張倩文 張 曦 徐小婷 MOHAMMED ISMAIL 江振洲 焦春花 孫麗新

（中國藥科大學，江蘇省藥效研究與評價服務(wù)中心，南京 210009）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要分為兩種類型：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）。IBD 在西方國家具有較高的發(fā)病率和患病率，最新流行病學研究表明，近年亞洲、非洲和南美洲新興工業(yè)化國家 IBD 發(fā)病率呈上升趨勢［1-2］。IBD 表現(xiàn)為結(jié)直腸慢性非特異性炎癥，癥狀主要包括慢性腹瀉、腹痛、體重減輕和血便等，患者需頻繁住院治療，健康和生活質(zhì)量受到嚴重影響，經(jīng)濟負擔較重［3-5］。IBD 的發(fā)病機制仍不清楚，且迄今為止無根治性治療藥物［6-7］。因此，闡明IBD 的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療方法或治療藥物具有重要意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸（tryptophan，Trp）通過腸道菌群代謝生成的吲哚類物質(zhì)在IBD發(fā)病機制與治療中發(fā)揮重要作用［8-10］。因此，闡明吲哚類代謝物變化規(guī)律及病理生理作用對尋找IBD 生物標志物、探索發(fā)病機制、開發(fā)靶點藥物等具有重要意義。本文對Trp 吲哚類代謝物在IBD 中的變化特點、作用機制及藥物研究進展進行綜述，以便更好地了解腸道微生物產(chǎn)生的Trp 吲哚代謝物在改善IBD 方面的作用，為IBD治療和新藥研發(fā)尋找新的方向和突破點。

1 Trp吲哚代謝途徑與IBD

Trp 代謝主要有三條通路：犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）、血清素途徑（serotonin/5-HT pathway）及微生物吲哚代謝途徑（indole pathway）。Trp 及其代謝產(chǎn)物通過免疫、代謝等信號機制雙向影響腸道微生物和腸道組織，最終影響宿主腸道功能。雖然Trp 吲哚代謝途徑僅代謝不到10%Trp，但其在IBD中的作用受到越來越多關(guān)注。

吲哚代謝途徑中，Trp 由含有苯乳酸脫水酶基因簇（fldAIBC）、芳香氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（ArAT）、色氨酸脫羧酶或吲哚乳酸脫氫酶（ILDH）等代謝酶菌株代謝為含吲哚環(huán)的代謝物，如吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、吲哚乳酸（indolelactic acid，ILA）、吲哚-3-醛（indole-3-aldehyde，I3A 或IAld）、吲哚丙酸（indole propionic acid，IPA）、吲哚丙烯酸（indole acrylic acid，IA）等。這些吲哚類代謝物多為芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配體，通過激活AhR或維持腸道黏膜完整性影響腸道免疫穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腸道微生物群平衡影響結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展（表1）。如IAld 可激活AhR 誘導結(jié)腸NKp46+細胞產(chǎn)生IL-22，分泌抗菌肽，防止致病菌感染，改善小鼠結(jié)腸炎［11］；消化鏈球菌編碼fldAIBC 代謝Trp產(chǎn)生IA，減少腸道氧化應(yīng)激，提高微生物適應(yīng)能力［12］。梭狀芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌和厭氧菌胃鏈球菌也可表達fldAIBC 代謝Trp，產(chǎn)生IPA，與孕烷X 受體（prgenane X receptor，PXR）結(jié)合調(diào)節(jié)腸道通透性和炎癥［13］。

表1 吲哚類物質(zhì)在腸道穩(wěn)態(tài)中的作用Tab.1 Function of indoles in intestinal homeostasis

Trp 各代謝途徑相互影響（圖1）。微生物吲哚代謝途徑與犬尿氨酸途徑相互影響，當犬尿氨酸途徑限速酶吲哚胺 2，3-雙加氧酶 1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）缺乏時，腸道細菌優(yōu)先使用Trp產(chǎn)生吲哚化合物；IDO1 過表達時，會抑制吲哚對結(jié)腸上皮細胞系緊密連接完整性的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)激活［14］。AhR 不僅影響小鼠腸道微生物群落，還可調(diào)控IDO1表達和活性［15］；犬尿氨酸也可通過AhR 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［16］。IDO 表達依賴于微生物群，在無菌小鼠中定植腸道共生菌會增加IDO 表達，而犬尿氨酸因具有抗菌性，直接影響腸道菌群增殖［17-18］。另外，腸道菌群影響血清素途徑中5-HT 合成，而5-HT 又可通過調(diào)節(jié)腸道運動和腸道免疫影響菌群組成和定植，菌群組成和定植變化勢必會影響KP 和吲哚途徑［19］。

圖1 Trp 3條代謝通路的聯(lián)系Fig.1 Relationship between three metabolic pathways of Trp

總之，Trp 3 條代謝通路的聯(lián)系是緊密且復雜的，正常情況下處于動態(tài)平衡，但某一環(huán)節(jié)失調(diào)會影響其他代謝環(huán)節(jié)。Trp 微生物代謝途徑不僅能夠維持免疫穩(wěn)態(tài)和屏障完整性，還影響犬尿氨酸途徑和血清素途徑，調(diào)節(jié)宿主局部和整體功能，但具體相互影響機制仍需深入研究。

2 吲哚類物質(zhì)在IBD中發(fā)生的變化

研究發(fā)現(xiàn)，IBD中存在Trp代謝紊亂現(xiàn)象。腸道炎癥中，吲哚類物質(zhì)含量一般會下降，如IPA、IA 及IAA、IAld 及 Indole 等［10，20-21］。ALEXEEV 等［10］通過對吲哚代謝物的定量分析發(fā)現(xiàn)，活動期UC 患者血清中IPA約為20 nmol/L，與健康人相比下降近60%，而緩解期 UC 患者 IPA 含量正常，提示 IPA 既是 UC 活動期的生物標志物，也是UC 緩解期的指標。由于Trp 代謝在病理情況下會受到影響，因此采用Trp 及其代謝物作為生物標志物以支持診斷和預后并確定治療方案具有一定前景，但目前Trp 及其代謝物研究不夠深入，仍不清楚樣本中哪些吲哚衍生物變化與疾病進程特異性相關(guān)；再者個體差異可能會導致較大定量差異，如正常人血清中IPA 含量為50 nmol/L 及1.0 μmol/L，可能影響吲哚代謝物作為IBD生物標志物的臨床應(yīng)用［10，22］。

3 吲哚代謝物在IBD中的作用機制

IBD 患者及腸道炎癥動物模型中常伴隨腸道菌群失調(diào)、致病菌增多、腸道屏障破壞、抗炎/促炎因子失衡、大量炎癥因子釋放、黏膜免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)等現(xiàn)象［23-24］。吲哚代謝物可通過維持黏膜完整性、調(diào)節(jié)腸道免疫、抗氧化應(yīng)激三個方面發(fā)揮腸道保護作用（圖2）。

圖2 吲哚代謝物在IBD中的作用機制Fig.2 Mechanism of indole metabolites in IBD

3.1 維持黏膜屏障完整性 腸道黏膜由單層腸道上皮細胞組成，主要包括腸上皮內(nèi)淋巴細胞（intraepithelial lymphocyte，IELs）、腸內(nèi)分泌細胞、潘氏細胞、杯狀細胞等。其中杯狀細胞分泌黏蛋白構(gòu)成黏液層，阻止細菌入侵，潘氏細胞位于隱窩底部，分泌抗菌肽［25］。此外，相鄰腸上皮細胞間由緊密連接的復合體形成封閉，正常情況下緊密連接成分是動態(tài)調(diào)節(jié)的，但持續(xù)的炎癥或感染可導致屏障破壞和微生物入侵［26］。

腸道黏膜直接接觸菌群刺激，響應(yīng)菌群和代謝物信號分子變化，是腸道微生物及其Trp 代謝物發(fā)揮宿主腸道穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也影響腸道菌群定植和功能。吲哚類物質(zhì)可維持腸道黏膜完整性。早期研究發(fā)現(xiàn)，PXR 和AhR 可作為吲哚類物質(zhì)受體發(fā)揮腸道保護作用。如IAld 通過促進AhR 依賴的IL-22 生成阻止白色念珠菌等致病微生物定殖，改善 DSS 小鼠結(jié)腸炎損傷［11］；IPA 通過激活PXR 下調(diào)炎癥因子TNF-α 水平，上調(diào)緊密連接蛋白水平，改善吲哚美辛誘導的腸道損傷［13］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Trp 代謝物吲哚-3-乙醇（indole-3-ethanol，IEt）、吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvate，IPyA）和I3A激活AhR，抑制肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白Ezrin 和MyosinⅡA 維持緊密連接和黏附連接完整性，降低結(jié)腸炎小鼠腸道通透性［9］。IA 誘導 AhR 靶基因 CYP1A1 表達，且導致杯狀細胞相關(guān)基因分化和表達增加，促進腸上皮屏障功能［12］。此外，吲哚誘導腸上皮細胞結(jié)構(gòu)和功能維護的相關(guān)基因如緊密連接、肌動蛋白細胞骨架、黏蛋白產(chǎn)生等表達［14，27］?？诜o予吲哚導致DSS 小鼠緊密連接蛋白表達增加，改善上皮損傷［28］。另外吲哚作為一種信號分子，可調(diào)節(jié)結(jié)腸L細胞中胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌，腸道微生物群通過吲哚與L細胞溝通并影響宿主代謝［29］。

3.2 調(diào)節(jié)免疫功能 AhR 廣泛存在于腸上皮細胞及免疫細胞，如IELs、Th17細胞、先天淋巴樣細胞（congenital lymphoid cells，ILCs）、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）等，對腸道穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要［30］。吲哚化合物可通過激活AhR 維持腸道免疫應(yīng)答。AhR 激活可抑制ILC2，增強ILC3 功能，平衡腸道 ILC2-ILC3 以保護宿主免受病原體感染［31］。CYP1A1 在 IECs 組成型表達會耗盡 AhR 配體，導致AhR 依賴型ILC3 和Th17 減少，并增加腸道易感性，增加 AhR 配體吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）攝入量可抵消過量AhR 配體降解對腸道免疫功能的有害影響［32］。羅伊氏乳桿菌代謝Trp產(chǎn)生ILA，激活CD4+T 細胞AhR，使Thpok 下調(diào)并分化為免疫調(diào)節(jié) T 細胞（CD4+CD8αα+雙陽性上皮內(nèi) T 細胞，DP IELs）［33］。此外，AhR 激活影響不同細胞因子表達，如 TNF-α、IL-10、IL-17、IL-22、IFN-γ 等［9-11，34-37］。其中，IL-22 級聯(lián)在 IBD 中具有重要臨床意義，IL-22 可促進黏膜愈合，刺激IBD 生物標志物鈣蛋白及不同種類抗菌肽產(chǎn)生，AhR/IL-22/Stat3 信號通路參與腸道菌群對腸道黏膜抗菌分子的調(diào)控［11，37-38］。IPA、IAld 通過 AhR 途徑參與 IL-10R1 在 IEC 中的表達進而維持腸道穩(wěn)態(tài)［10］。

此外，吲哚代謝物通過AhR 調(diào)控Treg 分化，影響 Treg 功能［8，10，39］。吲哚及吲哚衍生物與 AhR 結(jié)合可誘發(fā) Treg 增殖，抑制活化 T 細胞免疫功能［8］。在DSS 小鼠結(jié)腸炎模型中，Trp 吲哚代謝物IAA 和IPA增加可激活AhR，調(diào)節(jié)CD4+T 細胞分化，恢復Th17和 Treg 免疫應(yīng)答［20］。KIM 等［39］研究表明，口服吲哚衍生物3，3′-二吲哚甲烷（DIM）可激活AhR，影響Treg/Th17比例，顯著減少腸道病變。

3.3 抗氧化應(yīng)激 色氨酸及其代謝物對IBD 的抗氧化作用部分由AhR 介導，AhR 的靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1 與 ROS 產(chǎn)生和消除有關(guān)［40］。另外，AhR介導核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）激活，在機體抗氧化防御中起重要作用。NAD（P）H：醌氧化還原酶1［NAD（P）H quinine oxidoreductase，NQO1］、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases，GST）和超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）等均為Nrf2 和 AhR 的靶基因，AhR 或 Nrf2 被激活后入核，與靶基因啟動子中的二噁英反應(yīng)元件和抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，誘導下游靶基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，I3C可激活AhR，減少iNOS、IL-1β和NLRP3等促炎基因表達，提高抗氧化蛋白 NQO1 和 HOX1 水平［41］。ILA可激活腸道上皮細胞AhR 及CYP1A1，激活Nrf2 及NQO1、SOD2 表達以減少炎癥性刺激引起的細胞氧化應(yīng)激［42］。IA 除激活 AhR 外，還特異性激活 Nrf2，在體外LPS誘導的氧化應(yīng)激模型中顯著上調(diào)Nrf2靶基因（如Hmox1、NQO1、Gclm）表達，促進抗氧化和抗炎免疫應(yīng)答［12］。

但近來JI等［43］發(fā)現(xiàn)，IAA顯著改善了RAW264.7細胞中LPS 引起的炎癥反應(yīng)和自由基生成，誘導血紅素加氧酶 1（heme oxygenase 1，HO-1），減少促炎細胞因子IL-1β和IL-6表達，但IAA 對于自由基（NO和ROS）的清除作用是通過直接中和作用的，既不依賴于HO-1也不依賴于AhR。

4 微生物吲哚代謝途徑給IBD 藥物研發(fā)帶來的新思路

Trp 通過腸道菌群代謝為吲哚類物質(zhì)，并通過激活AhR 或PXR 發(fā)揮腸道免疫或腸道黏膜保護作用這一通路可為IBD新藥研發(fā)及中藥機制探索提供新的思路（圖3）。

圖3 微生物吲哚代謝途徑與IBD藥物研發(fā)Fig.3 Microbial indole metabolic pathway and IBD drug development

4.1 發(fā)掘活性單體或模擬吲哚類物質(zhì)開發(fā)新藥從Trp 微生物代謝物中發(fā)掘活性單體或模仿這些天然代謝物結(jié)構(gòu)設(shè)計合成新的分子藥物，針對靶點精準治療是藥物開發(fā)的重要策略。天然代謝物與靶點的親和力通常較低，無法保證直接用于制藥，因此，需要對其結(jié)構(gòu)進行改造。如PXR 作為IBD 治療靶點，其激活發(fā)揮的維持腸道穩(wěn)態(tài)和黏膜完整性的作用已被證實。DVO?áK 等［44］通過開發(fā)FKK6 首次證明模擬微生物代謝物是一種可行的藥物開發(fā)策略。研究者通過觀察PXR殘基與吲哚和IPA的相互作用，基于混合結(jié)構(gòu)方法，采用IPA和吲哚在PXR配體結(jié)合域相互作用改進得到雙吲哚類似物FKK 1~10，其中FKK6 以PXR 依賴方式顯著減輕DSS 小鼠結(jié)腸炎。

AhR 也被確定為IBD 易感性位點的候選基因。AhR 激動劑 6-formylindolo（3，2-b）carbazole（FICZ）激活AhR 誘導IL-22 產(chǎn)生，改善小鼠實驗性結(jié)腸炎［45］。天然AhR配體青黛治療UC患者8周發(fā)現(xiàn)，其對患者的臨床和內(nèi)鏡下黏膜愈合是有效的，但長期使用會導致肺動脈高壓和肝功能障礙等不良反應(yīng)［46］。因此，急需開發(fā)減毒高效的AhR 配體治療IBD?；诖?，MARAFINI 等［47］開發(fā)了 FICZ 結(jié)構(gòu)類似物NPD-0414-2 和NPD-0414-24，這兩種化合物可激活 AhR，降低 IFN-γ 水平，提高 IL-22 水平，減輕TNBS 結(jié)腸炎。因此可通過Trp 代謝物或其模擬物靶向AhR受體實現(xiàn)腸道保護作用。

4.2 發(fā)現(xiàn)藥物作用新機制或發(fā)掘可通過調(diào)節(jié)Trp代謝途徑發(fā)揮腸道保護作用的藥物 一些用于治療IBD 的經(jīng)典中藥可引起Trp 代謝相關(guān)通路變化，表明其可能通過Trp 代謝途徑發(fā)揮IBD 治療作用。長期用于UC 臨床治療的理中湯（LZD）可改變腸道微生物結(jié)構(gòu)及代謝，顯著降低L-Trp 水平，降低炎癥相關(guān)的細菌豐度，提高有益細菌含量，提示微生物群及其代謝產(chǎn)物可能是LZD 改善UC 的潛在靶點［48］。有報道稱，粗糧可降低結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）風險，ZHANG 等［49］探索其分子機制發(fā)現(xiàn)，相較于大米，粗糧谷子攝入可減輕小鼠結(jié)腸炎癥及損傷，增加IPA、IAA 和IA，并激活AhR，調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)趨于正常，降低AOM/DSS 引起的結(jié)腸炎相關(guān)CRC 風險。厚樸酚通過增加IAA、ILA 等Trp代謝物產(chǎn)生激活AhR，對DSS 誘導的小鼠結(jié)腸炎具有抗炎作用［50］。小檗堿能夠逆轉(zhuǎn)DSS造模大鼠的腸道微生物失衡，恢復乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌及擬桿菌水平，增強微生物色氨酸代謝，恢復IAA、IPA和IA至正常水平，觸發(fā)AhR/IL-22信號通路，保護腸道屏障功能［21］。益生菌也被證實可通過調(diào)節(jié)吲哚代謝途徑發(fā)揮腸道保護作用。植物乳桿菌KLDS 1.0386 聯(lián)合Trp 治療DSS 小鼠可提高血清和結(jié)腸中IAA 水平，上調(diào) AhR 水平，激活 IL-22/STAT3 信號通路，增加抗炎細胞因子、緊密連接蛋白和黏蛋白表達，調(diào)節(jié)腸道微生物群組成［51］。另外，給予DSS結(jié)腸炎小鼠多形擬桿菌可增加IAA、IPA，激活AhR 并調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化減輕結(jié)腸炎癥［20］。

5 結(jié)語與展望

當今中國精準醫(yī)療快速推進的背景下，微生物吲哚代謝途徑在IBD治療及新藥研發(fā)中具有新的突破點和曙光。如IBD患者血清中，Trp水平與疾病活性呈負相關(guān)，IPA 也可作為UC 緩解的指標，提示Trp及其代謝物可能成為 IBD 的生物標志物［10，52］。因此，高通量代謝物分析可篩選IBD相關(guān)生物標志物，或可用于IBD診斷和治療。再者，Trp代謝物相關(guān)通路在IBD 發(fā)病機制和靶點方面的深入研究，有助于精準藥物研發(fā)。此外，經(jīng)典中藥通過調(diào)節(jié)Trp 吲哚代謝途徑治療UC 這一新分子機制的發(fā)現(xiàn)，不僅可使研究者對中藥治療IBD 的認識微觀精準，為臨床UC中西結(jié)合給藥方案提供科學依據(jù)，更提示研究者可利用高通量代謝組學分析發(fā)現(xiàn)病癥生物學標志物，實現(xiàn)中醫(yī)藥的客觀精確診斷，推進中醫(yī)藥融入精準醫(yī)療，為中醫(yī)藥發(fā)展注入新的活力。