張倩文 張 曦 徐小婷 MOHAMMED ISMAIL 江振洲 焦春花 孫麗新

（中國藥科大學(xué)，江蘇省藥效研究與評價服務(wù)中心，南京 210009）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要分為兩種類型：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）。IBD 在西方國家具有較高的發(fā)病率和患病率，最新流行病學(xué)研究表明，近年亞洲、非洲和南美洲新興工業(yè)化國家 IBD 發(fā)病率呈上升趨勢［1-2］。IBD 表現(xiàn)為結(jié)直腸慢性非特異性炎癥，癥狀主要包括慢性腹瀉、腹痛、體重減輕和血便等，患者需頻繁住院治療，健康和生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，經(jīng)濟負(fù)擔(dān)較重［3-5］。IBD 的發(fā)病機制仍不清楚，且迄今為止無根治性治療藥物［6-7］。因此，闡明IBD 的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療方法或治療藥物具有重要意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸（tryptophan，Trp）通過腸道菌群代謝生成的吲哚類物質(zhì)在IBD發(fā)病機制與治療中發(fā)揮重要作用［8-10］。因此，闡明吲哚類代謝物變化規(guī)律及病理生理作用對尋找IBD 生物標(biāo)志物、探索發(fā)病機制、開發(fā)靶點藥物等具有重要意義。本文對Trp 吲哚類代謝物在IBD 中的變化特點、作用機制及藥物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以便更好地了解腸道微生物產(chǎn)生的Trp 吲哚代謝物在改善IBD 方面的作用，為IBD治療和新藥研發(fā)尋找新的方向和突破點。

1 Trp吲哚代謝途徑與IBD

Trp 代謝主要有三條通路：犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）、血清素途徑（serotonin/5-HT pathway）及微生物吲哚代謝途徑（indole pathway）。Trp 及其代謝產(chǎn)物通過免疫、代謝等信號機制雙向影響腸道微生物和腸道組織，最終影響宿主腸道功能。雖然Trp 吲哚代謝途徑僅代謝不到10%Trp，但其在IBD中的作用受到越來越多關(guān)注。

吲哚代謝途徑中，Trp 由含有苯乳酸脫水酶基因簇（fldAIBC）、芳香氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（ArAT）、色氨酸脫羧酶或吲哚乳酸脫氫酶（ILDH）等代謝酶菌株代謝為含吲哚環(huán)的代謝物，如吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、吲哚乳酸（indolelactic acid，ILA）、吲哚-3-醛（indole-3-aldehyde，I3A 或IAld）、吲哚丙酸（indole propionic acid，IPA）、吲哚丙烯酸（indole acrylic acid，IA）等。這些吲哚類代謝物多為芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配體，通過激活A(yù)hR或維持腸道黏膜完整性影響腸道免疫穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腸道微生物群平衡影響結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展（表1）。如IAld 可激活A(yù)hR 誘導(dǎo)結(jié)腸NKp46+細(xì)胞產(chǎn)生IL-22，分泌抗菌肽，防止致病菌感染，改善小鼠結(jié)腸炎［11］；消化鏈球菌編碼fldAIBC 代謝Trp產(chǎn)生IA，減少腸道氧化應(yīng)激，提高微生物適應(yīng)能力［12］。梭狀芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌和厭氧菌胃鏈球菌也可表達(dá)fldAIBC 代謝Trp，產(chǎn)生IPA，與孕烷X 受體（prgenane X receptor，PXR）結(jié)合調(diào)節(jié)腸道通透性和炎癥［13］。

表1 吲哚類物質(zhì)在腸道穩(wěn)態(tài)中的作用Tab.1 Function of indoles in intestinal homeostasis

Trp 各代謝途徑相互影響（圖1）。微生物吲哚代謝途徑與犬尿氨酸途徑相互影響，當(dāng)犬尿氨酸途徑限速酶吲哚胺 2，3-雙加氧酶 1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）缺乏時，腸道細(xì)菌優(yōu)先使用Trp產(chǎn)生吲哚化合物；IDO1 過表達(dá)時，會抑制吲哚對結(jié)腸上皮細(xì)胞系緊密連接完整性的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)激活［14］。AhR 不僅影響小鼠腸道微生物群落，還可調(diào)控IDO1表達(dá)和活性［15］；犬尿氨酸也可通過AhR 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［16］。IDO 表達(dá)依賴于微生物群，在無菌小鼠中定植腸道共生菌會增加IDO 表達(dá)，而犬尿氨酸因具有抗菌性，直接影響腸道菌群增殖［17-18］。另外，腸道菌群影響血清素途徑中5-HT 合成，而5-HT 又可通過調(diào)節(jié)腸道運動和腸道免疫影響菌群組成和定植，菌群組成和定植變化勢必會影響KP 和吲哚途徑［19］。

圖1 Trp 3條代謝通路的聯(lián)系Fig.1 Relationship between three metabolic pathways of Trp

總之，Trp 3 條代謝通路的聯(lián)系是緊密且復(fù)雜的，正常情況下處于動態(tài)平衡，但某一環(huán)節(jié)失調(diào)會影響其他代謝環(huán)節(jié)。Trp 微生物代謝途徑不僅能夠維持免疫穩(wěn)態(tài)和屏障完整性，還影響犬尿氨酸途徑和血清素途徑，調(diào)節(jié)宿主局部和整體功能，但具體相互影響機制仍需深入研究。

2 吲哚類物質(zhì)在IBD中發(fā)生的變化

研究發(fā)現(xiàn)，IBD中存在Trp代謝紊亂現(xiàn)象。腸道炎癥中，吲哚類物質(zhì)含量一般會下降，如IPA、IA 及IAA、IAld 及 Indole 等［10，20-21］。ALEXEEV 等［10］通過對吲哚代謝物的定量分析發(fā)現(xiàn)，活動期UC 患者血清中IPA約為20 nmol/L，與健康人相比下降近60%，而緩解期 UC 患者 IPA 含量正常，提示 IPA 既是 UC 活動期的生物標(biāo)志物，也是UC 緩解期的指標(biāo)。由于Trp 代謝在病理情況下會受到影響，因此采用Trp 及其代謝物作為生物標(biāo)志物以支持診斷和預(yù)后并確定治療方案具有一定前景，但目前Trp 及其代謝物研究不夠深入，仍不清楚樣本中哪些吲哚衍生物變化與疾病進(jìn)程特異性相關(guān)；再者個體差異可能會導(dǎo)致較大定量差異，如正常人血清中IPA 含量為50 nmol/L 及1.0 μmol/L，可能影響吲哚代謝物作為IBD生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用［10，22］。

3 吲哚代謝物在IBD中的作用機制

IBD 患者及腸道炎癥動物模型中常伴隨腸道菌群失調(diào)、致病菌增多、腸道屏障破壞、抗炎/促炎因子失衡、大量炎癥因子釋放、黏膜免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)等現(xiàn)象［23-24］。吲哚代謝物可通過維持黏膜完整性、調(diào)節(jié)腸道免疫、抗氧化應(yīng)激三個方面發(fā)揮腸道保護(hù)作用（圖2）。

圖2 吲哚代謝物在IBD中的作用機制Fig.2 Mechanism of indole metabolites in IBD

3.1 維持黏膜屏障完整性 腸道黏膜由單層腸道上皮細(xì)胞組成，主要包括腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocyte，IELs）、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等。其中杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白構(gòu)成黏液層，阻止細(xì)菌入侵，潘氏細(xì)胞位于隱窩底部，分泌抗菌肽［25］。此外，相鄰腸上皮細(xì)胞間由緊密連接的復(fù)合體形成封閉，正常情況下緊密連接成分是動態(tài)調(diào)節(jié)的，但持續(xù)的炎癥或感染可導(dǎo)致屏障破壞和微生物入侵［26］。

腸道黏膜直接接觸菌群刺激，響應(yīng)菌群和代謝物信號分子變化，是腸道微生物及其Trp 代謝物發(fā)揮宿主腸道穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也影響腸道菌群定植和功能。吲哚類物質(zhì)可維持腸道黏膜完整性。早期研究發(fā)現(xiàn)，PXR 和AhR 可作為吲哚類物質(zhì)受體發(fā)揮腸道保護(hù)作用。如IAld 通過促進(jìn)AhR 依賴的IL-22 生成阻止白色念珠菌等致病微生物定殖，改善 DSS 小鼠結(jié)腸炎損傷［11］；IPA 通過激活PXR 下調(diào)炎癥因子TNF-α 水平，上調(diào)緊密連接蛋白水平，改善吲哚美辛誘導(dǎo)的腸道損傷［13］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Trp 代謝物吲哚-3-乙醇（indole-3-ethanol，IEt）、吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvate，IPyA）和I3A激活A(yù)hR，抑制肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白Ezrin 和MyosinⅡA 維持緊密連接和黏附連接完整性，降低結(jié)腸炎小鼠腸道通透性［9］。IA 誘導(dǎo) AhR 靶基因 CYP1A1 表達(dá)，且導(dǎo)致杯狀細(xì)胞相關(guān)基因分化和表達(dá)增加，促進(jìn)腸上皮屏障功能［12］。此外，吲哚誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能維護(hù)的相關(guān)基因如緊密連接、肌動蛋白細(xì)胞骨架、黏蛋白產(chǎn)生等表達(dá)［14，27］?？诜o予吲哚導(dǎo)致DSS 小鼠緊密連接蛋白表達(dá)增加，改善上皮損傷［28］。另外吲哚作為一種信號分子，可調(diào)節(jié)結(jié)腸L細(xì)胞中胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌，腸道微生物群通過吲哚與L細(xì)胞溝通并影響宿主代謝［29］。

3.2 調(diào)節(jié)免疫功能 AhR 廣泛存在于腸上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞，如IELs、Th17細(xì)胞、先天淋巴樣細(xì)胞（congenital lymphoid cells，ILCs）、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DCs）等，對腸道穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要［30］。吲哚化合物可通過激活A(yù)hR 維持腸道免疫應(yīng)答。AhR 激活可抑制ILC2，增強ILC3 功能，平衡腸道 ILC2-ILC3 以保護(hù)宿主免受病原體感染［31］。CYP1A1 在 IECs 組成型表達(dá)會耗盡 AhR 配體，導(dǎo)致AhR 依賴型ILC3 和Th17 減少，并增加腸道易感性，增加 AhR 配體吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）攝入量可抵消過量AhR 配體降解對腸道免疫功能的有害影響［32］。羅伊氏乳桿菌代謝Trp產(chǎn)生ILA，激活CD4+T 細(xì)胞AhR，使Thpok 下調(diào)并分化為免疫調(diào)節(jié) T 細(xì)胞（CD4+CD8αα+雙陽性上皮內(nèi) T 細(xì)胞，DP IELs）［33］。此外，AhR 激活影響不同細(xì)胞因子表達(dá)，如 TNF-α、IL-10、IL-17、IL-22、IFN-γ 等［9-11，34-37］。其中，IL-22 級聯(lián)在 IBD 中具有重要臨床意義，IL-22 可促進(jìn)黏膜愈合，刺激IBD 生物標(biāo)志物鈣蛋白及不同種類抗菌肽產(chǎn)生，AhR/IL-22/Stat3 信號通路參與腸道菌群對腸道黏膜抗菌分子的調(diào)控［11，37-38］。IPA、IAld 通過 AhR 途徑參與 IL-10R1 在 IEC 中的表達(dá)進(jìn)而維持腸道穩(wěn)態(tài)［10］。

此外，吲哚代謝物通過AhR 調(diào)控Treg 分化，影響 Treg 功能［8，10，39］。吲哚及吲哚衍生物與 AhR 結(jié)合可誘發(fā) Treg 增殖，抑制活化 T 細(xì)胞免疫功能［8］。在DSS 小鼠結(jié)腸炎模型中，Trp 吲哚代謝物IAA 和IPA增加可激活A(yù)hR，調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞分化，恢復(fù)Th17和 Treg 免疫應(yīng)答［20］。KIM 等［39］研究表明，口服吲哚衍生物3，3′-二吲哚甲烷（DIM）可激活A(yù)hR，影響Treg/Th17比例，顯著減少腸道病變。

3.3 抗氧化應(yīng)激 色氨酸及其代謝物對IBD 的抗氧化作用部分由AhR 介導(dǎo)，AhR 的靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1 與 ROS 產(chǎn)生和消除有關(guān)［40］。另外，AhR介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）激活，在機體抗氧化防御中起重要作用。NAD（P）H：醌氧化還原酶1［NAD（P）H quinine oxidoreductase，NQO1］、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases，GST）和超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）等均為Nrf2 和 AhR 的靶基因，AhR 或 Nrf2 被激活后入核，與靶基因啟動子中的二噁英反應(yīng)元件和抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游靶基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，I3C可激活A(yù)hR，減少iNOS、IL-1β和NLRP3等促炎基因表達(dá)，提高抗氧化蛋白 NQO1 和 HOX1 水平［41］。ILA可激活腸道上皮細(xì)胞AhR 及CYP1A1，激活Nrf2 及NQO1、SOD2 表達(dá)以減少炎癥性刺激引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激［42］。IA 除激活 AhR 外，還特異性激活 Nrf2，在體外LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中顯著上調(diào)Nrf2靶基因（如Hmox1、NQO1、Gclm）表達(dá)，促進(jìn)抗氧化和抗炎免疫應(yīng)答［12］。

但近來JI等［43］發(fā)現(xiàn)，IAA顯著改善了RAW264.7細(xì)胞中LPS 引起的炎癥反應(yīng)和自由基生成，誘導(dǎo)血紅素加氧酶 1（heme oxygenase 1，HO-1），減少促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6表達(dá)，但I(xiàn)AA 對于自由基（NO和ROS）的清除作用是通過直接中和作用的，既不依賴于HO-1也不依賴于AhR。

4 微生物吲哚代謝途徑給IBD 藥物研發(fā)帶來的新思路

Trp 通過腸道菌群代謝為吲哚類物質(zhì)，并通過激活A(yù)hR 或PXR 發(fā)揮腸道免疫或腸道黏膜保護(hù)作用這一通路可為IBD新藥研發(fā)及中藥機制探索提供新的思路（圖3）。

圖3 微生物吲哚代謝途徑與IBD藥物研發(fā)Fig.3 Microbial indole metabolic pathway and IBD drug development

4.1 發(fā)掘活性單體或模擬吲哚類物質(zhì)開發(fā)新藥從Trp 微生物代謝物中發(fā)掘活性單體或模仿這些天然代謝物結(jié)構(gòu)設(shè)計合成新的分子藥物，針對靶點精準(zhǔn)治療是藥物開發(fā)的重要策略。天然代謝物與靶點的親和力通常較低，無法保證直接用于制藥，因此，需要對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。如PXR 作為IBD 治療靶點，其激活發(fā)揮的維持腸道穩(wěn)態(tài)和黏膜完整性的作用已被證實。DVO?áK 等［44］通過開發(fā)FKK6 首次證明模擬微生物代謝物是一種可行的藥物開發(fā)策略。研究者通過觀察PXR殘基與吲哚和IPA的相互作用，基于混合結(jié)構(gòu)方法，采用IPA和吲哚在PXR配體結(jié)合域相互作用改進(jìn)得到雙吲哚類似物FKK 1~10，其中FKK6 以PXR 依賴方式顯著減輕DSS 小鼠結(jié)腸炎。

AhR 也被確定為IBD 易感性位點的候選基因。AhR 激動劑 6-formylindolo（3，2-b）carbazole（FICZ）激活A(yù)hR 誘導(dǎo)IL-22 產(chǎn)生，改善小鼠實驗性結(jié)腸炎［45］。天然AhR配體青黛治療UC患者8周發(fā)現(xiàn)，其對患者的臨床和內(nèi)鏡下黏膜愈合是有效的，但長期使用會導(dǎo)致肺動脈高壓和肝功能障礙等不良反應(yīng)［46］。因此，急需開發(fā)減毒高效的AhR 配體治療IBD?；诖耍琈ARAFINI 等［47］開發(fā)了 FICZ 結(jié)構(gòu)類似物NPD-0414-2 和NPD-0414-24，這兩種化合物可激活 AhR，降低 IFN-γ 水平，提高 IL-22 水平，減輕TNBS 結(jié)腸炎。因此可通過Trp 代謝物或其模擬物靶向AhR受體實現(xiàn)腸道保護(hù)作用。

4.2 發(fā)現(xiàn)藥物作用新機制或發(fā)掘可通過調(diào)節(jié)Trp代謝途徑發(fā)揮腸道保護(hù)作用的藥物 一些用于治療IBD 的經(jīng)典中藥可引起Trp 代謝相關(guān)通路變化，表明其可能通過Trp 代謝途徑發(fā)揮IBD 治療作用。長期用于UC 臨床治療的理中湯（LZD）可改變腸道微生物結(jié)構(gòu)及代謝，顯著降低L-Trp 水平，降低炎癥相關(guān)的細(xì)菌豐度，提高有益細(xì)菌含量，提示微生物群及其代謝產(chǎn)物可能是LZD 改善UC 的潛在靶點［48］。有報道稱，粗糧可降低結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）風(fēng)險，ZHANG 等［49］探索其分子機制發(fā)現(xiàn)，相較于大米，粗糧谷子攝入可減輕小鼠結(jié)腸炎癥及損傷，增加IPA、IAA 和IA，并激活A(yù)hR，調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)趨于正常，降低AOM/DSS 引起的結(jié)腸炎相關(guān)CRC 風(fēng)險。厚樸酚通過增加IAA、ILA 等Trp代謝物產(chǎn)生激活A(yù)hR，對DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有抗炎作用［50］。小檗堿能夠逆轉(zhuǎn)DSS造模大鼠的腸道微生物失衡，恢復(fù)乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌及擬桿菌水平，增強微生物色氨酸代謝，恢復(fù)IAA、IPA和IA至正常水平，觸發(fā)AhR/IL-22信號通路，保護(hù)腸道屏障功能［21］。益生菌也被證實可通過調(diào)節(jié)吲哚代謝途徑發(fā)揮腸道保護(hù)作用。植物乳桿菌KLDS 1.0386 聯(lián)合Trp 治療DSS 小鼠可提高血清和結(jié)腸中IAA 水平，上調(diào) AhR 水平，激活 IL-22/STAT3 信號通路，增加抗炎細(xì)胞因子、緊密連接蛋白和黏蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道微生物群組成［51］。另外，給予DSS結(jié)腸炎小鼠多形擬桿菌可增加IAA、IPA，激活A(yù)hR 并調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化減輕結(jié)腸炎癥［20］。

5 結(jié)語與展望

當(dāng)今中國精準(zhǔn)醫(yī)療快速推進(jìn)的背景下，微生物吲哚代謝途徑在IBD治療及新藥研發(fā)中具有新的突破點和曙光。如IBD患者血清中，Trp水平與疾病活性呈負(fù)相關(guān)，IPA 也可作為UC 緩解的指標(biāo)，提示Trp及其代謝物可能成為 IBD 的生物標(biāo)志物［10，52］。因此，高通量代謝物分析可篩選IBD相關(guān)生物標(biāo)志物，或可用于IBD診斷和治療。再者，Trp代謝物相關(guān)通路在IBD 發(fā)病機制和靶點方面的深入研究，有助于精準(zhǔn)藥物研發(fā)。此外，經(jīng)典中藥通過調(diào)節(jié)Trp 吲哚代謝途徑治療UC 這一新分子機制的發(fā)現(xiàn)，不僅可使研究者對中藥治療IBD 的認(rèn)識微觀精準(zhǔn)，為臨床UC中西結(jié)合給藥方案提供科學(xué)依據(jù)，更提示研究者可利用高通量代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)病癥生物學(xué)標(biāo)志物，實現(xiàn)中醫(yī)藥的客觀精確診斷，推進(jìn)中醫(yī)藥融入精準(zhǔn)醫(yī)療，為中醫(yī)藥發(fā)展注入新的活力。