劉子楊，王小文，陳 力

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶 400016

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬(wàn)新增患者［1］。在我國(guó)，2020年肺癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)居各類腫瘤之首［2］。肺癌可分為 非 小 細(xì) 胞 肺 癌 （non-small-cell lung cancer，NSCLC）與小細(xì)胞肺癌。據(jù)估計(jì)，NSCLC 約占所有肺癌的80%，是最常見(jiàn)的具有高侵襲性的肺癌類型之一。盡管診斷及治療方式在不斷發(fā)展，NSCLC患者5年生存率仍然低于20%，死亡的主要原因是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］，而在此過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移可能發(fā)揮著重要作用。目前，對(duì)于NSCLC 侵襲與遷移的機(jī)制尚不完全清楚。因此，尋找新的影響NSCLC 侵襲與遷移的潛在靶點(diǎn)，對(duì)提高NSCLC 治療效果及改善患者臨床預(yù)后有著積極意義。

眾所周知，絕大多數(shù)癌細(xì)胞的能量產(chǎn)生形式為糖酵解，其中糖酵解酶起著關(guān)鍵作用。而糖酵解酶屬于兼職酶，不僅具有催化功能，還可發(fā)揮類似RNA 結(jié)合蛋白的作用。醛縮酶是糖酵解過(guò)程的參與者之一，其中醛縮酶A（aldolase A，ALDOA）是幾乎所有癌癥中含量最豐富的醛縮酶異構(gòu)體［4］，其在多種類型的癌癥（包括肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌和胰腺癌）中高表達(dá)［5］。ALDOA 可以與長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）共同調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，比如ALDOA可以與lncRNADIO3OS共同調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［6］。研究表明，lncRNAArst可通過(guò)調(diào)控ALDOA介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架完整性來(lái)抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展［7］。目前，關(guān)于lncRNA 與ALDOA 之間關(guān)系的研究還相對(duì)較少。因此，探索lncRNA 是否通過(guò)ALDOA 影響NSCLC 的生物學(xué)功能可能是一個(gè)潛在的研究方向。

lncRNA 已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程息息相關(guān)［8］。lncRNA 廣泛參與不同水平的基因調(diào)控，比如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工等［9］，也可作為腫瘤抑制因子或癌基因而發(fā)揮作用［10］。值得注意的是，lncRNA 的獨(dú)特特征也可能反映癌癥的進(jìn)展，影響腫瘤中的多種生物學(xué)過(guò)程［11-13］。在之前的研究［14］中，我們發(fā)現(xiàn)甘油激酶-內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1（glycerol kinase-intronic transcript 1，GK-IT1）在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，且能調(diào)控其增殖與凋亡，但GK-IT1在NSCLC 及其他腫瘤疾病中發(fā)揮的作用尚不明確。因此，本研究旨在探索lncRNAGK-IT1與ALDOA 對(duì)NSCLC 細(xì)胞惡性表型的影響，以期為進(jìn)一步研究NSCLC的疾病發(fā)展與靶向治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與臨床組織標(biāo)本 人NSCLC 細(xì)胞株A549、H358 均購(gòu)自武漢普諾賽公司。正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，人NSCLC 細(xì)胞株H1299、H1975受贈(zèng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心。

42 對(duì)癌及癌旁組織均來(lái)自2020 年12 月-2021 年7月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院首次確診的NSCLC患者。其中男性17 例，女性25 例，年齡40～82 歲。按照第8 版肺癌TNM 分期系統(tǒng)進(jìn)行T 分期統(tǒng)計(jì)，其中T1/T2期24例，T3/T4期18例。所有組織標(biāo)本由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，BeyoClick EdU-555 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol 裂解液、SYBR Premix EX Taq Ⅱ試劑盒、PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 公 司；GK-IT1的 小 干 擾RNA （small interfering RNA， SiRNA）、 陰 性 對(duì) 照（SiRNA negative control，Si-NC）及轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自重慶萊伯斯生物技術(shù)有限公司；熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）實(shí)驗(yàn)試劑盒及混合探針購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；GK-IT1、ALDOA及甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的特異性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；PAGE 凝膠（10%）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，抗波形蛋白（vimentin） 抗 體（R22775）、抗E 鈣 黏 蛋 白（Ecadherin） 抗 體（R22490）、抗N 鈣 黏 蛋 白（Ncadherin）抗體（R23341）、抗肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（380624） 購(gòu)自成都正能生物有限公司，抗ALDOA抗體（ab150396）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（CFX96）購(gòu)自美國(guó)Bio-rad 公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron 公司，顯微鏡和配套成像系統(tǒng)購(gòu)自日本Olymous公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 NSCLC 細(xì)胞A549 使用DMEM F-12K培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），H358使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔的密度接種至6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，向細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2、Si-NC 或ALDOA 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司），待24、48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SiRNA 序列信息如下：Si-GK-IT1#1 正義鏈為5′-CGU UGA GAG UCU UAG UAAA-3′，反義鏈為5′-UUU ACU AAG ACU CUC AACG -3′；Si-GK-IT1#2 正 義 鏈 為5′-GGA AGG UUC UGU AGC UAUA-3′，反義鏈為5′-UAU AGC UAC AGA ACC UUCC-3′；Si-NC 正義鏈為5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACGU-3′，反義鏈為5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGAA-3′。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)NSCLC 組織及細(xì)胞株中的GKIT1表達(dá)水平 在50 mg 凍存的NSCLC 組織和癌旁組織中，分別加入1 mL TRIzol；在人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B及轉(zhuǎn)染了SiRNA的A549、H358細(xì)胞中加入1 mL TRIzol。提取的總RNA 用酶標(biāo)儀檢測(cè)其純度與濃度。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR檢測(cè)NSCLC組織及癌旁組織的GK-IT1及ALDOA相對(duì)表達(dá)水平，再以相同的方法檢測(cè)上述細(xì)胞株中的GK-IT1的表達(dá)水平。qRT-PCR 的10 μL 擴(kuò)增體系：5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、3 μL DEPC 水。程 序 設(shè) 置 為：95 ℃3 min；95 ℃5 s，60 ℃25 s，72 ℃25 s，循環(huán)數(shù)為40次。每個(gè) 樣 本 設(shè) 置3 個(gè) 復(fù) 孔，采 用2-ΔΔCT法 對(duì)GK-IT1、ALDOA表達(dá)水平進(jìn)行分析。所設(shè)計(jì)的GK-IT1引物上游序列為5′-AGC GGT AGA GTC AGC TCT GTT TG-3′，下游序列為5′-CAC CAT GCC CAG CCG TAAC-3′。ALDOA特異性引物的上游序列為5′-GGA AAA GGG CAG GGG TCA TTA-3′，下游序列為5′-AGT AGC AAG TTC CTG CGGC-3′。GAPDH引物上游序列為5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，下游序列為5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2共3組。將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁之后，取出一塊96 孔板，避光，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，繼續(xù)避光孵育90 min。隨后以酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm 處的吸光度值［D（450 nm）］，共檢測(cè)4 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。共轉(zhuǎn)染Si-GK-IT1#2與ALDOA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，進(jìn)行CCK-8 挽救實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照（control， Ctrl）、 Si-GK-IT1#2 及Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.4 EdU 實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2 共3 組。將各組細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于鋪有爬片的24 孔板，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)，按照EdU 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。待上述步驟完成后，小心取出爬片，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。記錄視野內(nèi)EdU陽(yáng)性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比。共轉(zhuǎn)染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，行EdU 挽救實(shí)驗(yàn)，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GKIT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 基質(zhì)膠制備：各取97 μL培養(yǎng)基，分別加入3 μL Matrigel，充分混勻，每個(gè)小室加入100 μL 混勻后的液體，放置于37 ℃環(huán)境中1 h，使Matrigel凝聚成膠。實(shí)驗(yàn)分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2共3組。使用不含血清的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞按2×105個(gè)/孔加入上室內(nèi)，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，棉簽輕柔擦掉上層殘留細(xì)胞，待自然晾干后拍照。隨機(jī)取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞個(gè)數(shù)。共轉(zhuǎn)染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，行Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2 組。在6 孔板背面垂直于長(zhǎng)軸用直尺標(biāo)記劃豎線，再將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按6×105個(gè)/孔接種于6孔板，緩慢輕柔混勻。待細(xì)胞鋪滿小孔后，用槍頭順著豎線筆直劃痕，PBS 清洗掉落的細(xì)胞。第0、24 h取樣，測(cè)量并記錄細(xì)胞遷移的距離，計(jì)算遷移率。共轉(zhuǎn)染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.7 FISH 實(shí)驗(yàn) 按照說(shuō)明書(shū)利用所合成的混合探針在H358 和A549 細(xì)胞上進(jìn)行FISH 實(shí)驗(yàn)。用1×PBS預(yù)洗細(xì)胞5 min。將2.5 μL 探針加入100 μL 含10%甲酰胺、2×檸檬酸鹽鈉、10%硫酸葡聚糖的預(yù)雜交液中進(jìn)行雜交。在37 ℃的濕化室中雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后，PBS清洗2次，每次5 min，成像并記錄。細(xì)胞紅色熒光范圍表示GK-IT1的亞細(xì)胞定位。

1.2.8 RNA 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) A549 或H358 細(xì)胞在1 mL 裂解緩沖液中裂解，吹打混勻，置于冰上10 min。4 ℃、14 000×g離心10 min 后取上清。加入蛋白 A/G 磁 珠 進(jìn) 行 RNA 免 疫 共 沉 淀 （RNA immunoprecipitation，RIP）實(shí)驗(yàn)。分別將裂解產(chǎn)物與5 μL 兔抗ALDOA、正常兔抗IgG 在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，4 ℃、12 000×g離心10 min，保留沉淀，加入1 μL洗脫緩沖液，清洗3次，每次2 min。使用Trizol裂解液提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，操作步驟與檢測(cè)條件同前。設(shè)置抗IgG 組與抗ALDOA 組。采用2-ΔΔCT法對(duì)GK-IT1表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以此確定相對(duì)抗IgG 組，結(jié)合于抗ALDOA 組的RNA 中GK-IT1是否呈明顯富集。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 通過(guò)RNA-蛋白質(zhì)相互作用預(yù) 測(cè) 網(wǎng) 站 RPIseq （http：//pridb. gdcb. iastate. edu/RPIseq/）分析GK-IT1與ALDOA 蛋白的相互作用關(guān)系，結(jié)果以RF classifier（Range Forest classifier）和SVM classifier （Support Vector Machine classifier） 2種算法呈現(xiàn)。計(jì)算RNA 與蛋白質(zhì)的相互作用概率。相互作用概率大于0.5，表明相應(yīng)的RNA 與蛋白質(zhì)相互作用概率較大。

1.2.10 Western blotting實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞收集待用，加入RIPA 細(xì)胞裂解液于4 ℃反應(yīng)30 min，超聲裂解，4 ℃、12 000×g離心15 min之后提取蛋白。按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。按照說(shuō)明書(shū)配置PAGE凝膠（10%），每個(gè)電泳槽加入20 μg蛋白樣本，進(jìn)行電泳分離，在冰浴條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，將PVDF 膜放至脫脂奶粉中，然后于常溫?fù)u床上封閉1 h。分別加入上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白抗體（抗vimentin 抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體）、抗β-actin抗體和抗ALDOA 抗體，于4 ℃搖床上過(guò)夜。室溫?fù)u床上孵育正常兔抗IgG 1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，顯影分析電泳條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。定量資料用±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析2 組數(shù)據(jù)間的差異；多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則用最小顯著性差異法進(jìn)行2 組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中GK-IT1與ALDOA高表達(dá)

42 對(duì)癌及癌旁組織的qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，NSCLC 組織中GK-IT1與ALDOA的表達(dá)量均高于癌旁組織（圖1A、B，均P<0.05）。將42 例病例按T 分期分為T(mén)1/T2組（n=24）和T3/T4組（n=18），分析2組GK-IT1表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，T3/T4組中GK-IT1的表達(dá)水平明顯高于T1/T2組（圖1C，P=0.009）。

圖1 NSCLC組織中GK-IT1及ALDOA的表達(dá)Fig 1 Expression of GK-IT1 and ALDOA in NSCLC tissues

2.2 GK-IT1在NSCLC細(xì)胞株中的表達(dá)水平及敲低效率

為了篩選出實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系，用qRT-PCR 檢測(cè)人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 以及NSCLC 細(xì)胞株（H358、A549、H1975、H1299）中GK-IT1的相對(duì)表達(dá)水平。與正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 相比，A549 及H358 細(xì)胞中GK-IT1的表達(dá)量明顯升高，而H1299 和H1975 細(xì)胞中GK-IT1表達(dá)量無(wú)明顯變化（圖2A，均P>0.05），故采用A549 及H358 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了避免脫靶效應(yīng)，將設(shè)計(jì)好的2 條SiRNA 序列（Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2）轉(zhuǎn)染至A549 及H358 細(xì)胞內(nèi)，采用qRT-PCR 檢測(cè)GK-IT1的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與Si-NC 組相比，H358 細(xì)胞中2條SiRNA 序列的敲低效率分別為48%和53%，A549細(xì)胞中Si-GK-IT1#1 和Si-GK-IT1#2 的敲低效率分別為37%和50%（圖2B、C，均P<0.05）。

圖2 GK-IT1在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)及其敲減效果Fig 2 GK-IT1 expression and knockdown effect in NSCLC cell lines

2.3 敲減GK-IT1 對(duì)A549 及H358 細(xì)胞增殖能力的影響

完成SiRNA 轉(zhuǎn)染之后，利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSCLC 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，敲減GK-IT1明顯降低了H358 及A549 細(xì)胞的增殖能力（圖3A、B，均P<0.05）。EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2組細(xì)胞的EdU 陽(yáng)性比例明顯低于Si-NC 組，表明GK-IT1敲減的NSCLC 細(xì)胞增殖能力降低（圖3C，均P<0.05）。

圖3 敲減GK-IT1對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of GK-IT1 knockdown on the proliferation of NSCLC cells

2.5 敲減GK-IT1 對(duì)A549 及H358 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

分別敲低A549、H358 細(xì)胞中的GK-IT1后，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與Si-NC組相比，Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2 組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，侵襲能力明顯減弱（圖4A～C，均P=0.000）。并且在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Si-GK-IT1#1及Si-GK-IT1#2 組細(xì)胞的24 h 遷移率較Si-NC 組明顯降低（圖4D～F，均P=0.000）。

圖4 敲減GK-IT1對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響Fig 4 Effects of GK-IT1 knockdown on the invasion and migration of NSCLC cells

2.6 GK-IT1亞細(xì)胞定位的檢測(cè)

為了探究GK-IT1影響細(xì)胞功能的作用機(jī)制，采用FISH 實(shí)驗(yàn)對(duì)A549 及H358 細(xì)胞中的GK-IT1進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測(cè)。紅色熒光的范圍可反映GK-IT1的細(xì)胞內(nèi)分布情況。從圖5可知，GK-IT1存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，但其主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

圖5 GK-IT1的亞細(xì)胞定位Fig 5 Subcellular localization of GK-IT1

2.7 敲減GK-IT1 對(duì)A549 及H358 細(xì)胞中ALDOA及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

敲低GK-IT1后，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)A549、H358細(xì)胞中vimentin、E-cadherin、N-cadherin及ALDOA蛋白的表達(dá)（圖6）。與Si-NC組相比，Si-GK-IT1#1及Si-GK-IT1#2組A549、H358細(xì)胞中vimentin、ALDOA蛋白表達(dá)水平下降，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高（均P<0.05），N-cadherin蛋白表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。提示GK-IT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)ALDOA 及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響NSCLC的EMT過(guò)程。

圖6 敲減GK-IT1對(duì)NSCLC細(xì)胞中ALDOA及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig 6 Effects of GK-IT1 knockdown on the expression of ALDOA and EMT-related proteins in NSCLC cells

2.8 GK-IT1與ALDOA蛋白的相互作用

進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析探索A549、H358細(xì)胞中GK-IT1與ALDOA 之間的潛在關(guān)系，結(jié)果顯示，RF classifier 和SVM classifier 結(jié)果分別為0.65 和0.87（圖7A），說(shuō)明GK-IT1與ALDOA 蛋白的相互作用概率較大。RIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與抗IgG 組非特異性抗體相比，結(jié)合于抗ALDOA 組ALDOA 抗體的RNA 中GK-IT1呈明顯富集，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7B，P=0.000），提示GK-IT1可能與ALDOA 蛋白相互作用。

圖7 GK-IT1與ALDOA的相互作用Fig 7 Interaction between GK-IT1 and ALDOA

2.9 ALDOA 過(guò) 表 達(dá) 對(duì) 敲 減GK-IT1 的NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

為了進(jìn)一步明確GK-IT1是否通過(guò)ALDOA來(lái)調(diào)控NSCLC 細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，在A549 及H358細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)表達(dá)ALDOA的挽救實(shí)驗(yàn)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Si-GK-IT1#2 組相比，Si-GK-IT1#2+ALDOA組的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（圖8A、B，均P<0.05）；EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Si-GK-IT1#2+ALDOA組細(xì)胞的EdU 陽(yáng)性比例較Si-GK-IT1#2 組明顯升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（圖8C，均P<0.05）；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 與Si-GK-IT1#2 組相比，Si-GK-IT1#2+ALDOA組的細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)明顯增多，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)（圖8D～F，均P=0.000）；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Si-GK-IT1#2+ALDOA組細(xì)胞的24 h 遷移率較Si-GK-IT1#2 組明顯升高，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（圖8G～I(xiàn)，均P=0.000）。Western blotting結(jié)果顯示：Si-GK-IT1#2+ALDOA組細(xì)胞中ALDOA 和vimentin 蛋白表達(dá)水平均高于Si-GK-IT1#2 組，而E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平低于Si-GK-IT1#2 組（圖9，均P<0.05）。

圖8 過(guò)表達(dá)ALDOA對(duì)敲除GK-IT1的NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響Fig 8 Effects of ALDOA overexpression on the proliferation,invasion and migration of GK-IT1-knockdown NSCLC cells

圖9 過(guò)表達(dá)ALDOA對(duì)敲除GK-IT1的NSCLC細(xì)胞ALDOA及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 9 Effects of ALDOA overexpression on the expression of ALDOA and EMT-related proteins in GK-IT1-knockdown NSCLC cells

3 討論

lncRNA 可與RNA 結(jié)合蛋白或（和）轉(zhuǎn)錄因子等相互作用，影響信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，是多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的重要調(diào)控因子［15-17］。例如，LINC01354通過(guò)其p3段與RNA 結(jié)合蛋白hnRNP-D 相互作用，調(diào)控β-連環(huán)蛋白基因CTNNB1的穩(wěn)定性，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［18］。大量的lncRNA已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而GK-IT1在NSCLC中的作用機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)GK-IT1在NSCLC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)；多項(xiàng)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲減GK-IT1明顯抑制NSCLC 細(xì)胞的惡性進(jìn)展。因此，尋找GK-IT1影響NSCLC疾病發(fā)展的潛在靶點(diǎn)或可作為新的探究方向。

ALDOA 在肺癌及胰腺癌等多種疾病中高表達(dá)，可增強(qiáng)NSCLC 的有氧糖酵解，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)、G1/S 期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞增殖［19］。不僅如此，ALDOA 還可直接與lncRNAZNF674-AS1相互作用，發(fā)揮類似RNA 結(jié)合蛋白的作用，從而影響卵巢顆粒細(xì)胞的糖酵解和增殖［20］。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與RIP 實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)lncRNAGK-IT1與ALDOA 存在相互作用。FISH 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GK-IT1主要位于細(xì)胞質(zhì)，且ALDOA 也主要位于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中［21］。由于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA可通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［22］。因此，GK-IT1可能通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中ALDOA 蛋白結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的調(diào)控。

EMT 是影響腫瘤細(xì)胞可塑性的重要因素［23］，也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟和癌癥患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)［24］。lncRNA或ALDOA均可對(duì)EMT進(jìn)行調(diào)控，從而影響肺癌疾病進(jìn)展。例如，lncRNAFEZF1-AS1通過(guò)Wnt 通路調(diào)節(jié)E-cadherin 的表達(dá)，誘導(dǎo)NSCLC 的EMT 發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移［25］；下調(diào)ALDOA可通過(guò)促進(jìn)E-cadherin 表達(dá)，降低vimentin 表達(dá)來(lái)調(diào)控EMT，從而影響肺癌的腫瘤形成能力和遷移能力［21］。本研究結(jié)果顯示，敲低GK-IT1后，EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平受到影響（圖6）。前述生物信息學(xué)分析及RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GK-IT1與ALDOA 蛋白存在相互作用。過(guò)表達(dá)ALDOA的挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低GK-IT1對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移產(chǎn)生的影響被逆轉(zhuǎn)。因此，我們得出lncRNAGK-IT1可通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的ALDOA 相互作用，調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。

綜上，GK-IT1在NSCLC 中高表達(dá)，可通過(guò)ALDOA 蛋白調(diào)節(jié)EMT 過(guò)程來(lái)影響NSCLC 的惡性進(jìn)展。近年來(lái)對(duì)RNA 結(jié)合蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可通過(guò)泛素化或磷酸化參與蛋白質(zhì)修飾［26-27］。GK-IT1是否通過(guò)上述方式調(diào)控ALDOA 還需進(jìn)一步探討。如果能以GK-IT1與ALDOA的相互作用為切入點(diǎn)，研究出相應(yīng)的靶向藥物，干擾糖酵解進(jìn)程，或可為NSCLC的治療提供新的思路，進(jìn)而可能改善疾病預(yù)后。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)2020-732，日期2020-12-14）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照醫(yī)學(xué)倫理原則和《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University （approval letter No. 2020-732， dated 12/14/2020）， and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of principles of medical ethics andHelsinki Declaration. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

劉子楊、王小文參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；劉子楊、陳力參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Ziyang and WANG Xiaowen. The manuscript was drafted and revised by LIU Ziyang and CHEN Li.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-23

·Accepted：2022-05-06

·Published online：2022-05-28