劉成華 劉 玉 馮健男 沈倍奮 楊 光 （軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，金葡菌）是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，同時(shí)也是一種引起人和動(dòng)物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎以及敗血癥、膿毒敗血癥等的重要致病菌［1］。腸毒素（Staphyloccucalenterotoxins，SEs）是由葡萄球菌分泌的細(xì)菌外毒素，目前已報(bào)道的有 SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG 等 20多種血清型，共稱為葡萄球SE 超抗原，是細(xì)菌性食物中毒、化膿性感染、院內(nèi)感染的重要毒素［2-9］。其中SEB 因其超抗原特性以及在中毒性休克綜合征（SEB induced lethal shock，SEBILS）發(fā)病中的特殊意義而備受關(guān)注［10-11］。

SEB 是一種超抗原，極低劑量即可高效刺激哺乳動(dòng)物及人的T 細(xì)胞增殖，并促使其釋放多種細(xì)胞因子和產(chǎn)生細(xì)胞毒作用［12-13］。人體感染SEB 后，可引起呼吸困難、胸痛、嚴(yán)重者可造成發(fā)熱、肺水腫、急性呼吸窘迫征、中毒性休克、多臟器的衰竭甚至死亡［14］。當(dāng)前針對(duì) SEB 誘導(dǎo)的 SEBILS 尚無(wú)非常有效的防治手段，靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIg）可緩解 SEB 誘導(dǎo)的炎性疾病的癥狀，但是IVIg 中特異性抗體含量低，副反應(yīng)大并且有引起血源性病原體感染的危險(xiǎn)［15］，多個(gè)研究小組已證實(shí)單克隆抗體對(duì)SEBILS 具有一定的中和保護(hù)作用［16-20］，但其保護(hù)功能并不理想，因此開發(fā)一種新型的高效的抗SEB抗體是目前SEB防治領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料 金葡菌COL、大腸桿菌TG1、表達(dá)載體pET-28a（+）、pCDNA3.1、全人源 naive Fab 抗體庫(kù)、M13KO7 為本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（賽百盛）；原核表達(dá)載體pMD-19T、限制性內(nèi)切酶（NdeⅠ、XhoⅠ）（TaKaRa）；質(zhì)粒提取、膠回收試劑 盒（Sango）；T4 DNA 連 接 酶 、DNA 聚 合 酶 、Trans2K plus DNA標(biāo)志物、大腸桿菌感受態(tài)DH5α及BL21（DE3）（TransGen Biotech）；低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)（上海生化所）；Ni Sepharose 6 Fast Flow 純化柱 、CNBr-activated SepharoseTM4B 親 和 樹 脂（GE Healthcare）；Anti-His（Mouse）單克隆抗體、Goat Anti-Mouse IgG/HRP（中杉金橋）；anti-M13 抗體（義翹神州）；PEG8000（Sigma）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；SPF級(jí)BALB/c純系雌性實(shí)驗(yàn)小鼠（維通利華）。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-SEB 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以金葡菌COL基因組為模板，PCR 擴(kuò)增seb，PCR 條件如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增片段大小為720 bp；利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ將得到的seb基因片段雙酶切后連接至pET-28a 載體，轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR 及測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆。

1.2.2 重組SEB 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取pET28a-SEB-BL21單克隆，接種至LB培養(yǎng)基（Kana+），37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；第 2 天轉(zhuǎn)接，OD600nm=0.6 時(shí)加入IPTG（0.05 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，離心收集菌體；加入結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Na3PO4，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=7.4）重懸菌體，超聲破碎，收集上清進(jìn)行Ni2+柱純化，收集洗脫液；洗脫液用PBS透析后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.3 SEBILS 模型檢測(cè)重組 SEB 活性 8 周齡BALB/c 雌性小鼠24 只，隨機(jī)分成3 組；腹腔注射致敏劑 D-GlaN 20 mg/只；30 min 后，腹腔注射重組SEB，72 h 內(nèi)觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.2.4 抗SEB 單克隆抗體的生物淘選 包被重組SEB 蛋白（10 μg/ml，500 μl）4 ℃過(guò)夜后，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入噬菌體抗體庫(kù)（噬菌體投入量約為 1.2×1012PFU），室溫結(jié)合 1 h，PBS 洗滌 20 次后，加入 500 μl pH=2.2、0.1 mol/L 的 Gly-HCl 洗脫phage-Abs，收集洗脫液并用1.5 mol/L 的Tris-HCl（pH=8.8）中和至 pH=7.4；將 TG1 培養(yǎng)至 OD600nm=0.6 時(shí)，加入收集的洗脫液37 ℃感染30 min 后，4 000 r/min 離心15 min，菌體涂布于2YTAG平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；將過(guò)夜菌接種于2YTAG培養(yǎng)基中加入M13KO7輔助噬菌體進(jìn)行噬菌體展示，采用PEG/NaCl沉淀，得到淘選后的噬菌體；3輪淘選后進(jìn)行單克隆鑒定。

1.2.5 抗SEB 單克隆抗體陽(yáng)性克隆的篩選 挑取淘選后的單克隆，接種于2YTAG 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，第2天轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600nm=0.6，加入5×109PFU M13KO7，37 ℃感染30 min后離心收集沉淀，1 ml 2YTAK 重懸，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行phage-ELISA 鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 抗SEB 全人源單克隆抗體的制備 將載體pCDNA3.1 的NdeⅠ和SalⅠ識(shí)別序列間的小片段分別替換為抗SEB 單克隆抗體VL、VHDNA 小片段，分別得到輕、重鏈表達(dá)載體。將構(gòu)建好的輕、重鏈表達(dá)載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293E細(xì)胞，進(jìn)行全抗體分泌表達(dá)，經(jīng)過(guò)Protein A 純化，超濾濃縮后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2。

1.2.7 SPR 測(cè)定YG11-1、YG11-2 的親和力 芯片CM5偶聯(lián)抗人Fc段抗體，將YG11-1、YG11-2分別稀釋至 0.5 μg/ml，保證約 100 RU 抗體被抗人 Fc 的抗體捕獲。將不同濃度SEB 重組蛋白流經(jīng)固定相表面，分別測(cè)定YG11-1、YG11-2的親和力。

1.2.8 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 結(jié)合活性檢測(cè) 收集金葡菌COL培養(yǎng)上清，SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉后，分別與YG11-1、YG11-2（1 μg/ml）4 ℃結(jié)合過(guò)夜，TBST 洗滌 4 次后加入 Goat Anti-Mouse IgG/HRP 室溫孵育 30 min，TBST洗滌4 次后進(jìn)行HRP-ECL 發(fā)光鑒定，利用X 膠片顯影定影。

1.2.9 小鼠致死性休克模型檢測(cè)YG11-1、YG11-2的中和活性 BALB/c 雌性小鼠40 只（鼠齡8 周）隨機(jī)分成5組；腹腔注射致敏劑D-GlaN，20 mg/只；30 min后腹腔注射蛋白及抗體混合物樣品，0.4 ml/只（其中重組SEB 20 μg），72 h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行作圖，Log-rank（Mantel-Cox）Test 分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SEB 蛋白的重組表達(dá) 以COL基因組為模板擴(kuò)增獲得seb基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，約720 bp 處獲得目的條帶（圖1A），繼而將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆至pET-28a 載體。挑取pET-28a-SEB 陽(yáng)性克隆，IPTG 誘導(dǎo)并超聲處理，利用Ni2+柱純化，最終獲得重組SEB蛋白（圖1B）。

圖1 SEB蛋白的重組表達(dá)Fig.1 Preparation of recombinant SEB protein

2.2 SEBILS 模型檢測(cè)重組SEB 活性 將小鼠隨機(jī)分組后，腹腔注射致敏劑D-GlaN 及重組SEB 蛋白，觀察各組小鼠72 h 內(nèi)的死亡情況（圖2）。如圖所示，SEB的完全致死劑量為20 μg。

圖2 SEBILS模型檢測(cè)重組SEB活性Fig.2 Recombinant SEB activity was detected in mouse model of SEBILS

2.3 抗SEB 單克隆抗體的篩選 經(jīng)過(guò)3 輪淘選后挑取所得的噬菌體單克隆進(jìn)行ELISA 鑒定，并挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序。結(jié)果顯示，陽(yáng)性率為89.8%（圖3）。選取OD450nm值較高的10 個(gè)克隆送測(cè)序，獲得2 組抗體序列，且兩組抗體VH相同，分別命名為YG11-1、YG11-2。

圖3 抗SEB單克隆抗體陽(yáng)性克隆鑒定Fig.3 Detection of positive clones of anti-SEB

2.4 YG11-1、YG11-2 的 制 備 PCR 分 別 擴(kuò) 增YG11-1、YG11-2 的 VH、VL片 段 ，并 將 其 連 接 至pCDNA3.1，分別得到輕、重鏈表達(dá)載體，將其共轉(zhuǎn)染至293E 細(xì)胞后，進(jìn)行全抗體分泌表達(dá)，經(jīng)過(guò)Protein A純化，PBS超濾后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2（圖 4）。

圖4 YG11-1、YG11-2的制備Fig.4 Preparation of YG11-1 and YG11-2

2.5 YG11-1、YG11-2 的親和力測(cè)定 利用表面等離子共振技術(shù)分別檢測(cè)YG11-1、YG11-2 的親和力。測(cè)定不同濃度的2 株全人源單克隆抗體（YG11-1，YG11-2）與抗原之間相互作用響應(yīng)值，利用軟件Biacore X100 Evaluation Software，version 2.0.1 對(duì)其相應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，測(cè)得YG11-1、YG11-2 的親和常數(shù)如表1所示。

表1 SPR測(cè)定YG11-1、YG11-2的親和力Tab.1 SPR determinations of affinity of YG11-1 and YG11-2

2.6 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結(jié)合活性檢測(cè) 利用YG11-1、YG11-2 抗體檢測(cè)金葡菌COL培養(yǎng)上清中天然的SEB 蛋白。結(jié)果顯示YG11-1、YG11-2 抗體能夠特異性識(shí)別COL培養(yǎng)上清中分泌的SEB蛋白（圖5）。

圖5 Western blot 檢測(cè) YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結(jié)合Fig.5 Binding activity of YG11-1 and YG11-2 to natural SEB protein was detected by Western blot

2.7 YG11-1、YG11-2對(duì)SEBILS小鼠的保護(hù)作用將小鼠隨機(jī)分組后，對(duì)SEBILS模型小鼠分別腹腔注射不同劑量的YG11-1、YG11-2，觀察并記錄72 h 內(nèi)各組小鼠的死亡情況。如圖6 所示，YG11-1 200 μg組小鼠存活率有所提高，而YG11-2 200 μg 組小鼠存活率高達(dá)100%，表明YG11-2 可有效提高SEBILS模型中小鼠存活率。

圖6 YG11-1、YG11-2對(duì)SEBILS小鼠的保護(hù)作用Fig.6 Protection of YG11-1 and YG11-2 in mouse model of SEBILS

3 討論

本研究成功構(gòu)建了pET-28a-SEB 重組表達(dá)載體，表達(dá)并純化金葡菌重組蛋白SEB，并利用噬菌體抗體庫(kù)篩選出具有較高親和力的抗SEB 單克隆人源抗體YG11-1、YG11-2。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，YG11-1、YG11-2 均能提高SEBILS 小鼠模型的存活率，并且YG11-2 能夠達(dá)到100%保護(hù)率。本研究獲得的兩株全人源抗體具有相同的VH，但其中和活性具有顯著差異，表明抗體的VL對(duì)其中和活性具有重要影響。

目前針對(duì)人體SEB 誘導(dǎo)的中毒性休克尚無(wú)有效的防治方法。靜脈輸注混合人體血清在一定程度上能緩解癥狀，但由于其來(lái)源的局限性和效果的不穩(wěn)定性，它的應(yīng)用受到很大限制［21-22］。已有研究表明單克隆抗體對(duì)SEBILS具有一定的保護(hù)作用，但也只能達(dá)到部分的保護(hù)效果，且Anti-SEB 多為鼠源單抗［12，23］。本研究利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成功篩選并制備了對(duì)SEB 具有較高親和力并且具有特異性中和作用的全人源單克隆抗體YG11-1、YG11-2，且YG11-2 可達(dá)到100%的保護(hù)效果，為SEB 的防治提供了新的選擇。