郭 強(qiáng) 李 丹 季艷梅 郭家龍

（十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，十堰 442000）

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，占肺癌的85%。肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是NSCLC 的主要類型之一，占肺癌的 20%~30%［1-3］。由于癌癥轉(zhuǎn)移性質(zhì)和缺乏診療生物標(biāo)志物，LUSC患者的五年生存率不超過15%［4］。因此，提高LUSC患者的生存期是許多研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前迫切需要尋找LUSC 患者預(yù)后相關(guān)的新型標(biāo)志物，以增加LUSC 患者的早期診斷和識(shí)別，進(jìn)而提高LUSC患者的預(yù)后和生存期。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）在小腸、睪丸、腎臟、心臟、甲狀腺和脂肪等中處于高表達(dá)水平，在血液、脾臟、骨髓、腦、血管和肌肉中處于低表達(dá)水平，在肺、結(jié)腸、肝、膀胱和腎上腺中的表達(dá)水平居于兩者之間［5-7］。ACE2 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。與低表達(dá)ACE2 的乳腺癌患者相比，ACE2 高表達(dá)的患者無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）更長(zhǎng)。ACE2可通過VEGFa/VEGFR2/ERK 信號(hào)途徑抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、血管形成和遷移［8］。ACE2高表達(dá)與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者的總生存期密切相關(guān)，其可抑制ccRCC患者體內(nèi)外的腫瘤生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（vascular endothelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，VEGFR-TKI）能 降低ccRCC 細(xì)胞中ACE2 表達(dá)水平，進(jìn)而影響腫瘤生長(zhǎng)和患者生存期［9］。目前，ACE2 在 NSCLC 組織中低表達(dá)。ACE2 過表達(dá)可能通過促進(jìn)VEGFa 表達(dá)而抑制體外細(xì)胞生長(zhǎng)［10］。此外，ACE2 過表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9表達(dá)削弱A549細(xì)胞體外侵襲能力。ACE2 過表達(dá)可抑制人肺癌裸鼠成瘤生長(zhǎng)，并降低 VEGFa、ACE 和 ACE2 受體 AT1R 的表達(dá)水平［11］。以上結(jié)果表明，ACE2 在 NSCLC 進(jìn)展中具有重要作用。然而，ACE2在NSCLC 亞型LUSC 患者預(yù)后和免疫中的作用尚未見報(bào)道。本研究通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫分析ACE2 在LUSC 患者預(yù)后和免疫中的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 UALCAN 數(shù)據(jù)庫 首先，通過UALCAN（http：//ualcan. path. uab. edu）數(shù)據(jù)庫分析 ACE2 mRNA 在LUSC和正常組織中的表達(dá)。其次分析ACE2 mRNA表達(dá)水平與LUSC 患者臨床病理學(xué)特征（癌癥分期、腫瘤分級(jí)、種族、亞型等）之間的相關(guān)性。

1.2 PrognoScan 和 Kaplan-Meier Plotter 數(shù) 據(jù) 庫PrognoScan數(shù)據(jù)庫（http：//www.abren.net/Progno-Scan/）數(shù)據(jù)來源于GEO 數(shù)據(jù)庫中的RNA 數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot. com/analysis/）數(shù)據(jù)來源于TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫的RNA 數(shù)據(jù)。本研究通過PrognoScan（篩選標(biāo)準(zhǔn)：CoxP＜0.05）和Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（分組標(biāo)準(zhǔn)：最佳截?cái)嘀担┓治鯝CE2表達(dá)水平與LUSC患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

1.3 基因富集分析 在TCGA 網(wǎng)站（https：//portal.gdc. cancer. gov/）下載類型為 LUSC HTSeq-FPKM 的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。剔除49例正常肺組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)?；蚋患治觯╣ene set enrichment analysis，GSEA）是一種通過基礎(chǔ)知識(shí)揭示基因組表達(dá)數(shù)據(jù)的方法。根據(jù)ACE2 表達(dá)中位值將TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUSC患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行高低表達(dá)分組，以探究ACE2 可能參與LUSC 進(jìn)展的機(jī)制。每次分析將基因組排列1 000次，ACE2表達(dá)水平用作表型標(biāo)記。

1.4 TISIDB 數(shù)據(jù)庫 TISIDB（http：//cis. hku. hk/TISIDB/）數(shù)據(jù)庫是腫瘤免疫相關(guān)數(shù)據(jù)庫。腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。闡明腫瘤與免疫細(xì)胞的相互作用不僅有助于預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)，還有助于開發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)。通過該數(shù)據(jù)庫搜索基因名ACE2，分析ACE2 表達(dá)水平與LUSC 患者預(yù)后和免疫浸潤(rùn)標(biāo)志物間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 ACE2 低表達(dá)與LUSC 患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后不良相關(guān) 在UALCAN 數(shù)據(jù)庫中，ACE2 在LUSC 組織中的表達(dá)水平降低（圖1A）。ACE2 低表達(dá)水平與 LUSC 患者種族（CaucasianvsAsian；African-AmericanvsAsian）、癌癥分期（Stage 1vsStage 4；Stage 2vsStage 4；Stage 3vsStage 4）、吸煙史［NonsmokervsReformed smoker（＞15 years）；SmokervsReformed smoker（＞15 years）；Reformed smoker（＜15 years）vsReformed smoker（＞15 years）］和組織學(xué)亞型（NOSvsPapillary）相關(guān)（圖1B~E）。此外，在TISIDB 數(shù)據(jù)庫中，ACE2 低表達(dá)水平與LUSC 患者組織學(xué)亞型和免疫學(xué)亞型相關(guān)（圖2）。此外，在預(yù)后相關(guān)的Prog-no-Scan、Kaplan-Meier Plotter 和 TISIDB 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)ACE2高表達(dá)的LUSC患者預(yù)后較好（圖3）。

圖1 ACE2低表達(dá)水平與LUSC患者臨床病理學(xué)特征相關(guān)Fig.1 Low expression level of ACE2 was related to clinicopathological characteristics of LUSC patients

圖2 TISIDB 數(shù)據(jù)庫中ACE2 低表達(dá)水平與LUSC 患者組織學(xué)亞型和免疫學(xué)亞型相關(guān)Fig.2 Low expression level of ACE2 was related to histological and immunological subtypes of LUSC patients in TISIDB database

圖3 ACE2低表達(dá)的LUSC患者預(yù)后不良Fig.3 LUSC patients with low ACE2 expression have a poor prognosis

2.2 ACE2 可能參與調(diào)節(jié)LUSC 進(jìn)展的信號(hào)機(jī)制GSEA 結(jié)果顯示，ACE2 可能通過藥物代謝細(xì)胞色素P450、磷酸戊糖途徑、抗壞血酸和醛糖酸代謝、藥物代謝酶、TGF-β 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用等信號(hào)通路參與LUSC進(jìn)展（表1、圖4）。

圖4 ACE2涉及LUSC進(jìn)展的機(jī)制Fig.4 Mechanisms by which ACE2 was involved in LUSC progression

表1 GSEA顯示ACE2參與調(diào)節(jié)LUSC進(jìn)展的信號(hào)機(jī)制Tab.1 GSEA showed that ACE2 was involved in signaling mechanism that regulates progression of LUSC

2.3 ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞水平相關(guān) 在TISIDB 數(shù)據(jù)庫中，ACE2 低表達(dá)水平與LUSC患者免疫學(xué)亞型相關(guān)（圖2）。進(jìn)一步分析ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞水平間的關(guān)系，結(jié)果表明，ACE2 表達(dá)水平與 LUSCTcm_CD8、CD56bright、iDC和TIL_Neutrophil細(xì)胞呈正相關(guān)，與Mem_B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖5）。

圖5 ACE2表達(dá)水平與LUSC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)Fig.5 ACE2 expression level was correlated with level of LUSC immune cell infiltration

2.4 ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫調(diào)節(jié)分子水平相關(guān) 在TISIDB 數(shù)據(jù)庫中，ACE2表達(dá)水平與LUSC免疫調(diào)節(jié)分子水平相關(guān)（圖6~8、表2）。免疫調(diào)節(jié)分子包括免疫激活分子、免疫抑制分子、MHC 分子、趨化因子及其受體分子。ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫激活分子C10orf54、HHLA2、IL6R、RAET1E、KLRC1、TNFSF18、TNFSF15、TNFRSF18和TNFSF9表達(dá)水平呈正相關(guān)，與 CD70、CXCR4、ENTPD1、TNFRSF8、TNFRSF4、TNFSF4 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖6、表2）。ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫抑制分子LGALS9、CD274、IL10RB、IDO1 和 VTCN1 表達(dá)水平呈正相關(guān)，與ADORA2A 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（表2）。ACE2表達(dá)水平與 LUSCMHC 分子 TAP2、TAP1、HLA-E 和B2M 表達(dá)水平呈正相關(guān)，與HLA-DQA2 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（表2）。ACE2 表達(dá)水平與LUSC 趨化因子CCL20、CCL26、CX3CL1、CXCL1、CXCL6、CXCL8、CXCL16 和 CXCL17 表達(dá)水平呈正相關(guān)，與 CCL2 和CCL7 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖7）。ACE2 表達(dá)水平與LUSC 趨化因子受體分子 CCR3、CXCR1 和 CXCR2表達(dá)水平呈正相關(guān)，與CCR4、CXCR4和CCR10表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖8）。

圖6 ACE2表達(dá)水平與LUSC免疫激活分子水平顯著相關(guān)Fig.6 Expression level of ACE2 was significantly correlated with level of LUSC immunostimulators

圖7 ACE2表達(dá)水平與LUSC趨化因子水平顯著相關(guān)Fig.7 ACE2 expression level was significantly correlated with LUSC chemokine level

圖8 ACE2表達(dá)水平與趨化因子受體水平顯著相關(guān)Fig.8 ACE2 expression level was significantly correlated with chemokine receptor level

表2 ACE2表達(dá)水平與LUSC免疫激活分子、免疫抑制分子和MHC分子水平相關(guān)Tab.2 Expression level of ACE2 was related to levels of LUSC immunostimulators，immunoinhibitors and MHC molecules

3 討論

研究表明，ACE2 在癌癥組織中異常表達(dá)，且參與癌癥進(jìn)展［8-15］。例如，ACE2 在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。ACE2 高表達(dá)與乳腺癌患者長(zhǎng)RFS 相關(guān)。ACE2 可抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和遷移［8，13］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE 和ACE2在濾泡性腺瘤組織中的表達(dá)水平較低，而在濾泡性甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平較高。隨著甲狀腺癌分化程度增加，ACE/ACE2 顯著降低，而 ACE2/ACE 顯著升高。在轉(zhuǎn)移患者組織中，ACE 和ACE2 的表達(dá)水平均顯著降低。且腫瘤腫塊越大，ACE2 的表達(dá)水平越低［14］。ACE2 高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）和腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）患者預(yù)后更好［15］。此外，ACE2 在 NSCLC 組織中表達(dá)下調(diào)，且與NSCLC 細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)［10-12］。本研究發(fā)現(xiàn)ACE2在LUSC 患者組織中處于低表達(dá)水平。ACE2 低表達(dá)水平與LUSC 患者種族、癌癥分期、吸煙史、組織學(xué)亞型、免疫學(xué)亞型和預(yù)后不良有關(guān)。該研究結(jié)果與既往研究趨于一致［10-12］，提示ACE2 表達(dá)水平在LUSC進(jìn)展中發(fā)揮極為重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，干擾TGF-β1 表達(dá)可通過促進(jìn)BRCA1 表達(dá)和Smad3 磷酸化來增加卵巢癌對(duì)藥物的敏感性。體內(nèi)研究表明，敲低TGF-β1 表達(dá)能通過上調(diào)BRCA1 表達(dá)和Smad3 磷酸化水平來抑制腫瘤生長(zhǎng)［16］。Twist2 在人腎癌組織中高表達(dá)。Twist2能促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腎癌衍生細(xì)胞的遷移和侵襲，并促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。敲低Twist2 表達(dá)可降低 ITGA6 和 CD44 表達(dá)水平，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。該結(jié)果表明Twist2 通過調(diào)節(jié)ECM 受體相互作用機(jī)制中ITGA6 和CD44 表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞進(jìn)展［17］。此外，大多數(shù)腫瘤會(huì)出現(xiàn)多種代謝途徑的致癌基因驅(qū)動(dòng)，這對(duì)維持其生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要［18-19］。GSEA結(jié)果顯示，ACE2可能參與調(diào)節(jié)藥物代謝酶、TGF-β 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用等信號(hào)機(jī)制參與LUSC 進(jìn)展。這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致，提示ACE2可能通過這些機(jī)制參與LUSC進(jìn)展。

腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫因子標(biāo)志物與腫瘤患者預(yù)后有關(guān)［20-21］。例如，MATSUMOTO 等［22］報(bào)道CD4和CD8陽性T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平與三陰性乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。INAGUMA 等［23］報(bào)道 CD70 陽性表達(dá)與惡性胸膜間皮瘤患者預(yù)后不良相關(guān)。ZHANG等［24］報(bào)道 CCL2 表達(dá)與 Snail 表達(dá)相關(guān)，且影響胃癌患者的預(yù)后。LI 等［25］研究表明 COVID-19 感染能使上皮細(xì)胞中細(xì)胞因子 IL-1、IL-10、IL-6 和 ACE2 表達(dá)水平增加，并激活B 細(xì)胞。在SARS-CoV 感染細(xì)胞中，ACE2 表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、Th17、Th2、Th1 和樹突狀細(xì)胞水平顯著相關(guān)，提示T細(xì)胞被激活，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。SODHI等［26］報(bào)道ACE2 缺乏可導(dǎo)致細(xì)菌感染小鼠肺嗜中性粒細(xì)胞增多，致使過度炎癥反應(yīng)和肺損傷。相反，ACE2過表達(dá)會(huì)減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損害宿主防御能力。ACE2 通過降低STAT3 活性來限制IL-17 信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺部炎癥。此外，研究報(bào)道免疫因子 HHLA2、IL6R、RAET1E2 在癌癥免疫過程中具有重要作用［27-33］。例如，CHENG等［27-28］報(bào)道 HHLA2 是 B7/CD28 家族中新發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)成員。HHLA2 在NSCLC 組織中過表達(dá)。且在 EGFR 突變患者組織中表達(dá)更高。YIN 等［29］發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）與癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)。miR-204-5p 是介導(dǎo)TAM 誘導(dǎo)結(jié)直腸癌化學(xué)耐藥性的功能靶標(biāo)。而巨噬細(xì)胞分泌的IL-6 能激活結(jié)直腸癌細(xì)胞中IL6R/STAT3信號(hào)途徑和STAT3轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤抑制因子miR-204-5p 表達(dá)，并誘導(dǎo)其化學(xué)抗性。CCL2/CCL12 抗體可明顯減少腫瘤體積。聯(lián)合治療可增加腫瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞含量，以參與腫瘤的免疫應(yīng)答［31］。課題組發(fā)現(xiàn) ACE2 低表達(dá)與 LUSC 免疫學(xué)亞型相關(guān)。ACE2 表達(dá)水平與LUSC Tcm_CD8、CD56bright、iDC 和 TIL_Neutrophil 細(xì)胞水平呈正相關(guān)，與Mem_B 細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)。ACE2 表達(dá)水平與HHLA2、IL6R、RAET1E 等表達(dá)水平呈正相關(guān)，與CD70、CCL2、CCL7 等表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果補(bǔ)充了LI等［25］和SODHI等［26］的研究結(jié)果，表明ACE2 表達(dá)水平與LUSC 免疫密切相關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。