毛軒睿, 劉玉萍, 蘇 旭,2,3,4*, 富 貴, 陳金元, 鄭長遠, 劉 濤,呂 婷, 張 雨, 胡夏宇, 楊 萍

(1. 青海師范大學生命科學學院， 青海 西寧 810008； 2. 青海師范大學高原科學與可持續(xù)發(fā)展研究院， 青海 西寧 810016；3. 青海師范大學青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室， 青海 西寧 810008； 4. 青海師范大學青藏高原地表過程與生態(tài)保育教育部重點實驗室， 青海 西寧 810008； 5. 青海師范大學地理科學學院， 青海 西寧 810008)

沙鞭(Psammochloavillosa)是禾本科(Poaceae)、沙鞭屬(Psammochloa)的一種具長根狀莖的多年生草本植物，主要分布在我國陜西、內(nèi)蒙古、青海、甘肅、寧夏等地，通常生于海拔900～2 900 m的沙地和荒漠中[1-2]。沙鞭是一種良好的固沙植物，具有較強的耐旱、耐寒、耐堿、抗風沙和抗病能力[3]。此外，沙鞭富含高品質(zhì)蛋白質(zhì)，因而是畜牧業(yè)上重要的優(yōu)良牧草[4]。目前，國內(nèi)外學者對沙鞭的研究主要集中于形態(tài)特征[5-8]、生理特性[9-10]、細胞性狀[11]、生態(tài)適應性[12-14]、遺傳多樣性[15]及種質(zhì)資源收集[16]等領(lǐng)域。譬如，董鳴等[5]通過對根莖禾草沙鞭與賴草切斷根莖生長狀態(tài)的比較，發(fā)現(xiàn)沙鞭的克隆特性使其在干旱貧瘠環(huán)境中具有更強的生存能力；呂婷等[7]對沙鞭50個代表種群葉表皮微形態(tài)特征的觀察，發(fā)現(xiàn)沙鞭種群葉表皮氣孔密度隨環(huán)境干旱程度增加而增加，認為這種結(jié)構(gòu)有利于減少體內(nèi)水分散失，是對荒漠環(huán)境的一種微觀形態(tài)學解剖特征性適應；黃振英等[10]對沙鞭不同深度沙層中種子萌發(fā)情況和幼苗出土特性的研究，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)率和幼苗出土率均隨種子被埋深度增加而降低；王亞男等[11]通過對內(nèi)蒙古高原6個沙鞭居群染色體核型的分析，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目均為2n=2x=46，具正中部著絲粒、中部著絲粒、亞中部著絲粒和亞端部著絲粒染色體，核型類型為1A，2A，1B和2B型，核型對稱性較高，進化程度較為原始；賀學禮等[13]通過探討叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza，AM)真菌時間和空間分布及侵入群落間隔空地前后對沙鞭AM真菌的影響，發(fā)現(xiàn)沙鞭與AM真菌可形成良好的共生關(guān)系，沙鞭的克隆生長對土壤AM真菌的活動和時空分布有顯著影響，AM真菌孢子密度和結(jié)構(gòu)定殖率在沙鞭侵入群落間隔空地前后發(fā)生顯著變化；呂婷[15-16]綜合利用表型性狀和DNA分子標記分析了沙鞭的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其表型多樣性豐富，居群間遺傳變異大于居群內(nèi)，且居群間遺傳分化顯著。然而，目前尚未見關(guān)于沙鞭三代全長轉(zhuǎn)錄組簡單重復序列(SSR)位點特征的研究報道。

簡單重復序列(Simple sequence repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星序列(microsatellite)，是研究動植物基因遺傳多樣性的一種重要分子標記[17]。真核生物基因組中，SSR常由2～6個重復、均勻分布的核苷酸片段串聯(lián)組成，具有操作簡便、共顯性遺性、多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點[18]。近年來，SSR分子標記在植物系統(tǒng)進化[19]、遺傳多樣性[20-21]、群體遺傳結(jié)構(gòu)[21]及動態(tài)進化歷史[22]等領(lǐng)域應用廣泛。譬如，尹航等[19]從短芒大麥(Hordeumbrevisubulatum)214 676條Unigene序列中檢測到24 877個SSR位點，成功設(shè)計20 802對引物，認為短芒大麥轉(zhuǎn)錄組SSR開發(fā)有較大可能性，為將來SSR分子標記開發(fā)、種質(zhì)資源評價和輔助育種等提供了參考；李正玲等[20]利用SSR分子標記分析了河南省白麥、紅和尚頭、三月黃、白和尚頭等15組相同名稱地方小麥(Triticumaestivum)品種組間和組內(nèi)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)小麥地方品種具有豐富的遺傳多樣性，相同名稱地方小麥品種間有同名同質(zhì)和同名異質(zhì)存在；徐金青等[21]通過對青稞(Hordeumvulgare)轉(zhuǎn)錄組SSR位點特征的分析，發(fā)現(xiàn)其含有的SSR位點序列與生物基礎(chǔ)代謝密切相關(guān)；王恒波等[22]利用MISA軟件挖掘了甘蔗(Sacchrumspp.)的SSR位點，并分析了分布特征和多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)甘蔗SSR位點單核苷酸重復基元中A/T占比最高，認為禾本科植物基因組富含A/T基元。據(jù)此，本研究采用MISA軟件對沙鞭三代轉(zhuǎn)錄組全長序列SSR位點進行搜索，并分析其組成類型和分布特征，闡明沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR位點特征，旨在為今后沙鞭SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性分析和新基因挖掘等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年，赴甘肅省武威市民勤縣(103.65° N，39.17° E，海拔1 250 m)采集生長良好的沙鞭新鮮健康葉片，迅速用錫箔紙包裹后液氮中速凍，用于RNA提取和測序。憑證標本存放于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)。

1.2 實驗方法

1.2.1總RNA提取、建庫及數(shù)據(jù)評估 采用改良的CTAB法[23-24]提取樣品總RNA，經(jīng)純度和濃度檢測合格后等物質(zhì)的量混合，采用PacBio Sequel測序平臺進行全長轉(zhuǎn)錄組測序、文庫構(gòu)建和數(shù)據(jù)評估。原始數(shù)據(jù)下機后利用SMRTlink軟件獲得Subreads序列，對其校正后產(chǎn)生環(huán)形一致性序列即CCS；根據(jù)CCS是否含有3′和5′引物及PloyA特征，將其劃分為全長序列(FL，F(xiàn)ull length)和非全長序列(NFL，Non-full length)，并分類找出全長非嵌合序列(FLNC，F(xiàn)ull-length non-chimeric)；采用同種類型聚類法(ICE，Iterative isoform-clustering)將相似的FLNC序列聚成一簇，得到Cluster，每個Cluster獲得一條一致性序列，結(jié)合非全長序列對其進行校對(Polishing)，篩選得到高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組SSR微衛(wèi)星序列搜索和篩選 使用MISA(Microsatellite identification tool)軟件檢測轉(zhuǎn)錄本Unigene序列中的SSR位點[25]，獲得單核苷酸(Mononucleotide)、二核苷酸(Dinucleotide)、三核苷酸(Trinucleotide)、四核苷酸(Tetranucleotide)、五核苷酸(Pentanucleotide)和六核苷酸重復(Hexanucleotide)及復合型SSR位點(Number of composite SSR loci)序列；對SSR位點檢測以“單堿基重復10次及以上，二堿基重復6次及以上，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復5次及以上”為篩選標準，當2個SSR間距離小于100 bp時組合成1個復合微衛(wèi)星。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計 基于上述篩選的SSR位點信息，采用Primer3軟件批量設(shè)計PCR擴增引物，并對引物進行篩選，即二堿基重復次數(shù)10次以上，三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復次數(shù)6次以上，GC含量40%～60%，退火溫度(Tm)50～65℃，3′端最后5個堿基至少含一個G或C(不超過3個)，引物長度17～28 bp(小于30 bp)，上游和下游引物Tm差值≤5℃，預計擴增產(chǎn)物長度介于150～350 bp。

1.2.4含SSR位點Unigene序列的KOG和GO功能分類 運用BlastX軟件將沙鞭轉(zhuǎn)錄組中含SSR位點的Unigenes序列比對到NR蛋白(Non-redundant protein database)和KOG數(shù)據(jù)庫(Eukaryotic ortholog groups)；采用Blast2GO軟件和WEGO在線平臺(https://wego.genomics.cn/)對NR注釋到的Unigene序列進行注釋信息分析和GO功能富集分類，并分析其功能分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組中SSR分布和特征

通過對去冗余沙鞭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，本研究共得到184 076條Unigenes，平均和總長度分別為2 461 bp和453 051 607 bp；運用MISA軟件搜索到分布于56 824條Unigenes上的93 563個SSR重復序列，SSR發(fā)生頻率(含SSR位點Unigene數(shù)占Unigene總數(shù)比例)為30.87%、出現(xiàn)頻率(SSR位點數(shù)占Unigene總數(shù)比例)為50.83%；轉(zhuǎn)錄組的Unigene序列平均每4 842 bp出現(xiàn)一個SSR位點，有17 120個Unigenes包含1個以上SSR位點，復合型SSR位點有9 198個(表1)，說明沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分布廣且豐富。

表1 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR分布及特征Table 1 The distribution and characteristics of SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR重復類型

本研究結(jié)果表明，沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR重復類型較為豐富，單核苷酸至六核苷酸重復均有呈現(xiàn)，各重復類型數(shù)目差異較大，但以單核苷酸至三核苷酸重復為主，占總SSR位點的98.06%(表2)。其中，單核苷酸重復最多(50 027)，占比53.47%，總長度為510 241 bp，平均每9 060 bp核苷酸出現(xiàn)一個單核苷酸重復序列；三核苷酸次之(26 112)，占比27.91%，總長度為376 377 bp，平均每17 350 bp有一個三核苷酸重復序列；二核苷酸最少(15 609)，占比16.68%，總長度為204 198 bp，平均每29 030 bp出現(xiàn)一個二核苷酸重復序列；四、五、六核苷酸重復序列類型極少，僅占1.94%，其中五核苷酸重復僅有317，占比僅為0.34%。此外，重復類型不同的SSR位點，出現(xiàn)頻率也存在較大差異，單核苷酸重復類型至六核苷酸重復類型的SSR出現(xiàn)頻率依次為27.18%，8.48%，14.19%，0.56%，0.17%和0.25%，其中單核苷酸重復類型的SSR出現(xiàn)頻率最高，每100條Unigene含SSR位點數(shù)高達27.18個，五核苷酸重復類型的SSR出現(xiàn)頻率最低，每100條Unigene僅含0.17個SSR位點。

表2 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點重復類型、數(shù)量及分布Table 2 The repeating type,number,and distribution of SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.3 轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型分析

沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型分析結(jié)果表明，SSR重復基元類型有168個，不同重復次數(shù)形成的SSR位點數(shù)93 563個(圖1和表3)。其中，單核苷酸重復有2種基元類型，(A/T)n基元類型為主要類型，形成39 544個SSR位點，占同類基元SSR位點的79.05%，為總SSR位點的42.26%；二核苷酸重復有4種基元類型，優(yōu)勢基元類型為(AG/CT)n，形成8 691個SSR位點(59.68%，9.29%)；三核苷酸重復有10種基元類型，基元類型中SSR位點最多的是(CCG/CGG)n，形成9 175個SSR位點(35.14%，9.81%)，其次為(AGC/CTG)n(22.7%，6.33%)，形成5 927個SSR位點，(AGG/CCT)n基元類型形成SSR位點最少，形成4 129個SSR位點(15.81%，4.41%)；四核苷酸重復有31種基元類型，形成SSR位點較多的基元類型依次為(AGCG/CGCT)n,(ATCC/ATGG)n,(ACGC/CGTG)n，分別含有256(24.85%，0.27%)、163(15.83%，0.17%)和118(11.46%，0.13%)個SSR位點；五核苷酸重復有42種基元類型，SSR位點形成較多的基元類型依次為(AGAGG/CCTCT)n,(AGGGG/CCCCT)n和(ACTCG/AGTCG)n，分別形成60(18.93%，0.06%),27(8.52%，0.03%)和25(7.89%，0.03%)個SSR位點；六核苷酸重有基元類型79種，形成SSR位點較多的基元類型依次為(ACCAGC/CTGGTG)n,(AGGCGG/CCGCCT)n,(AC-AGCC/CTGTGG)n，(ACGGCG/CCGTCG)n,(AGA-GGG/CCCTCT)n和(ACCGCC/CGGTGG)n，分別形成104(22.22%，0.11%),36(7.69%，0.04%),27(5.77%，0.03%),18(3.85%，0.02%),18(3.85%，0.02%)和17(3.63%，0.02%)個SSR位點。

本研究結(jié)果還顯示，不同基元類型的SSR位點數(shù)差異較大，單核苷酸重復中(A/T)n基元的SSR發(fā)生頻率最高為21.48%；30個基元類型形成的SSR位點發(fā)生頻率最低，僅含1個SSR序列，其中四核苷酸基元2個、五核苷酸基元5個、六核苷酸基元23個。從基元數(shù)量分布看，沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型隨SSR基元堿基數(shù)增加而增加，而SSR位點數(shù)則隨基元堿基數(shù)增加而下降(圖1和表3)。

圖1 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同重復類型優(yōu)勢基元SSR位點數(shù)分布Fig.1 The quantitative distribution of SSR loci of preponderant motifs in different repeat types of transcriptomes of Psammochloa villosa

表3 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同重復基元SSR位點數(shù)及頻率Table 3 The quantities and frequencies of different motif SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

續(xù)表3

2.4 轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復次數(shù)分析

SSR基元重復次數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)5次重復基元出現(xiàn)頻率最高，共16 553個，占總SSR位點數(shù)的17.69%，其次為10次重復(14.58%),6次重復(11.68%)和11次重復(7.58%)；SSR位點重復5～10次的有52 747個,占56.38%，重復11～20次的有26 315個,占28.13%，重復21～30次的有6 938個,占7.42%，重復31～40次的有2 209個,占2.36%，重復41～50的有1 349個,占1.44%，重復51～60次的有938個,占1.00%；SSR數(shù)量隨重復次數(shù)增加而降低，未呈現(xiàn)于圖中的四堿基、五堿基和六堿基重復也具有相同的趨勢，隨重復次數(shù)增多而降低(圖2)。

圖2 沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR基元重復次數(shù)Fig.2 Repeat times of SSR motifs in transcriptomes of Psammochloa villosa

SSR基元重復次數(shù)類型分布分析，發(fā)現(xiàn)沙鞭轉(zhuǎn)錄組中不同重復次數(shù)形成的SSR位點隨基元序列長度呈現(xiàn)較大差異；不同基元類型構(gòu)成的SSR位點中，重復次數(shù)最小的最多，隨基元序列長度增長，重復次數(shù)類型總體呈現(xiàn)下降趨勢(表4)。單核苷酸重復次數(shù)類型分布最廣，介于10～40，有60種類型，不同重復次數(shù)類型形成的SSR位點數(shù)量差異較大，其中最小重復次數(shù)(10次)形成的SSR位點占比最高，占所有單核苷酸SSR序列的24.56%，最大重復次數(shù)(40次)占所有單核苷酸SSR序列的0.34%，有171個SSR位點；而重復次數(shù)類型最少的五核苷酸則介于5～8，有16種，其中5次為最小重復次數(shù)，形成最多的SSR位點(255個)，占五核苷酸重復序列總SSR位點的79.50%，最大重復次數(shù)為8次，形成3個SSR位點，占比1.19%。重復次數(shù)介于10～40基元重復次數(shù)類型詳見表4。

表4 沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復次數(shù)統(tǒng)計Table 4 The statistics of repetition times for SSR motifs in transcriptomes of Psammochloa villosa

2.5 轉(zhuǎn)錄組不同基元類型SSR位點長度分析

沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同基元SSR位點長度統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)不同類型基元SSR位點包含的長度類型不同，但主要集中于12～36 bp，二核苷酸至六核苷酸在此長度范圍內(nèi)共包含43 085個SSR位點，占統(tǒng)計SSR位點的98.98%(統(tǒng)計重復次數(shù)5～40 SSR數(shù)量，位點總數(shù)為43 531)，且SSR位點長度與數(shù)目呈負相關(guān)(圖3和表5)。三核苷酸基元構(gòu)成的SSR位點長度在12～36 bp數(shù)量最多，為26 051個，占三核苷酸SSR位點總數(shù)的99.77%；二核苷酸次之(15 250個，97.73%)；五核苷酸最少(314個，99.05%)；四核苷酸和六核苷酸分別為1 028個(99.81%)和442個(94.44%)。

圖3 沙鞭轉(zhuǎn)錄組不同基元類型SSR位點統(tǒng)計Fig.3 The statistics of different motif SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa

表5 沙鞭不同基元和重復次數(shù)SSR位點長度分析Table 5 Statistics of the length of different motifs and repetition time SSR loci of Psammochloa villosa

2.6 轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計

本研究采用Primer3軟件批量設(shè)計SSR引物，共設(shè)計43 620對引物，基于自動和人工篩選得到31對符合要求的引物，其中二堿基重復引物11對、三堿基重復引物19對、四堿基重復引物1對，預計擴增產(chǎn)物長度為173～277 bp(表6)。

表6 31對SSR引物信息Table 6 Information of 31 pairs of SSR primers

續(xù)表6

2.7 轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene功能注釋及分類

通過對56 824條含SSR的Unigenes的GO和KOG功能注釋，本研究發(fā)現(xiàn)KOG注釋將29 444條Unigenes歸為24類(圖4)，且含SSR的基因序列功能豐富。其中，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶功能類占比最大，有3 757個Unigenes，占KOG注釋Unigenes總數(shù)的12.76%；其次是一般功能預測(3 511，11.92%)和信號轉(zhuǎn)導機制(3 468，11.78%)；細胞外結(jié)構(gòu)占比最少，僅有9個Unigenes，占比0.03%。GO注釋將10 864個Unigenes歸為細胞組成(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學過程(Biological process)的41個功能類群(圖5)，其中主要功能類群為結(jié)合、催化活性、代謝過程、細胞過程、細胞和細胞組分。

圖4 沙鞭轉(zhuǎn)錄組含SSR位點的Unigene序列KOG功能分類Fig.4 KOG functional classification of unigenes containing SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa注：1-核糖核酸處理和修飾；2-碳水化合物運輸和代謝；3-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；4-細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割；5-氨基酸運輸和代謝；6-核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝；7-輔酶運輸和代謝；8-脂質(zhì)運輸和代謝；9-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；10-轉(zhuǎn)錄；11-復制、重組和修復；12-細胞壁，膜，包膜生物發(fā)生；13-細胞運動；14-翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶；15-無機離子轉(zhuǎn)運和代謝；16-次級代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝；17-一般功能預測；18-未知功能；19-信號轉(zhuǎn)導機制；20-細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運；21-防御機制；22-細胞外結(jié)構(gòu)；23-核結(jié)構(gòu)；24-細胞骨架Note:1-RNA processing and modification;2-Carbohydrate transport and metabolism;3-Energy production and conversion;4-Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning;5-Amino acid transport and metabolism;6-Nucleotide transport and metabolism;7-Coenzyme transport and metabolism;8-Lipid transport and metabolism;9-Translation,ribosomal structure and biogenesis;10-Transcription;11-Replication,recombination and repair;12-Cell wall/membrane/envelope biogenesis;13-Cell motility;14-Posttranslational modification,protein turnover,chaperones;15-Inorganic ion transport and metabolism;16-Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism;17-General function prediction only;18-Function unknown;19-Signal transduction mechanisms;20-Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport;21-Defense mechanisms;22-Extracellular structures;23-Nuclear structure;24-Cytoskeleton

圖5 沙鞭轉(zhuǎn)錄組含SSR位點的Unigene序列GO功能分類Fig.5 GO functional classification of unigenes containing SSR loci in transcriptomes of Psammochloa villosa注：1-細胞；2-細胞成分；3-細胞器；4-膜；5-膜成分；6-細胞器成分；7-蛋白質(zhì)復合物；8-超分子復合物；9-膜封閉腔；10-細胞外組分；11-擬核；12-催化活性；13-轉(zhuǎn)運蛋白活性；14-結(jié)合；15-分子傳感器活性；16-抗氧化活性；17-分子功能調(diào)節(jié)器；18-結(jié)構(gòu)分子活性；19-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性；20-過時信號傳感器活動；21-定位；22-生物調(diào)節(jié)；23-代謝過程；24-細胞過程；25-發(fā)育過程；26-多細胞生物過程；27-生殖過程；28-繁殖；29-生物過程的調(diào)節(jié)；30-多生物體過程；31-生物過程的負調(diào)控；32-應激反應；33-信號；34-免疫系統(tǒng)過程；35-生物過程的正調(diào)控；36-生長；37-細胞成分組織或生物發(fā)生；38-節(jié)律過程；39-碳利用；40-移動；41-細胞增殖Note:1-cell;2-cell part;3-organelle;4-membrane;5-membrane part;6-organelle part;7-protein-containing complex;8-supramolecular complex;9-membrane-enclosed lumen;10-extracellular region;11-nucleoid;12-catalytic activity;13-transprter activity;14-binding;15-molecular transducer activity;16-antioxidant activity;17-molecular function regulator;18-structural molecule activity;19-transcription regulator activity;20-obsolete signal transducer activity;21-localization;22-biological regulation;23-metabolic process;24-cellular process;25-developmental process;26-multicellular organismal process;27-reproductive process;28-reproduction;29-regulation of biological process;30-multi-organism process;31-negative regulation of biological process;32-response o stimulus;33-signaling;34-immune system process;35-positive regulation of biological process;36-growth;37-cellular component organization or biogenesis;38-rhythmic process;39-carbon utilization;40-locomotion;41-cell proliferation

3 討論

先前研究表明，三代全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)無需打斷和組裝，具有測序讀長長，能直接讀取反轉(zhuǎn)錄全長cDNA等[26]，尤其能有效獲取高質(zhì)量單個RNA分子的全部序列，精準得到mRNA的同源異構(gòu)體、單堿基變異、可變剪接、同源基因和等位基因等信息，因而現(xiàn)已成為DNA測序技術(shù)未來發(fā)展的主要方向[27]。本研究基于PacBio Sequel測序平臺，獲得沙鞭的全長轉(zhuǎn)錄組含184 076條Unigene序列，去冗余后得到93 563個SSR重復序列，其分布于56 824條Unigene序列上，SSR發(fā)生頻率為30.87%。徐金青等[21]通過對青稞轉(zhuǎn)錄組9 576條Unigene序列分析，發(fā)現(xiàn)SSR位點11 930個，發(fā)生頻率為16.49%；王恒波等[22]在甘蔗中發(fā)現(xiàn)27 241個SSR位點，平均每1.08個基因出現(xiàn)一個SSR位點，發(fā)生頻率為14.02%；朱永群等[27]通過對禾本科牧草蘇丹草(Sorghumsudanense)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)SSR位點發(fā)生頻率為16.82%，這些結(jié)果顯著低于本研究中SSR位點的發(fā)生頻率，因此我們認為沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的發(fā)生頻率較高，位點數(shù)量豐富，具有較高的開發(fā)潛能。

沙鞭轉(zhuǎn)錄組含有豐富的SSR重復類型，單核苷酸至六核苷酸重復均存在，以單核苷酸、二核苷酸及三核苷酸重復為主，其占總SSR位點的98.06%，其中以單核苷酸重復最多(50 027，53.47%)。王恒波等[22]通過對甘蔗轉(zhuǎn)錄組SSR重復類型的分析，發(fā)現(xiàn)其以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復為主要的SSR重復類型，占比分別為40.67%、11.97%和23.67%，這與本研究結(jié)果基本一致，尤其絕大多數(shù)模式植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[29]、棉花(Gossypiumspp.)[30]和水稻(Oyrzasativa)[29]中也獲得類似結(jié)論，從而進一步說明本研究的結(jié)果是準確和合理的。同時，本研究顯示沙鞭轉(zhuǎn)錄組含有168個SSR重復基元類型，不同重復次數(shù)下形成的SSR位點數(shù)共93 563個；基元類型隨SSR基元堿基數(shù)增加而增加，SSR位點數(shù)隨SSR基元堿基數(shù)增加而降低。其中，單核苷酸重復的2種基元類型中(A/T)n占絕對優(yōu)勢，形成39 544個SSR位點，占同類基元SSR位點的79.05%，占總SSR位點的42.26%。先前研究表明，高粱(Sorghumbicolor)[31](65.60%)、水稻[31](64.40%)和甘蔗[22](84.78%)等3種禾本科植物轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸重復基元也是(A/T)n占優(yōu)勢，據(jù)此我們認為沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR基元應具有某種堿基偏好性，富含(A/T)n基元類型可能是禾本科植物的共同特點。二核苷酸重復有4種類型，(AG/CT)n為優(yōu)勢基元類型；三核苷酸重復有10種基元類型，優(yōu)勢基元類型為(CCG/CGG)n、(AGC/CTG)n和(AGG/CCT)n，這與青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR以(AG/CT)n[21]為優(yōu)勢基元、玉米(Zeamays)[32]中以(CCG/CGG)n和(AGG/CCT)n為優(yōu)勢基元相同，這也得到先前諸多學者[30]認為大多數(shù)單子葉植物轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸和三核苷酸的優(yōu)勢重復基元分別為(AG/CT)n和(CCG/CGG)n觀點的證實。此外，沙鞭SSR不同基元長度和重復次數(shù)類型分布分析，我們發(fā)現(xiàn)沙鞭轉(zhuǎn)錄組中SSR長度主要集中于12～36 bp，長度≥20 bp的SSR序列共20 364個，占統(tǒng)計總數(shù)的23.09%，12～20 bp的占統(tǒng)計總數(shù)的55.82%，其與SSR位點數(shù)目呈負相關(guān)；隨SSR基元序列長度增加，重復次數(shù)類型總體呈下降趨勢，顯然沙鞭SSR具有較高的多態(tài)性，因此SSR分子標記具有較高的開發(fā)價值和潛能。

另外，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出31對符合要求的SSR引物；同時，對含SSR的Unigene序列進行了生物功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能主要集中于翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、催化活性和代謝過程，翻譯后修飾是植物細胞快速響應外界環(huán)境過程的重要生物學過程，通過將磷酸基、甲硫氨酸等多樣化基團共價連接到靶蛋白上，來調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和定位，控制靶蛋白與其它蛋白間的相互作用，致使靶蛋白質(zhì)具有更加復雜和完善的結(jié)構(gòu)與功能，從而提高植物的耐逆性；植物蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)也是外界脅迫條件下植物維持自身正常新陳代謝和生物功能的必要條件。由此看來，研究沙鞭轉(zhuǎn)錄組中功能性SSR不僅可為其耐逆適應性研究提供參考數(shù)據(jù)，而且也可為新基因開發(fā)提供理論支撐。

4 結(jié)論

本研究獲得沙鞭93 563個SSR重復序列，發(fā)生頻率為30.87%，SSR位點數(shù)量豐富，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性潛能；轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸重復以(A/T)n為優(yōu)勢基元，可能與堿基偏好性有關(guān)；含SSR的Unigene功能主要集中于翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶、結(jié)合、催化活性、代謝過程等，推測與沙鞭有較強耐逆性有關(guān)。本研究認為進行沙鞭轉(zhuǎn)錄組SSR位點特征分析可為將來沙鞭SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性與親緣關(guān)系探討乃至新基因發(fā)現(xiàn)等提供重要參考依據(jù)。