盧紅梅

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530007）

夜來香又名夜香樹，藥用資源非常豐富。前人在體外抗腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)夜來香提取物具有抗腫瘤作用。目前，對(duì)夜香樹花進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用方面研究較少。本研究旨在探討夜來香花提取物對(duì)肝癌H荷瘤小鼠腫瘤增殖的影響作用，以及對(duì)肝癌H細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，為繼續(xù)研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，數(shù)量60只，雌雄各半，每只體重為18~22 g，購買自右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 細(xì)胞株

肝癌細(xì)胞H購買于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 藥物與試劑

夜來香花提取物（自制），95%乙醇（Ethanol，山東新泰勝源消毒劑有限公司），Rnase（核糖核酸酶，美國(guó)sigma試劑公司），環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司），PI（碘化丙啶，美國(guó)sigma試劑公司），PBS緩沖液（福州飛凈生物科技有限公司）。

1.4 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)RE-2000E，鄭州華特儀器設(shè)備有限公司），電子分析天平（型號(hào)AG135，瑞士產(chǎn)），流式細(xì)胞檢測(cè)儀（型號(hào)Epricsxl，美國(guó)產(chǎn)），離心機(jī)（TDL-50B，上海安亭科學(xué)儀器廠），冷凍干燥機(jī)（ALPHAl-2/LD-Puls，德國(guó)CHRIST公司產(chǎn)），循環(huán)水式真空泵（型號(hào)SHB，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 夜來香花提取物的提取制備

夜來香花采摘于廣西境內(nèi)，曬干，65%乙醇浸泡3天，浸泡液放置在圓底燒瓶中，用回流提取方式提取2次，每次2 h。循環(huán)水式真空泵進(jìn)行減壓抽濾，合并兩次的過濾液，將過濾液進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮得提取物濃稠膏，再用冷凍干燥機(jī)干燥得夜來香花提取物的浸膏粉。稱取浸膏粉，用生理鹽水來溶解和稀釋，設(shè)計(jì)并配制三組等比增大的不同劑量給藥組，小劑量組為160 mg/kg，中劑量組為320 mg/kg，大劑量組為640 mg/kg。

2.2 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立

接種肝癌H細(xì)胞于小鼠腹部，正常喂養(yǎng)，8天后選擇生長(zhǎng)良好的小鼠，腹部用酒精消毒后抽取出腹水，抽出的腹水若有大量紅細(xì)胞或顏色呈黃色時(shí)視為不合格，應(yīng)棄去不用，合格的腹水應(yīng)為無絮狀沉淀的乳白色的濃稠液體。于載玻片上滴一滴腹水，瑞氏染色，鏡下計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞數(shù)量大于95%。再用無菌生理鹽水按1∶4的比例把腹水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，于左前支腋窩皮下每只小鼠接種0.2 mL瘤細(xì)胞懸液。

2.3 對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

一天后，選擇造模成功的荷瘤小鼠60只，按體重把小鼠隨機(jī)并平均分成5組，每組雌雄數(shù)量各占一半，5組分別為陰性對(duì)照組（生理鹽水組）、陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺組）及夜來香花提取物小劑量組、中劑量組、大劑量組。生理鹽水組給予30 mg/kg，環(huán)磷酰胺組給予30 mg/kg（用生理鹽水稀釋），小劑量組給予160 mg/kg、中劑量組給予320 mg/kg、大劑量組給予640 mg/kg夜來香花提取物，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥8天。第9天采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即剝出小鼠右腋下的瘤塊，要求剝離干凈，并稱量瘤塊重量，按下列公式計(jì)算瘤塊抑制率：腫瘤抑制率（%）=（1- 給藥組平均腫瘤重量/空白組平均腫瘤重量）×100%。

2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)儀測(cè)定H22細(xì)胞周期及其凋亡率

稱量瘤塊重量后，每組取瘤塊用剪刀剪碎，制配成H腫瘤細(xì)胞懸液。尼龍網(wǎng)（200目）過濾，離心機(jī)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為每分鐘1500轉(zhuǎn)，共離心2次，每次5 min，瘤細(xì)胞懸液調(diào)配成每升含1.2×10個(gè)的濃度。取0.5 mL瘤細(xì)胞懸液放入70%乙醇（4 ℃、500 μL）中固定。第2天，在4℃和每分鐘1500轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速下離心5 min，去除固定液，加入500 μL PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，每管加 Rnase（5 μL、10 mg/mL），37 ℃水浴25 min，再用200目篩過濾除去粘連細(xì)胞，加入終濃度為50 μg/mL PI染液，溫室中染色約30 min。用FCM測(cè)定H細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的比例和凋亡細(xì)胞。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

夜來香花提取物對(duì)H荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。陽性對(duì)照組和夜來香花提取物的小劑量組、中劑量組、大劑量組與陰性對(duì)照組相比較，抑瘤率均有提高，其中夜來香花提取物的中劑量組、大劑量組腫瘤抑制率分別達(dá)到了40.17%、50.85%，差異非常顯著（均＜0.01），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著給藥量的加大，3個(gè)劑量組對(duì)肝癌H荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)，與劑量呈正相關(guān)。

表1 夜來香花提取物對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

3.2 對(duì)H22細(xì)胞周期和凋亡的影響

夜來香花提取物對(duì)H細(xì)胞周期和凋亡的影響見表2。夜來香花提取物的中劑量組、大劑量組對(duì)肝癌H細(xì)胞周期作用較為明顯。中劑量組的G/G期細(xì)胞從32.3%提高到56.5%，S期細(xì)胞從58.5%下調(diào)到19.0%，G/M期細(xì)胞從9.2%提高到24.5%，其凋亡率為27.8%，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（均＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大劑量組的GG期細(xì)胞從32.3%提高到61.2%，S期細(xì)胞從58.5%下調(diào)到14.9%，G/M期細(xì)胞從9.2%提高到23.9%，其凋亡率也較高，為33.5%，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（均＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G/G期和G/M期的細(xì)胞增多，而S期的減少。

表2 夜來香花提取物對(duì)H22細(xì)胞周期和凋亡的影響

4 討論

目前惡性腫瘤已經(jīng)成為一些地區(qū)人類死亡的主要原因，每年全世界大約有760萬人死于惡性腫瘤。在我國(guó)，惡性腫瘤在死因中排第2位，在城市已排首位。全國(guó)每年大約有新發(fā)病例200萬，死亡150萬人。肝癌在我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率中居第3位，在我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率中居第5位。由于肝癌發(fā)展快，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，病死率很高，近年來發(fā)病率有上升的趨勢(shì)，對(duì)患者危害大，因此探索肝癌的防治方法是當(dāng)前醫(yī)藥研究的重要方向。

根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤抑制率＜40%為無療效；腫瘤抑制率≥40%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異時(shí)，認(rèn)為該藥有一定的療效，實(shí)驗(yàn)需重復(fù)1次以確定療效。本實(shí)驗(yàn)中夜來香花提取物中劑量組、大劑量組抑瘤率分別達(dá)到了40.17%、50.85%，相比陰性對(duì)照組均具有顯著性差異（均＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著給藥量的加大，3個(gè)劑量組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)，與劑量呈正相關(guān)，顯示其對(duì)小鼠肝癌H細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有較好的抑制作用。

細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，是機(jī)體的正常細(xì)胞在受到生理或病理刺激后啟動(dòng)的一種主動(dòng)死亡過程，抗腫瘤藥物作用大多數(shù)通過各種細(xì)胞因子或藥物誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡從而實(shí)現(xiàn)其抑瘤作用。流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果表明，夜來香花提取物中劑量組、大劑量組對(duì)H細(xì)胞周期影響明顯，凋亡率也較高，分別為27.8%、33.5%，與陰性對(duì)照組比較差異顯著（均＜0.05），均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因可能是通過阻斷肝癌H細(xì)胞由G/ G期進(jìn)入S期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，夜來香花提取物抑制小鼠體內(nèi)H細(xì)胞生長(zhǎng)增殖可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為夜香樹花將來的繼續(xù)研究、開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。