崔偉紅，劉 娟，宮連鳳，顏丙玉，徐迎春

戊型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱戊肝，HE)是由戊肝病毒(HEV)感染引起的肝臟傳染病，主要經(jīng)消化道傳播。近年來(lái)中國(guó)戊肝報(bào)告發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[1-3]，東部地區(qū)發(fā)病率明顯高于西部和中部[4]。煙臺(tái)是沿海開(kāi)放城市，近年來(lái)戊肝發(fā)病率為全省平均水平的近6倍[5]，給群眾造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。HEV主要分為4個(gè)基因型，基因I和Ⅱ型僅人類感染，主要在發(fā)展中國(guó)家流行；基因Ⅲ、Ⅳ型人獸共患，以散發(fā)為主，豬是主要宿主之一，Ⅲ型世界各地均有報(bào)道，Ⅳ型主要分布于亞洲國(guó)家，尤其中國(guó)[6-8]。為了解煙臺(tái)市人感染戊肝病毒流行株的基因型別，我們收集了法定傳染病報(bào)告系統(tǒng)報(bào)告的戊肝病例，采集急性期糞便和血清標(biāo)本，用套式RT-nPCR進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2015-2018年法定傳染病報(bào)告系統(tǒng)報(bào)告的戊肝病例為研究對(duì)象，收集病人的基本信息。采集病例血清標(biāo)本和糞便標(biāo)本，血清標(biāo)本進(jìn)行HEV-IgM抗體檢測(cè)，對(duì)HEV-IgM陽(yáng)性者提取戊肝病毒RNA，進(jìn)行核酸檢測(cè)。共采集360份血清、48份糞便標(biāo)本。

1.2 試劑 HEV-IgM抗體檢測(cè)試劑盒由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒由德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；PCR反應(yīng)試劑、緩沖液由寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)委托山東省和煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心完成。

1.3 標(biāo)本處理 糞便標(biāo)本用pH7.4 PBS稀釋，充分震蕩混勻，制成10%懸液(w/v)，4 ℃ 3 000 r/min離心 20 min 提取上清待檢；血清標(biāo)本直接檢測(cè)。

1.4 HEV RNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序 參考文獻(xiàn)[9]合成HEV ORF2區(qū)域特異性引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物為：HEV外側(cè)上游：5′-GAYGGSACYAAYACYCATATWATGGC-3′ (5 648-5 673)；HEV外側(cè)下游：5′-GTYGGCTCGCCATTGGCYGAGAC-3′ (6 350-6 372)；HEV內(nèi)側(cè)上游：5′-GARGCWTCWAATTAYGCCCAGTAYCG -3′ (5 678-5 703)；HEV內(nèi)側(cè)下游：5′-CCAGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′(6 298-6 321)。

取140 μL血清或糞便懸液，用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，收集50 μL提取液。采用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，在42 ℃、50 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；用巢式PCR(nested PCR, nPCR)擴(kuò)增HEV核苷酸片段。第一輪PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；第二輪PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

最終獲得的PCR終產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為644 bp(基因組第5 678～6 321位，參考緬甸株M73218)，其中用于序列分析的區(qū)段長(zhǎng)度為540 bp(病毒基因組第5 765～6 304位)。所有PCR陽(yáng)性產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 基因序列分析 采用mega7.0對(duì)本研究所得序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的參考序列進(jìn)行分析，計(jì)算遺傳距離，并用鄰接法構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)，計(jì)算Bootstrap值，檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)各分支置信度，進(jìn)行1 000次重復(fù)運(yùn)算，當(dāng)Bootstrap值>70時(shí)則構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可靠。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Epidata3.0軟件錄入數(shù)據(jù)，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析比較不同亞型組間數(shù)值變量差異，采用Fisher精確概率法比較不同亞型組建分類變量差異。雙側(cè)檢測(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 共采集了360份血清標(biāo)本和48份糞便標(biāo)本。采集的360份血清樣本中，198份HEV-IgM陽(yáng)性，陽(yáng)性率55.00%。198份血清標(biāo)本中，55份HEV核酸檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率27.78%。48份糞便標(biāo)本中，19份HEV核酸檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率39.58%。其中2例病例血清和糞便標(biāo)本同時(shí)陽(yáng)性?？傟?yáng)性病例數(shù)72例，男性48例，女性24例。發(fā)病3周內(nèi)采集的糞便HEV核酸陽(yáng)性率(57.1%)高于發(fā)病3周后采集的糞便HEV核酸陽(yáng)性率(15.0%)(P=0.003)，發(fā)病3周內(nèi)采集的血清HEV核酸陽(yáng)性率(37.9%)高于發(fā)病3周后采集的血清HEV核酸陽(yáng)性率(2.2%)(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.2 基因型分布 本次檢測(cè)的72例HEV基因型全部是4型。4d亞型的構(gòu)成比最高，占77.78%(56/72)；其次是4b亞型，占19.44%(14/72)；4a亞型的構(gòu)成比最低，占2.78%(2/72)。采用Fisher確切概率法進(jìn)行組間構(gòu)成比比較，不同亞型在各年份的構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.195)。不同亞型的季節(jié)構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.908)。不同亞型的性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.132)。4a、4b、4d亞型病例的年齡分別是(50.0±7.07)歲、(57.6±9.74)歲、(58.6±10.77)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.667，P=0.517)；4a、4b、4d亞型病例的ALT值分別是(742.0±912.17)U/L、(1234.8±835.56)U/L、(854.9±821.97)U/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.235，P=0.297)。見(jiàn)表1。

表1 2015-2018年煙臺(tái)市HEVRNA檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)量及分布Tab.1 Number positive and distribution of HEV RNA in Yantai from 2015 to 2018

2.3 遺傳距離分析 人感染HEV核苷酸序列的遺傳距離為0.002～0.303。其中4a亞型間的遺傳距離是0.035；4b亞型間的遺傳距離是0.015～0.127；4d亞型間的遺傳距離是0.002～0.094。對(duì)72例病人和不同物種的核苷酸序列遺傳距離進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本次分離出的56株4d亞型HEV序列與山東地區(qū)豬源(KF176351)、羊源(KU904267)、牛源(KU904278)HEV序列的遺傳距離為0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176；14株4b亞型與廣西(EU676172)、廣東(JX855794)、黑龍江(DQ279091)豬源HEV序列的遺傳距離為0.033～0.180；2株4a亞型HEV序列與吉林(EF077630)和上海(EU366959)豬源HEV序列的遺傳距離為0.060～0.226。見(jiàn)圖1。

3 討 論

近年來(lái)戊肝在病毒性肝炎中發(fā)病占比逐年升高[10]，開(kāi)展戊肝病原學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)于分析戊肝病毒傳播路徑，有效進(jìn)行戊肝防控非常重要[11]。歐洲地區(qū)已經(jīng)建立HEV分子監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，涵蓋了人、動(dòng)物、食品和外環(huán)境等各類來(lái)源的HEV[12]。我國(guó)也有不少學(xué)者在進(jìn)行HEV分子流行病學(xué)研究。有研究顯示，戊肝患者感染后2周內(nèi)血清HEV RNA陽(yáng)性率可高達(dá)90%左右[13]，但因戊肝早期發(fā)病不典型，病例往往癥狀持續(xù)一段時(shí)間才就診，另外部分基層醫(yī)院不具備診斷能力，確診時(shí)間靠后，采集標(biāo)本時(shí)往往病例已經(jīng)發(fā)病較長(zhǎng)時(shí)間，因此HEV RNA檢出率不高。本研究血清標(biāo)本核酸總陽(yáng)性率27.78%(55/198)，高于江蘇(19.2%)[14]但低于上海(32.79%)[15]的陽(yáng)性率。糞便標(biāo)本的核酸陽(yáng)性率相對(duì)較高，達(dá)到陽(yáng)性率39.58%(19/48)，可能與采集糞便樣本時(shí)，僅選擇了發(fā)病早期的病例有關(guān)。

研究顯示，我國(guó)HEV最常見(jiàn)的Ⅳ型病毒，常見(jiàn)亞型是4a、4d和4h亞型[16]。本次檢測(cè)的煙臺(tái)戊肝流行株均屬于第Ⅳ基因組，流行株以4d亞型(占77.78%)為主，其次是4b亞型(19.44%)，4a亞型占比最低(2.78%)。本次未在樣本中檢出4c亞型，山東省和煙臺(tái)市以往的檢測(cè)中也未曾檢出4c亞型[11,17]，推測(cè)4c亞型在煙臺(tái)地區(qū)不是優(yōu)勢(shì)株。而2012年煙臺(tái)地區(qū)人源HEV主要流行株是4a亞型，其次是4d亞型[17]。說(shuō)明各年份的流行優(yōu)勢(shì)株有差異，這與疾病的自然流行規(guī)律有關(guān)系。各年份之間的流行株并無(wú)特定的進(jìn)化關(guān)系，可能與戊肝感染的多源性，高度散發(fā)有關(guān)。

國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee for Taxonomy of Viruses，ICTV) 按病毒的分子結(jié)構(gòu)對(duì) HEV 分類提出了新的建議：用氨基酸序列所建立的遺傳進(jìn)化樹(shù)所計(jì)算出的遺傳距離的大小進(jìn)行基因分型[18]，當(dāng)P值小于0.30為同一個(gè)基因型。本次分離出的煙臺(tái)市人感染HEV核苷酸序列全部為Ⅳ型，總遺傳距離為0.002～0.303，其中4a亞型間的遺傳距離是0.035；4b亞型間的遺傳距離是0.015～0.127；4d亞型間的遺傳距離是0.002～0.094。在獲得的毒株中，親緣關(guān)系很近，但是沒(méi)有完全一致的毒株，符合散發(fā)感染的特點(diǎn)。

分離出的4d亞型HEV序列與山東地區(qū)豬源、羊源、牛源HEV序列的遺傳距離分別為0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176，表明煙臺(tái)市人感染HEV序列與豬、牛、羊等動(dòng)物親緣關(guān)系均較近，提示本地HEV感染可能存在跨物種傳播，動(dòng)物源性傳播不容忽視。一方面人感染HEV可能與進(jìn)食動(dòng)物制品有關(guān)[19]，也可能與HEV病毒動(dòng)物糞便污染導(dǎo)致密切接觸傳播有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

本次的研究樣本均來(lái)自于國(guó)家傳染病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，由于流行病學(xué)調(diào)查信息的局限性，對(duì)于肝功能僅收集了ALT指標(biāo)，未進(jìn)一步進(jìn)行傳染源的追溯，但對(duì)于追蹤煙臺(tái)地區(qū)HEV基因特征變化和進(jìn)行人感染HEV病毒傳播來(lái)源分析提供了重要的線索。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：崔偉紅，劉娟，宮連鳳，等. 煙臺(tái)市2015-2018年人感染戊型肝炎病毒基因型分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(8)：703-706，713. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.099