臧超然 覃 嶺 劉桂海 孫堅(jiān)萍 李 康 張永宏

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)信息中心，北京 100069）

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的惡性腫瘤，全球新診斷的HCC 病例和病死患者約有50%發(fā)生在我國(guó)［1］。目前HCC 的治療方案包括外科切除、肝臟移植、消融治療、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞、靶向治療、免疫治療等［2］。因?yàn)镠CC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期而失去根治機(jī)會(huì)［3］。免疫治療的興起給很多患者帶來(lái)希望。但由于目前關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展免疫機(jī)制的不明確以及免疫治療相關(guān)研究的欠缺等，免疫治療的療效仍不盡人意，其機(jī)制有待深入研究［4-5］。

腫瘤發(fā)生過(guò)程中，T細(xì)胞發(fā)揮主要清除作用。腫瘤細(xì)胞與T 細(xì)胞相互作用影響HCC 的發(fā)展方向［6］。在免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用下，腫瘤細(xì)胞通過(guò)各種機(jī)制影響T 細(xì)胞的生存及命運(yùn)從而獲得生存機(jī)會(huì)。因此，確定腫瘤特異性T 細(xì)胞并使該T 細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能是控制腫瘤的關(guān)鍵所在。據(jù)此，課題組篩選并使用了5 種在HCC 中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（tumorassociated-antigen，TAA）——婆羅雙樹樣基因-4（SALL4）、黑色素瘤抗原A1（MAGE-A1）、MAGE-A3、紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（NY-ESO-1）、滑膜肉瘤X 斷裂點(diǎn)2（SSX-2）組成抗原肽庫(kù)，檢測(cè)HCC 患者外周血中TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，分析不同HCC患者間T 細(xì)胞的差異，并結(jié)合疾病預(yù)后分析T 細(xì)胞對(duì)疾病進(jìn)展的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究納入原發(fā)性肝癌患者39例，男31例，女8例，平均年齡（55.26±1.31）歲，參照美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)（AASLD）的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷［2］，患者均未接受免疫相關(guān)治療?；颊呔捎媒槿胫委煵㈦S訪，每3~6 個(gè)月行CT 檢查，如發(fā)現(xiàn)肝臟或其他部位出現(xiàn)新發(fā)肝癌病灶，則診斷為治療后復(fù)發(fā)。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；96 孔反應(yīng)板購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）試劑盒購(gòu)自瑞典 Mabtech 公司；CD3 抗體（克?。篠K7）、PD1 抗體（克?。篍H12.2H7）購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司；CD4 抗體（克?。篗-T477）、CD8 抗體（克?。篠K1）、CD45RA 抗體（克?。篐I100）、CCR7 抗體（克?。?50503）、CD27 抗體（克隆：M-T271）、CD152抗體（克?。築NI3）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肽庫(kù)的合成 以蛋白文庫(kù)中SALL4、SSX2、MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1 蛋白序列為模板，合成18 個(gè)氨基酸長(zhǎng)、10 個(gè)氨基酸重疊的多肽片段259 條，并制成7 個(gè)反應(yīng)肽庫(kù)，各肽庫(kù)所包含的肽段如表1所示。

表1 7個(gè)肽庫(kù)的肽段序列Tab.1 Peptide sequences of seven peptide pools

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離 以EDTA抗凝管留取肝癌患者外周血，采用密度梯度離心法分離得到PBMC［7］，取適量用于 ELISPOT 實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞凍存于液氮中。

1.2.3 ELISPOT 上述采用密度梯度離心法分離得到的PBMC 經(jīng)計(jì)數(shù)后，采用TAA 肽庫(kù)刺激，檢驗(yàn)IFN-γ 分泌情況。試劑采用 IFN-γ 酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫分析試劑盒，數(shù)據(jù)處理采用ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為每孔斑點(diǎn)數(shù)-背景斑點(diǎn)數(shù)≥25個(gè)且＞2 倍的背景斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果采用單位斑點(diǎn)形成數(shù)/106單個(gè)核細(xì)胞（SFU/106PBMC）表示。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 將凍存的PBMC 復(fù)蘇，收集約1×106個(gè)細(xì)胞，以100 μl PBS 重懸。根據(jù)抗體說(shuō)明書要求加入適量熒光標(biāo)記抗體，4 ℃避光孵育20 min。PBS 洗滌 2 次，重懸于 500 μl 細(xì)胞固定液中用于流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，兩組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)［M（Q1，Q3）］表示，采用秩和檢驗(yàn)。治療后生存分析采用Kaplan-Meier Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng) 入組患者中有17例對(duì)任何TAA 均未出現(xiàn)特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，陰性反應(yīng)率為43.59%（17/39），22例患者的PBMC 至少能識(shí)別其中1 種TAA，陽(yáng)性反應(yīng)率為56.41%（22/39）。就目前所覆蓋的腫瘤相關(guān)抗原，僅有約半數(shù)患者的外周循環(huán)中存在特異性T細(xì)胞。

2.2 TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)不同患者間的預(yù)后分析 所有HCC 患者根據(jù)不同病情均接受介入治療，其中接受消融治療并達(dá)到完全消融目的的患者有27例。對(duì)達(dá)到完全消融目的的患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為0~32 個(gè)月，隨訪CT 發(fā)現(xiàn)新發(fā)灶為隨訪終點(diǎn)。生存分析顯示，TAA 特異性T 細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期優(yōu)于TAA特異性T細(xì)胞反應(yīng)陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性和陰性患者的生存分析Fig.1 Survival analysis of patients with positive and negative TAA-specific T cell immune response

2.3 不同TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)患者間T 細(xì)胞分化表型的差異 對(duì)外周血T 細(xì)胞的分化表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：TAA特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性患者外周血中CD4+和CD8+的TTE（terminal effector T cell，CD27-CD45RA+CCR7-）細(xì)胞百分比高于TAA 特異性T 細(xì)胞反應(yīng)陰性患者［CD4：0.83%（0.34%，1.33%）vs0.36%（0.24%，0.58%），P=0.02；CD8：7.57%（3.46%，11.29%）vs4.76%（2.42%，6.77%），P=0.03］，且TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性患者的CD4+TEM（effector memory T cell，CD27-CD45RA-CCR7-）顯著高于陰性患者［8.94%（6.30%，16.56%）vs6.32%（4.38%，11.77%），P=0.04］（圖2）。提示該部分患者中效應(yīng)階段T細(xì)胞水平較高，有利于針對(duì)并及時(shí)消滅靶細(xì)胞。

圖2 TAA特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性和陰性患者的T細(xì)胞分化表型分析Fig.2 Differentiation phenotypic analysis of T cells in patients with and without TAA-specific T cell immune response

2.4 TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性患者免疫檢查點(diǎn)水平的表達(dá)差異 在外周循環(huán)能夠檢測(cè)到TAA 特異性 T 細(xì)胞的 22例 HCC 患者中，疾病早期（BCLC-0/A）患者 14例，進(jìn)展期（BCLC-B/C）患者8例。對(duì)這 22例患者 PBMC 的免疫檢查點(diǎn) PD-1 和CD152 表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：早期患者的CD8+PD1+T 細(xì)胞百分比為（27.66±2.64）%，進(jìn)展期患者的CD8+PD1+T 細(xì)胞百分比為（40.65±4.39）%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.71，P=0.01）；早期患者的 CD8+CD152+T 細(xì)胞百分比為（11.84±0.89）%，進(jìn)展期患者的CD8+CD152+T細(xì)胞百分比為（17.96±1.72）%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.51，P＜0.01，圖3）。早期和進(jìn)展期患者間CD4+T細(xì)胞比例未見明顯差異。提示進(jìn)展期患者的耗竭性細(xì)胞毒性T細(xì)胞比例顯著增高。

圖3 TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性的早期和進(jìn)展期HCC患者耗竭性CD8+T細(xì)胞水平的比較Fig.3 Comparison of exhausted CD8+T cell levels in early and advanced HCC patients with positive TAA-specific T cell immune response

3 討論

近年來(lái)，腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究取得了重大進(jìn)展，許多免疫治療方法已被應(yīng)用于臨床，尤其是各種致力于改善和恢復(fù) T 細(xì)胞功能的免疫療法［4-5，8-10］。腫瘤進(jìn)展的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制也在被一步步深入探索并逐漸揭示。但我國(guó)HCC 人群T 細(xì)胞特點(diǎn)的數(shù)據(jù)較少，限制了基于我國(guó)人群的肝癌免疫治療發(fā)展［11-12］。

T 細(xì)胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中負(fù)責(zé)消滅惡性細(xì)胞的主要力量。T 細(xì)胞識(shí)別并消滅腫瘤細(xì)胞的過(guò)程稱為“腫瘤免疫循環(huán)”［13］，但由于腫瘤細(xì)胞的惡化過(guò)程可通過(guò)各種機(jī)制逃避“腫瘤免疫循環(huán)”的殺傷并獲得生存，使該循環(huán)過(guò)程在各個(gè)環(huán)節(jié)被改變，從而影響T細(xì)胞殺滅靶細(xì)胞功能。其中最直接的作用就是影響并改變T 細(xì)胞。從最初的初始T 細(xì)胞分化為最終的特異性效應(yīng)性T 細(xì)胞的過(guò)程中，T 細(xì)胞的狀態(tài)和功能發(fā)生顯著轉(zhuǎn)變［14］。在這一過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與T 細(xì)胞間的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致T 細(xì)胞效應(yīng)功能減弱甚至喪失，如免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓源抑制性細(xì)胞等負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞，抑制了T細(xì)胞效應(yīng)功能的執(zhí)行［15-20］。

本研究顯示，半數(shù)以上HCC 患者的外周循環(huán)中可檢測(cè)到TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，表明特異性T 細(xì)胞的存在。這些T 細(xì)胞能夠監(jiān)視并作用于循環(huán)中存在的腫瘤細(xì)胞，有利于及時(shí)消滅微小的循環(huán)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，本研究結(jié)果也顯示TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期優(yōu)于TAA特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陰性患者，證明了TAA 特異性T 細(xì)胞能夠延緩腫瘤的出現(xiàn)，并發(fā)揮保護(hù)作用。因此誘導(dǎo)產(chǎn)生和維持特異性T 細(xì)胞對(duì)于控制腫瘤、改善患者預(yù)后意義重大。進(jìn)一步分析患者外周T細(xì)胞分化表型，結(jié)果顯示，TAA特異性T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性患者外周循環(huán)中效應(yīng)功能性CD4+/CD8+T 細(xì)胞水平顯著高于陰性患者，且CD4+T 細(xì)胞可能在T 細(xì)胞清除腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［21］。TAA 特異性T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性患者CD4+T 細(xì)胞中TEM 百分比顯著高于陰性患者，CD4+T 細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞毒性T 細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能的輔助必不可少，基于TEM 的增殖特性，有利于維持CD4+T 細(xì)胞的輔助作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然TAA 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性患者的效應(yīng)性T細(xì)胞的水平相對(duì)較高，但伴隨腫瘤進(jìn)展，免疫檢查點(diǎn)PD-1、CD152 的表達(dá)百分比也顯著增高，表明腫瘤的進(jìn)展會(huì)限制T 細(xì)胞效應(yīng)功能的發(fā)揮，使更多T細(xì)胞逐漸進(jìn)入功能抑制狀態(tài)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的逃逸和疾病的進(jìn)展。

因此，腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞是控制腫瘤的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞在與免疫細(xì)胞的博弈過(guò)程中進(jìn)化出各種機(jī)制誘導(dǎo)T 細(xì)胞向失能狀態(tài)轉(zhuǎn)變：識(shí)別腫瘤細(xì)胞的功能性T細(xì)胞的減少、誘導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)等。本研究結(jié)果提示：誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)性的特異性T細(xì)胞、阻斷免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)是控制HCC 的重要途徑。因此，腫瘤疫苗的研究和應(yīng)用、嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等方法的合理整合，在產(chǎn)生精準(zhǔn)靶向腫瘤的T細(xì)胞的同時(shí)避免了免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)，使靶向性T 細(xì)胞維持功能，可能會(huì)為HCC的免疫治療帶來(lái)更好的療效。