亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        金黃色葡萄球菌腸毒素B的中和性全人源抗體制備①

        2022-08-30 02:47:56劉成華馮健男沈倍奮軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所北京100850
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年12期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        劉成華 劉 玉 馮健男 沈倍奮 楊 光 (軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,北京 100850)

        金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是造成人類食物中毒的常見致病菌之一,同時(shí)也是一種引起人和動(dòng)物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎以及敗血癥、膿毒敗血癥等的重要致病菌[1]。腸毒素(Staphyloccucalenterotoxins,SEs)是由葡萄球菌分泌的細(xì)菌外毒素,目前已報(bào)道的有 SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG 等 20多種血清型,共稱為葡萄球SE 超抗原,是細(xì)菌性食物中毒、化膿性感染、院內(nèi)感染的重要毒素[2-9]。其中SEB 因其超抗原特性以及在中毒性休克綜合征(SEB induced lethal shock,SEBILS)發(fā)病中的特殊意義而備受關(guān)注[10-11]。

        SEB 是一種超抗原,極低劑量即可高效刺激哺乳動(dòng)物及人的T 細(xì)胞增殖,并促使其釋放多種細(xì)胞因子和產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[12-13]。人體感染SEB 后,可引起呼吸困難、胸痛、嚴(yán)重者可造成發(fā)熱、肺水腫、急性呼吸窘迫征、中毒性休克、多臟器的衰竭甚至死亡[14]。當(dāng)前針對(duì) SEB 誘導(dǎo)的 SEBILS 尚無(wú)非常有效的防治手段,靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIg)可緩解 SEB 誘導(dǎo)的炎性疾病的癥狀,但是IVIg 中特異性抗體含量低,副反應(yīng)大并且有引起血源性病原體感染的危險(xiǎn)[15],多個(gè)研究小組已證實(shí)單克隆抗體對(duì)SEBILS 具有一定的中和保護(hù)作用[16-20],但其保護(hù)功能并不理想,因此開發(fā)一種新型的高效的抗SEB抗體是目前SEB防治領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

        1 材料與方法

        1.1 材料 金葡菌COL、大腸桿菌TG1、表達(dá)載體pET-28a(+)、pCDNA3.1、全人源 naive Fab 抗體庫(kù)、M13KO7 為本實(shí)驗(yàn)室保存;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(賽百盛);原核表達(dá)載體pMD-19T、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)(TaKaRa);質(zhì)粒提取、膠回收試劑 盒(Sango);T4 DNA 連 接 酶 、DNA 聚 合 酶 、Trans2K plus DNA標(biāo)志物、大腸桿菌感受態(tài)DH5α及BL21(DE3)(TransGen Biotech);低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(上海生化所);Ni Sepharose 6 Fast Flow 純化柱 、CNBr-activated SepharoseTM4B 親 和 樹 脂(GE Healthcare);Anti-His(Mouse)單克隆抗體、Goat Anti-Mouse IgG/HRP(中杉金橋);anti-M13 抗體(義翹神州);PEG8000(Sigma);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;SPF級(jí)BALB/c純系雌性實(shí)驗(yàn)小鼠(維通利華)。

        1.2 方法

        1.2.1 pET-28a-SEB 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以金葡菌COL基因組為模板,PCR 擴(kuò)增seb,PCR 條件如下:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,60 s;35個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min。擴(kuò)增片段大小為720 bp;利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ將得到的seb基因片段雙酶切后連接至pET-28a 載體,轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌落PCR 及測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆。

        1.2.2 重組SEB 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取pET28a-SEB-BL21單克隆,接種至LB培養(yǎng)基(Kana+),37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜;第 2 天轉(zhuǎn)接,OD600nm=0.6 時(shí)加入IPTG(0.05 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)5 h,離心收集菌體;加入結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Na3PO4,0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑,pH=7.4)重懸菌體,超聲破碎,收集上清進(jìn)行Ni2+柱純化,收集洗脫液;洗脫液用PBS透析后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

        1.2.3 SEBILS 模型檢測(cè)重組 SEB 活性 8 周齡BALB/c 雌性小鼠24 只,隨機(jī)分成3 組;腹腔注射致敏劑 D-GlaN 20 mg/只;30 min 后,腹腔注射重組SEB,72 h 內(nèi)觀察并記錄小鼠的存活情況。

        1.2.4 抗SEB 單克隆抗體的生物淘選 包被重組SEB 蛋白(10 μg/ml,500 μl)4 ℃過(guò)夜后,5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入噬菌體抗體庫(kù)(噬菌體投入量約為 1.2×1012PFU),室溫結(jié)合 1 h,PBS 洗滌 20 次后,加入 500 μl pH=2.2、0.1 mol/L 的 Gly-HCl 洗脫phage-Abs,收集洗脫液并用1.5 mol/L 的Tris-HCl(pH=8.8)中和至 pH=7.4;將 TG1 培養(yǎng)至 OD600nm=0.6 時(shí),加入收集的洗脫液37 ℃感染30 min 后,4 000 r/min 離心15 min,菌體涂布于2YTAG平板上,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜;將過(guò)夜菌接種于2YTAG培養(yǎng)基中加入M13KO7輔助噬菌體進(jìn)行噬菌體展示,采用PEG/NaCl沉淀,得到淘選后的噬菌體;3輪淘選后進(jìn)行單克隆鑒定。

        1.2.5 抗SEB 單克隆抗體陽(yáng)性克隆的篩選 挑取淘選后的單克隆,接種于2YTAG 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,第2天轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600nm=0.6,加入5×109PFU M13KO7,37 ℃感染30 min后離心收集沉淀,1 ml 2YTAK 重懸,28 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行phage-ELISA 鑒定陽(yáng)性克隆,并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

        1.2.6 抗SEB 全人源單克隆抗體的制備 將載體pCDNA3.1 的NdeⅠ和SalⅠ識(shí)別序列間的小片段分別替換為抗SEB 單克隆抗體VL、VHDNA 小片段,分別得到輕、重鏈表達(dá)載體。將構(gòu)建好的輕、重鏈表達(dá)載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293E細(xì)胞,進(jìn)行全抗體分泌表達(dá),經(jīng)過(guò)Protein A 純化,超濾濃縮后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2。

        1.2.7 SPR 測(cè)定YG11-1、YG11-2 的親和力 芯片CM5偶聯(lián)抗人Fc段抗體,將YG11-1、YG11-2分別稀釋至 0.5 μg/ml,保證約 100 RU 抗體被抗人 Fc 的抗體捕獲。將不同濃度SEB 重組蛋白流經(jīng)固定相表面,分別測(cè)定YG11-1、YG11-2的親和力。

        1.2.8 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 結(jié)合活性檢測(cè) 收集金葡菌COL培養(yǎng)上清,SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉后,分別與YG11-1、YG11-2(1 μg/ml)4 ℃結(jié)合過(guò)夜,TBST 洗滌 4 次后加入 Goat Anti-Mouse IgG/HRP 室溫孵育 30 min,TBST洗滌4 次后進(jìn)行HRP-ECL 發(fā)光鑒定,利用X 膠片顯影定影。

        1.2.9 小鼠致死性休克模型檢測(cè)YG11-1、YG11-2的中和活性 BALB/c 雌性小鼠40 只(鼠齡8 周)隨機(jī)分成5組;腹腔注射致敏劑D-GlaN,20 mg/只;30 min后腹腔注射蛋白及抗體混合物樣品,0.4 ml/只(其中重組SEB 20 μg),72 h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行作圖,Log-rank(Mantel-Cox)Test 分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

        2 結(jié)果

        2.1 SEB 蛋白的重組表達(dá) 以COL基因組為模板擴(kuò)增獲得seb基因,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,約720 bp 處獲得目的條帶(圖1A),繼而將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆至pET-28a 載體。挑取pET-28a-SEB 陽(yáng)性克隆,IPTG 誘導(dǎo)并超聲處理,利用Ni2+柱純化,最終獲得重組SEB蛋白(圖1B)。

        圖1 SEB蛋白的重組表達(dá)Fig.1 Preparation of recombinant SEB protein

        2.2 SEBILS 模型檢測(cè)重組SEB 活性 將小鼠隨機(jī)分組后,腹腔注射致敏劑D-GlaN 及重組SEB 蛋白,觀察各組小鼠72 h 內(nèi)的死亡情況(圖2)。如圖所示,SEB的完全致死劑量為20 μg。

        圖2 SEBILS模型檢測(cè)重組SEB活性Fig.2 Recombinant SEB activity was detected in mouse model of SEBILS

        2.3 抗SEB 單克隆抗體的篩選 經(jīng)過(guò)3 輪淘選后挑取所得的噬菌體單克隆進(jìn)行ELISA 鑒定,并挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序。結(jié)果顯示,陽(yáng)性率為89.8%(圖3)。選取OD450nm值較高的10 個(gè)克隆送測(cè)序,獲得2 組抗體序列,且兩組抗體VH相同,分別命名為YG11-1、YG11-2。

        圖3 抗SEB單克隆抗體陽(yáng)性克隆鑒定Fig.3 Detection of positive clones of anti-SEB

        2.4 YG11-1、YG11-2 的 制 備 PCR 分 別 擴(kuò) 增YG11-1、YG11-2 的 VH、VL片 段 ,并 將 其 連 接 至pCDNA3.1,分別得到輕、重鏈表達(dá)載體,將其共轉(zhuǎn)染至293E 細(xì)胞后,進(jìn)行全抗體分泌表達(dá),經(jīng)過(guò)Protein A純化,PBS超濾后獲得全抗體蛋白YG11-1、YG11-2(圖 4)。

        圖4 YG11-1、YG11-2的制備Fig.4 Preparation of YG11-1 and YG11-2

        2.5 YG11-1、YG11-2 的親和力測(cè)定 利用表面等離子共振技術(shù)分別檢測(cè)YG11-1、YG11-2 的親和力。測(cè)定不同濃度的2 株全人源單克隆抗體(YG11-1,YG11-2)與抗原之間相互作用響應(yīng)值,利用軟件Biacore X100 Evaluation Software,version 2.0.1 對(duì)其相應(yīng)曲線進(jìn)行擬合,測(cè)得YG11-1、YG11-2 的親和常數(shù)如表1所示。

        表1 SPR測(cè)定YG11-1、YG11-2的親和力Tab.1 SPR determinations of affinity of YG11-1 and YG11-2

        2.6 YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結(jié)合活性檢測(cè) 利用YG11-1、YG11-2 抗體檢測(cè)金葡菌COL培養(yǎng)上清中天然的SEB 蛋白。結(jié)果顯示YG11-1、YG11-2 抗體能夠特異性識(shí)別COL培養(yǎng)上清中分泌的SEB蛋白(圖5)。

        圖5 Western blot 檢測(cè) YG11-1、YG11-2 與天然 SEB 蛋白結(jié)合Fig.5 Binding activity of YG11-1 and YG11-2 to natural SEB protein was detected by Western blot

        2.7 YG11-1、YG11-2對(duì)SEBILS小鼠的保護(hù)作用將小鼠隨機(jī)分組后,對(duì)SEBILS模型小鼠分別腹腔注射不同劑量的YG11-1、YG11-2,觀察并記錄72 h 內(nèi)各組小鼠的死亡情況。如圖6 所示,YG11-1 200 μg組小鼠存活率有所提高,而YG11-2 200 μg 組小鼠存活率高達(dá)100%,表明YG11-2 可有效提高SEBILS模型中小鼠存活率。

        圖6 YG11-1、YG11-2對(duì)SEBILS小鼠的保護(hù)作用Fig.6 Protection of YG11-1 and YG11-2 in mouse model of SEBILS

        3 討論

        本研究成功構(gòu)建了pET-28a-SEB 重組表達(dá)載體,表達(dá)并純化金葡菌重組蛋白SEB,并利用噬菌體抗體庫(kù)篩選出具有較高親和力的抗SEB 單克隆人源抗體YG11-1、YG11-2。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,YG11-1、YG11-2 均能提高SEBILS 小鼠模型的存活率,并且YG11-2 能夠達(dá)到100%保護(hù)率。本研究獲得的兩株全人源抗體具有相同的VH,但其中和活性具有顯著差異,表明抗體的VL對(duì)其中和活性具有重要影響。

        目前針對(duì)人體SEB 誘導(dǎo)的中毒性休克尚無(wú)有效的防治方法。靜脈輸注混合人體血清在一定程度上能緩解癥狀,但由于其來(lái)源的局限性和效果的不穩(wěn)定性,它的應(yīng)用受到很大限制[21-22]。已有研究表明單克隆抗體對(duì)SEBILS具有一定的保護(hù)作用,但也只能達(dá)到部分的保護(hù)效果,且Anti-SEB 多為鼠源單抗[12,23]。本研究利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成功篩選并制備了對(duì)SEB 具有較高親和力并且具有特異性中和作用的全人源單克隆抗體YG11-1、YG11-2,且YG11-2 可達(dá)到100%的保護(hù)效果,為SEB 的防治提供了新的選擇。

        猜你喜歡
        小鼠
        晚安,大大鼠!
        萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
        視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生令小鼠復(fù)明
        科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        今天不去幼兒園
        清肝二十七味丸對(duì)酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用
        中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
        米小鼠和它的伙伴們
        高氟對(duì)C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達(dá)的影響
        Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        加味四逆湯對(duì)Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
        91精品久久久久含羞草| 性色视频加勒比在线观看| 在线观看视频免费播放| 人妻少妇偷人精品免费看| 成视频年人黄网站免费视频| 少妇仑乱a毛片| 国产女在线| 伊人久久婷婷综合五月97色| 中文字幕人妻av一区二区| 亚洲一区二区在线观看免费视频| 亚洲三区在线观看内射后入| 国产成人亚洲精品青草天美| 亚洲精品国产精品国自产观看| 国产精品无码片在线观看| 国产裸体AV久无码无遮挡| 亚洲一区二区视频免费看| 亚洲av熟女一区二区三区站| 大地资源高清在线视频播放| 国产成人亚洲综合色婷婷| 国产精品久久久久久人妻精品| 任你躁国产自任一区二区三区| 成人国产在线播放自拍| 日本免费一区二区久久久 | 国产一区二区三区在线观看免费| 欧美a在线播放| 亚洲精品一区二区三区日韩| 少妇人妻字幕精品毛片专区| 国产精品国产三级国产av品爱网 | 亚洲av无码一区二区三区网址| 精品国产一区二区三区免费| 国产成人综合久久精品推| 伊人狠狠色j香婷婷综合| 亚洲色图视频在线观看,| 国产又大大紧一区二区三区| 一区二区三区无码高清视频| 亚洲成在人线在线播放无码| a级黑人大硬长爽猛出猛进| 日本a在线免费观看| 粗一硬一长一进一爽一a视频| 国产免费一区二区在线视频| 久久天天躁夜夜躁狠狠|