王艾青 鄭秀花 劉瑾春 陳玉芳 鮑啟德 田振濤 （河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安陽 455000）

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年有近220萬例新發(fā)病例和150萬例死亡病例［1］。其中非小細(xì)胞肺癌占80%，可細(xì)分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌［2］。盡管外科手術(shù)和化學(xué)療法方面取得了長足進(jìn)步，但非小細(xì)胞肺癌的頻繁復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是急需解決的問題。微小RNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的能力，研究表明大量miRNA 在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。miR-147a 位于染色體9q33.2 區(qū)域，在膀胱癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，具有抑癌作用［3-4］。已有研究表明血清miR-147低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良顯著相關(guān)［5］。LI 等［6］研究表明 miR-147 通過抑制BDNF 表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。激活轉(zhuǎn)錄因子2（activate transcription factor 2，ATF2）屬于環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）響應(yīng)元件結(jié)合家族，與非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移密切相關(guān)［7］。本文主要探究miR-147a靶向ATF2 對(duì)非小細(xì)胞肺癌遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 收集 2018 年 4 月至 2020 年 4 月濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院收治的40例非小細(xì)胞肺癌患者，手術(shù)切除非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織，-80 ℃保存。本研究經(jīng)濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》道德準(zhǔn)則進(jìn)行，所有患者知情同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只4 周齡SPF 級(jí)雌性裸鼠（BALB/c）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量13~15 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)25 ℃、50%~60%相對(duì)濕度環(huán)境，12 h/d光照，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 細(xì)胞與主要試劑 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 均購自上海素冉生物科技有限公司；miRNC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所用引物由北京奧科生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；胎牛血清（QS071，北京百奧萊博科技有限公司）；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑（11668030，美國 Thermo fisher）；DMEM 培養(yǎng)基（D5546，上海輔澤商貿(mào)有限公司）；青霉素和鏈霉素雙抗溶液（C0160-611，北京沃比森科技有限公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（T002，北京威格斯生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解緩沖液（PC101，上海雅酶生物科技有限公司）；SYBR-Green PCR試劑盒（RT0411-03，嘉興藍(lán)諾盛生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（WB027，西安浩特生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ATF2兔源 單 克 隆 抗 體（ab36151、ab231303、ab76011、ab92547、ab239361，上海艾博抗生物科技有限公司）；Transwell 小室（254480，北京明陽科華生物科技有限公司）。

1.1.4 儀器 FluorChem HD2 凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple 公司）；BS-1101 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（北京華泰和合商貿(mào)有限公司）；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；Seahorse XF24 分析儀（美國Seahorse 公司）；Thermo Fisherbrand 數(shù)碼生物顯微鏡（上海睿安生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測miR-147a 表達(dá) 將正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織剪碎并研磨，裂解提取總RNA。將正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 接種于12 孔板，85%融合時(shí)采用RIPA 裂解提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板按SYBRGreen PCR 試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR。miR-147a循環(huán)條件：98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 90 s，40 個(gè)循環(huán)，以 U6 為內(nèi)參。ATF2 循環(huán)條件：95 ℃ 5 s、60 ℃10 s、72 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)，以 GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1703，1×106個(gè)/孔接種于 12 孔板，85% 融合時(shí)，根據(jù) Lipofectamine2000 說明書將 miR-NC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至H1703細(xì)胞。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告檢測靶向關(guān)系 收集對(duì)數(shù)生長期 H1703 細(xì)胞接種于 24 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。將1 μg PGL3-ATF2-WT（ATF2 野生型）或PGL3-ATF2-MUT（ATF2 突變型）及miR-NC 或 miR-147a mimic 和 PRL-CMV 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 H1703 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶相對(duì)活性，熒光素酶相對(duì)活性（R/F）=螢火蟲熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

1.2.5 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 在基底膠包埋的Transwell 小室上室接種按1.2.3 轉(zhuǎn)染的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1703 懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，終濃度為 2.5×105個(gè)/ml，Transwell 小室下室加入含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將1.2.3 轉(zhuǎn)染的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 H1703 以 1×106個(gè)/孔接種于12 孔板，鋪滿單層后用小號(hào)槍頭在孔中間垂直劃痕，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，在劃痕0 h和24 h拍攝圖像，Image J 評(píng)估細(xì)胞遷移能力，計(jì)算劃痕閉合率（%）=（初始寬度-測量寬度）/初始寬度×100%。

1.2.7 Western blot 檢 測 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和ATF2蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液提取正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織、正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 和不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及1.2.3 轉(zhuǎn)染的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1703 總蛋白，BCA 試劑盒定量，SDS-PAGE 分離等量（40 μg）總蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉/TBST 封閉2 h。加入一抗（E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000、Vimentin 1∶800、ATF2 1∶1 500）4 ℃孵育過夜，TBST 清洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，ECL 發(fā)光液顯影，Image-Pro plus 6.0分析蛋白條帶灰度，按下式計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)，蛋白表達(dá)量=目標(biāo)蛋白積分吸光度/內(nèi)參蛋白GAPDH積分吸光度。

1.2.8 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 所有裸鼠分為4 組：control 組、miR-147a mimic 組、pc-ATF2、miR-147a+pc-ATF2 組，每組5 只，每只裸鼠左腋下皮下注射100 ml轉(zhuǎn)染后的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1703（5×106個(gè)，PBS 溶解），SPF 級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，正常飲食。第 30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，免疫組化檢測 N-cadherin 陽性表達(dá)，Western blot 檢測 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)。

1.2.9 免疫組化檢測N-cadherin 陽性表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入兔源 N-cadherin 單克隆抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，DAB 顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計(jì)，棕黃色為細(xì)胞陽性，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，Image J 計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-147a 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，而ATF2表達(dá)上調(diào) 與正常肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織 miR-147a 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖 1A），ATF2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1B、C）；與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 相比，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 中 miR-147a表達(dá)顯著下調(diào)，ATF2 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1D、E），H1703 變化最為顯著，因此選取H1703 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 非小細(xì)胞肺癌中miR-147a和ATF2表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-147a and ATF2 in non-smallcell lung cancer cells

2.2 miR-147a 靶向下調(diào) ATF2 表達(dá) Targetscan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-147a 與ATF2 存在靶向關(guān)系，3'UTR 區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-147a與ATF2-WT共轉(zhuǎn)染顯著降低熒光素酶活性（P＜0.01，圖2B）。與對(duì)照組相比，mimic-NC 組miR-147a 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-147a mimic組miR-147a 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖2C），表明轉(zhuǎn)染成功。與對(duì)照組相比，miR-NC 和pc-NC 組H1703細(xì)胞ATF2 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-147a mimic組 H1703 細(xì) 胞 ATF2 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào) ，pc-ATF2 組H1703細(xì)胞ATF2表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖2D）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組 H1703 細(xì) 胞 ATF2 表 達(dá) 顯 著 上 調(diào)（P＜0.01，圖2D）。

圖2 miR-147a與ATF2的靶向關(guān)系Fig.2 Targeting relationship between miR-147a and ATF2

2.3 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細(xì)胞侵 襲與對(duì)照組相比，miR-NC 和 pc-NC 組 H1703 細(xì)胞侵襲數(shù)無明顯變化，miR-147a mimic 組H1703 細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少，pc-ATF2 組H1703 細(xì)胞侵襲數(shù)顯著增多（P＜0.01，圖3）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組H1703細(xì)胞侵襲數(shù)顯著增多（P＜0.01，圖3）。

圖3 Transwell 檢測miR-147a 對(duì)H1703 細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）Fig.3 Effect of miR-147a on invasion ability of H1703 cells detected by Transwell（×200）

2.4 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細(xì)胞遷 移與對(duì)照組相比，miR-NC 和pc-NC 組劃痕閉合率無明顯變化，miR-147a mimic 組劃痕閉合率顯著降低，pc-ATF2 組劃痕閉合率顯著升高（P＜0.01，圖4）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組劃痕閉合率顯著升高（P＜0.01，圖4）。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-147a 對(duì)H1703 細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Fig.4 Effect of miR-147a on migration ability of H1703 cells tested by scratch experiment（×100）

2.5 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 與對(duì)照組相比，miR-NC 和pc-NC 組H1703細(xì)胞 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-147a mimic 組H1703 細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)顯著下調(diào)，pc-ATF2 組 H1703 細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖 5）；與 miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 組 H1703 細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖5）。

圖5 Western blot 檢測 miR-147a 對(duì) H1703 細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-147a on expressions of epithelialmesenchymal transition-related proteins in H1703 cells detected by Western blot

2.6 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 移植瘤 與對(duì)照組相比，miR-147a mimic 組移植瘤中N-cadherin陽性細(xì)胞百分比降低，E-cadherin 表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)顯著下調(diào)，pc-ATF2 組移植瘤中N-cadherin 陽性細(xì)胞百分比升高，E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖6）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 組移植瘤中N-cadherin 陽性細(xì)胞百分比升高，E-cadherin 表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖6）。

圖6 miR-147a 對(duì)裸鼠移植瘤中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響（×200）Fig.6 Effect of miR-147a on epithelial-mesenchymal transition related proteins in transplanted tumors in nude mice（×200）

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是癌癥相關(guān)死亡的最重要原因，而癌癥轉(zhuǎn)移導(dǎo)致90%以上癌癥相關(guān)死亡［8］。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力反映腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，因此，尋找能夠抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移的新型分子或治療靶標(biāo)至關(guān)重要。

近年研究已證明miRNA 在包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的各種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。miR-147在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，如過表達(dá)miR-147通過抑制結(jié)腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而抑制干細(xì)胞樣特征［9］；miR-147通過AKT/mTOR 信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［10］；miR-147通過抑制HOXC6抑制人肝癌細(xì)胞增殖、遷移和化療敏感性［11］。且已有研究表明，miR-147靶向BDNF抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［6］。本研究表明，與miR-147高度同源的miR-147a 在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)miR-147a 抑制H1703 細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

miRNA 可通過與靶mRNA 3'UTR 結(jié)合而誘導(dǎo)mRNA 降解或抑制基因表達(dá)。越來越多證據(jù)表明，ATF2是多種miRNA的靶標(biāo)，如miR-26b、miR-204和miR-622等［12-13］。本研究結(jié)果證實(shí)ATF2是miR-147a的靶標(biāo)，且在H1703細(xì)胞中受miR-147a調(diào)節(jié)。ATF2參與多種調(diào)控生物學(xué)進(jìn)展，包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷、代謝和腫瘤發(fā)生。如ATF2 在腎細(xì)胞癌中可預(yù)測不良預(yù)后和促進(jìn)惡性表型［14］；ATF2常組蛋白去甲基化酶JMJD1C 下調(diào)通過靶向ATF2 抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移［15］；miR-181a和miR-203通過與ATF2相互作用抑制喉癌細(xì)胞遷移和侵襲［16］；miR-622 通過直接靶向 ATF2 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［12］。本研究表明，miR-147a 過表達(dá)減少H1703 細(xì)胞侵襲數(shù)，降低劃痕閉合率，共轉(zhuǎn)染pc-ATF2 可逆轉(zhuǎn)該作用，與既往研究結(jié)論一致，說明miR-147a 靶向pc-ATF2 可抑制H1703 細(xì)胞侵襲和遷移，從而抑制H1703細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)移發(fā)展過程中，調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間黏附及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲至關(guān)重要［17］。遷移和進(jìn)展的初始步驟基本取決于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其特征為特定形態(tài)發(fā)生變化。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化由一系列復(fù)雜事件組成，其標(biāo)志為上皮細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞基底膜附著喪失及間充質(zhì)樣形態(tài)獲得，伴隨基因表達(dá)改變，包括上皮標(biāo)志物表達(dá)（如E-cadherin）減少和間充質(zhì)標(biāo)志物（如N-cadherin 和Vimentin）表達(dá)增加［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-147a 過表達(dá)上調(diào) H1703 細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá) ，下調(diào) N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)，共轉(zhuǎn)染pc-ATF2 可逆轉(zhuǎn)該作用，說明miR-147a 靶向 pc-ATF2 抑制 H1703 細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制H1703 細(xì)胞轉(zhuǎn)移。E-cadherin 是鈣依賴性跨膜黏附蛋白家族成員之一，主要介導(dǎo)同型細(xì)胞間黏附作用。如E-cadherin 表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞連接松散，也可使腫瘤細(xì)胞分裂增殖失控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落而發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［19］。腫瘤形成過程，N-cadherin 表達(dá)有利于腫瘤血管形成，使腫瘤易于生長和轉(zhuǎn)移［20］。Vimentin 是一種在間質(zhì)表達(dá)的Ⅲ型中間絲狀體蛋白，在上皮細(xì)胞遷移及腫瘤侵襲中具有重要作用，與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［21］。

綜上所述，miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。說明miR-147a 和ATF2可成為治療和預(yù)防非小細(xì)胞肺癌的潛在靶點(diǎn)。本文僅對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探討，分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。