與下游引物（下劃線為 EcoR I酶切位點(diǎn)）：5’-CGCGAATTCTCATTTATGGAGATATGCA-3’.PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸5 min.PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)BamH I與EcoR I雙酶切反應(yīng)后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，然后插入同樣經(jīng)BamH I與EcoR I雙酶切后的pGEX-6p-1載體中，構(gòu)建pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2重組質(zhì)粒，并進(jìn)行菌液PCR與序列分析進(jìn)一步鑒定.

1.2.2 Δ6Δ5 Fads2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2重組質(zhì)粒與pGEX-6p-1（對(duì)照組）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）.挑取單菌落分別接種至10 mL LB培養(yǎng)基中（含100 μg/mL AMP），37℃搖床培養(yǎng)6 h后，按照1∶100接種至100 mL的LB培養(yǎng)基中（含100 μg/mL AMP）.培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期（OD600＝0.6）時(shí)加入終濃度0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37℃搖床誘導(dǎo)表達(dá)3 h.誘導(dǎo)前后分別取少量菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析.如鑒定有目的重組蛋白的表達(dá)，則在誘導(dǎo)后，回收菌體，超聲破碎裂解細(xì)胞，再根據(jù)GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化大量誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白.將所純化獲得的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3 重組蛋白的小鼠免疫注射及血清采集

將用弗氏佐劑乳化好的重組蛋白抗原對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，按照每只小鼠注射100 μg抗原.在第1、2、4周后用減半的抗原劑量進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫.第5周進(jìn)行眼球取血，然后將血樣放置于4℃冰箱過(guò)夜以析出血清，在3 000 r/min下離心10 min分離血清，小份分裝置-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?

1.2.4 黃斑藍(lán)子魚(yú)肝臟組織蛋白的提取

將藍(lán)子魚(yú)肝組織與動(dòng)物組織蛋白裂解液按照1∶5的體積比混合后，使用組織均漿機(jī)進(jìn)行低溫均漿，然后置于冰上30 min，期間每隔10 min高速低溫旋渦30～60 s，最后在12 000 r/min下離心10 min，取上清，分裝后置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?

1.2.5 Western blot鑒定多克隆抗體的特異性

將黃斑藍(lán)子魚(yú)肝臟組織蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，然后使用鼠抗Δ6Δ5 Fads2的多克隆抗體作為一抗，4℃孵育過(guò)夜.PBST搖床洗滌3遍后，加入1∶3 000稀釋后的二抗羊抗鼠IgG-HRP，室溫?fù)u床孵育1 h，然后PBST搖床洗滌3遍.最后利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并用Amersham Imager 600（GE Healthcare，USA）系統(tǒng)分析得到顯色圖像.

1.2.6 ELISA檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià)

使用碳酸鹽包被液（pH 9.6，0.05 mol/L）將純化后的目的蛋白溶液稀釋至10 μg/mL，加入酶標(biāo)板4℃過(guò)夜包被；次日PBST洗滌3次；封閉液封閉（37℃，1 h）后加入等體積梯度稀釋?zhuān)?∶5×102、1∶1×103、1∶2×103、1∶4×103、1∶8×103、1∶1.6×104、1∶3.2×104、1∶6.4×104）血清、陰性對(duì)照（未免疫小鼠）血清及空白對(duì)照鼠血清稀釋液，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù).37℃孵育2 h，PBST洗滌3次；加入稀釋后的HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000），37℃孵育45 min，PBST洗滌3次；TMB溶液37℃避光顯色30 min后，加入50 μL終止液終止反應(yīng)后利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定A450值.以實(shí)驗(yàn)組/陰性對(duì)照的光吸收比值≥2作為抗體效價(jià)判定標(biāo)準(zhǔn).血清效價(jià)檢測(cè)達(dá)標(biāo)后，分裝放于-80℃保存?zhèn)溆?

2 結(jié)果

2.1 pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)Blast分析Δ6Δ5 Fads2氨基酸序列（444aa），將與其他Δ6Δ5 Fads2蛋白同源性較低的85個(gè)氨基酸序列作為候補(bǔ)序列，該段序列具有較高的特異性.再通過(guò)Protean程序分析該段序列，該多肽片段免疫原性較高（圖1），易于制備特異性抗體.以黃斑藍(lán)子魚(yú)肝組織cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到255 bp大小的片段，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離，與預(yù)測(cè)的255 bp大小一致（圖2A）.將此片段克隆到pGEX-6p-1載體中，提取重組質(zhì)粒為模板，并經(jīng)PCR驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性（圖2B）.選取該克隆子送上海生工有限公司測(cè)序，結(jié)果表明該克隆子質(zhì)粒中的目的片段與Δ6Δ5 fads2基因所編碼的85個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的DNA序列一致，且開(kāi)放閱讀框正確，未出現(xiàn)堿基突變和移碼等問(wèn)題，pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 Δ6Δ5 Fads2蛋白免疫原性與親水性分析

圖2 Δ6Δ5 fads2 PCR產(chǎn)物電泳分析（A）和以重組質(zhì)粒為模板PCR鑒定（B）

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

將pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21（DE3）中，加入IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白.SDS-PAGE分析顯示，加入IPTG誘導(dǎo)后的菌液在35 ku的位置有明顯的重組蛋白表達(dá)帶（圖3，泳道2），而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液對(duì)應(yīng)位置的樣品無(wú)明顯條帶（圖3，泳道1）.誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)超聲破碎后離心，參照GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化目的蛋白，并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定重組蛋白濃度為1.45 mg/ml，獲得了純度較高的pGEX-6p-1-Δ6Δ5 Fads2融合蛋白（圖4，泳道2、3）.

圖3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果

圖4 重組蛋白的純化

2.6 多克隆抗體的特異性分析

利用制備的多克隆抗體血清，采樣Western blot方法檢測(cè)黃斑藍(lán)子魚(yú)肝組織中的Δ6Δ5 Fads2蛋白，結(jié)果如圖6所示，僅在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明制備的Δ6Δ5 Fads2抗體特異性強(qiáng)，可以專(zhuān)一性的檢測(cè)藍(lán)子魚(yú)組織細(xì)胞樣品中的Δ6Δ5 Fads2蛋白水平.

2.7 抗體血清效價(jià)的測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)收集的血清中多克隆抗體的效價(jià).從表1結(jié)果可以得出，小鼠的抗血清稀釋至1.6×104時(shí)，陽(yáng)性血清效價(jià)與陰性血清效價(jià)檢測(cè)值相比仍大于2，且小鼠的抗血清稀釋至3.2×104時(shí)，該比值接近2.因此，判定Δ6Δ5 Fads2多克隆抗體效價(jià)約為3.2×104.

表1 ELISA方法測(cè)定多克隆抗體Δ6Δ5 Fads2效價(jià)

圖5 黃斑藍(lán)子魚(yú)肝組織蛋白（A）和Δ6Δ5 Fads2抗體反應(yīng)性檢測(cè)（B）

3 討論

本課題組首次在海水魚(yú)類(lèi)黃斑藍(lán)子魚(yú)中發(fā)現(xiàn)并克隆到Δ6Δ5 fads2基因，該基因具有Δ6 Fad和Δ5 Fad雙功能性，是LC-PUFA生物合成所必須的關(guān)鍵基因.Δ6Δ5 Fads2蛋白是黃斑藍(lán)子魚(yú)LC-PUFA生物合成的關(guān)鍵酶，Δ6 Fad的功能是將ALA和LA轉(zhuǎn)化為18∶4n-3和18∶3n-6，還可將24∶5n-3轉(zhuǎn)化成24∶6n-3，進(jìn)一步氧化生成DHA.而Δ5 Fad的功能是將20∶3n-6與20∶4n-3分別轉(zhuǎn)化成ARA與EPA[15].對(duì)Δ6Δ5 Fads2的研究將有助于闡明黃斑藍(lán)子魚(yú)內(nèi)源性合成LC-PUFA的途徑與分子調(diào)控機(jī)制.因此，為了深入探究Δ6Δ5 Fads2蛋白的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)嘗試制備藍(lán)子魚(yú)Δ6Δ5 Fads2的多克隆抗體.

本研究使用Blast對(duì)Δ6Δ5 fads2的氨基酸序列進(jìn)行分析，選擇與其他Δ6Δ5Fads2肽段同源性最低的一段序列（360～444 aa）.再利用Protean程序?qū)υ摱味嚯姆治龅慕Y(jié)果顯示其免疫原性較高，易于制備特異性抗體.而為解決其親水性較低的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選擇了非跨膜區(qū)氨基酸序列，并利用GST標(biāo)簽融合表達(dá)增加目的蛋白的溶解度，同時(shí)便于后續(xù)的純化[13].因此，選用的pGEX-6p-1質(zhì)粒含有編碼GST的序列，且包含的Tac啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平較高，能大量表達(dá)目的基因，提高抗原表達(dá)量[14].GST標(biāo)簽蛋白能與偶聯(lián)在瓊脂糖介質(zhì)上的谷胱甘肽配體互補(bǔ)性結(jié)合，然后在非變性條件下加入還原型谷胱甘肽洗脫GST-Δ6Δ5 Fads2蛋白，最終得到了高純度的重組蛋白.

將純化的蛋白作為抗原免疫小鼠，提取多抗血清，進(jìn)行Western blot檢測(cè).檢測(cè)結(jié)果顯示多克隆抗體對(duì)藍(lán)子魚(yú)肝組織Δ6Δ5 Fads2蛋白具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性，在Western blot實(shí)驗(yàn)中清晰特異地識(shí)別Δ6Δ5 Fads2蛋白，但特異性條帶比預(yù)期的Δ6Δ5 Fads2蛋白大小（52 ku）略小.推測(cè)可能是與本實(shí)驗(yàn)使用的預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān).預(yù)染的蛋白Marker與染料共價(jià)偶聯(lián)，在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生某些變化，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合精確定位蛋白.此外，肝細(xì)胞中對(duì)Δ6Δ5 Fads2翻譯后的磷酸化修飾也可能會(huì)使蛋白質(zhì)的負(fù)電荷增加，導(dǎo)致Δ6Δ5 Fads2在電泳中遷移速率過(guò)快，產(chǎn)生與預(yù)期分子量大小上的偏差.因此，關(guān)于Δ6Δ5 Fads2多克隆抗體更詳細(xì)的信息還需要在后續(xù)的研究中使用質(zhì)譜等方法進(jìn)一步確認(rèn).此外，本實(shí)驗(yàn)中的ELISA效價(jià)較高，接近3.2×104.本研究獲得的多克隆抗體可以用于Western blot中Δ6Δ5 Fads2蛋白的檢測(cè)，為深入探討藍(lán)子魚(yú)Δ6Δ5 Fads2的生物學(xué)功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)條件.