盛 濤， 孟慶斌， 李學(xué)齊， 孫彩玉， 賈明珠

(黑龍江科技大學(xué) 環(huán)境與化工學(xué)院， 哈爾濱 150022)

0 引 言

我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量約9 億t，但絕大部分沒有被合理利用，這不僅導(dǎo)致資源的浪費，同時也是溫室氣體的主要來源[1-3]。秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素及木質(zhì)素。纖維素及半纖維素是重要的可再生碳水化合物，其糖化產(chǎn)物可作為生產(chǎn)清潔能源和高值化學(xué)品的原料。

秸稈類生物質(zhì)的資源化一般需要預(yù)處理、糖化和發(fā)酵3個過程。其中，糖化是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源化利用的核心步驟，也是限速步驟[4]。常見的秸稈糖化方式包括纖維素酶糖化法與酸糖化法。與酸糖化法相比，纖維素酶糖化法設(shè)備要求低，水解效率高，條件溫和且不產(chǎn)生影響下游發(fā)酵的抑制物。纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖苷酶(Endocellulose)、外切葡聚糖苷酶(Exocellulose)以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，纖維素類生物質(zhì)的糖化由3種纖維素酶協(xié)同作用完成。商品纖維素酶大多由里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Asperillium niger)發(fā)酵產(chǎn)生。里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖苷酶及外切葡聚糖苷酶的活性較高，但β-葡萄糖苷酶的活性較低；黑曲霉可高效降解木聚糖等半纖維素，但缺乏特定的纖維素酶組分[5]。單一真菌分泌的纖維素酶水解纖維素能力比較有限，為解決這個問題，通常需要將不同真菌產(chǎn)生的纖維素酶進行復(fù)配，以求達到最佳糖化效果，這直接增加了纖維素酶的成本。與真菌分泌的游離酶不同，厭氧細菌通過細胞表面分泌一種多酶復(fù)合物降解纖維素，其稱為纖維小體。熱纖梭菌(Ruminiclostridiumthermocellum)是一種能夠利用纖維素的嗜熱厭氧革蘭氏陽性細菌，其產(chǎn)生的纖維小體是迄今為止研究最廣、降解纖維素效果最有效的纖維酶復(fù)合體之一[6]。但是，熱纖梭菌纖維小體降解纖維素的產(chǎn)物主要是纖維二糖，纖維二糖的積累會導(dǎo)致纖維小體的反饋抑制，嚴重影響了纖維素類生物質(zhì)的糖化效率[7]。因此，找到具有纖維二糖降解能力的熱纖梭菌，研究其代謝纖維二糖的規(guī)律對提高生物質(zhì)能源利用至關(guān)重要。

本課題組在前期研究中篩選到一株可高效糖化木質(zhì)纖維素的微生物熱纖梭菌M3(R.thermocellumM3)[8]，菌株M3不僅可糖化纖維素類底物，且糖化產(chǎn)物中單糖的含量高達97%，纖維二糖僅占2%左右，這說明菌株M3可有效消除纖維二糖的反饋抑制。同時，批式發(fā)酵是目前應(yīng)用最為廣泛的細菌培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基一次性投加，產(chǎn)品一次性收獲，工藝簡單，時間短、效率高。在批式發(fā)酵過程中，可以獲得細菌代謝過程中的瞬時變化規(guī)律，更好地反應(yīng)其代謝特點。因此，筆者旨在通過批式培養(yǎng)R.thermocellumM3探究其在不同纖維二糖濃度下纖維素酶活變化和生長特性，并篩選出與纖維二糖降解相關(guān)的差異基因，為構(gòu)建高效降解木質(zhì)纖維素菌株提供有效可靠的靶點。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與培養(yǎng)基成分

熱纖梭菌R.thermocellumM3保藏在黑龍江科技大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院微生物實驗室。

配置纖維二糖降解培養(yǎng)基1 000 mL，經(jīng)過高溫除氧和調(diào)節(jié)pH為7.5后裝入充好氮氣的厭氧瓶中密封，在115 ℃下滅菌15 min。培養(yǎng)基成分：K2HPO4，1.5 g/L；KH2PO4，3 g/L；MgSO4·7H2O，0.2 g/L;CaCl2·2H2O，0.05 g/L；(NH4)2SO4，1.0 g/L；NaCl，1.0 g/L；KCl，0.2 g/L；纖維二糖質(zhì)量濃度分別為10、20及30 g/L。

1.2 實驗設(shè)計

所有樣本均采用100 mL厭氧瓶進行培養(yǎng)，設(shè)置3種纖維二糖質(zhì)量濃度分別為10、20、30 g/L，分別按10%的菌體接種量于60 ℃和30 ℃、pH為7.5的條件下培養(yǎng)14 d。每24 h取一次樣，考察R.thermocellumM3降解纖維二糖的3種纖維素酶活變化及菌體生長情況。

1.3 分析方法

內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活：將1 mL粗酶液與1 mL用檸檬酸緩沖液配置的濃度為1%羧甲基纖維素鈉溶液混合后在50 ℃下振蕩30 min，用DNS法測量混合液中葡萄糖產(chǎn)量。一個酶活單位 [IU] 定義為每分鐘釋放1 μmol葡萄糖當(dāng)量的酶的量[9]。

外切葡聚糖苷酶酶活：將1 mL粗酶液與1 mL用檸檬酸緩沖液配置的濃度為1%微晶纖維素溶液混合后在50 ℃下振蕩30 min，用DNS法測量混合液中葡萄糖產(chǎn)量。一個酶活單位 [IU] 定義為每分鐘釋放1 μmol葡萄糖當(dāng)量的酶的量[9]。

β-葡萄糖苷酶酶活：測定方法參照Ghose等(1987)[10]所描述的方法，以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物測定β-葡萄糖苷酶活性。在60 ℃下，將樣品與含有2 mmol pNPG、50 mmol檸檬酸鹽緩沖液和15 mmol CaCl2(pH=6)的200 μL溶液孵育20 min，添加50 μL 1 mol的Na2CO3后終止反應(yīng)，并測量405 nm處的吸光度。β-葡萄糖苷酶活性表示為單位體積酶液每分鐘所產(chǎn)生pNP的量(μmol)。

細胞生長量：以菌體吸光度值變化代表細胞增長變化趨勢，采用分光光度計在600 nm處測定樣品的吸光度值代表菌濁η，樣品與空白培養(yǎng)基之間的差值即細胞濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量濃度

圖1是R.thermocellumM3在溫度為60 ℃的條件下，以不同質(zhì)量濃度纖維二糖為底物產(chǎn)纖維素酶的酶活變化情況。從圖1可以看出，底物質(zhì)量濃度為10 g/L時，R.thermocellumM3的β-葡萄糖苷酶活性最高為0.314 IU/mL，隨著底物質(zhì)量濃度從10 g/L增長到30 g/L時，β-葡萄糖苷酶活性出現(xiàn)了不同程度降低。較高的底物負荷可以節(jié)約工藝的成本，但過高的底物質(zhì)量濃度會對細菌的生長形成反饋抑制,進而影響纖維素酶的分泌。有研究表明，當(dāng)纖維二糖濃度超過2%時，熱纖梭菌的生長會受到抑制[12]。值得注意的是,R.thermocellumM3生長在不同質(zhì)量濃度纖維二糖下分泌的β-葡萄糖苷酶活性展示出了相同的趨勢，先降低再逐漸升高并存在一定的延滯期，相比于其他兩種質(zhì)量濃度的樣本，纖維二糖質(zhì)量濃度為10 g/L的樣本在培養(yǎng)初期可以觀察到更明顯的下降趨勢。推測菌株在纖維二糖生長初期所測得的β-葡萄糖苷酶活來自于種子液，此時β-葡萄糖苷酶被用來分解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖為細菌的生長提供原料并幫助細菌逐漸適應(yīng)新的生存環(huán)境，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過高時會抑制菌株對底物的利用。表1為不同溫度下、不同質(zhì)量濃度纖維二糖對R.thermocellumM3菌體生長的影響。培養(yǎng)溫度為30 ℃、底物質(zhì)量濃度為10、20、30 g/L時，菌體的菌濁分別記為η30-10、η30-20、η30-30；培養(yǎng)溫度為60 ℃、底物質(zhì)量濃度為10、20、30 g/L時，菌體的菌濁分別記為η60-10、η60-20、η60-30。

圖1 60 ℃下不同底物質(zhì)量濃度下R. thermocellum M3降解纖維二糖酶活特性Fig. 1 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading cellobioseunder different substrate concentrations at 60 ℃

從表1中可以看出R.thermocellumM3在纖維二糖上生長出現(xiàn)了一定的延滯期。內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶是纖維素酶中至關(guān)重要的兩種酶，當(dāng)R.thermocellumM3生長在以纖維二糖為碳源的底物上時，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶始終呈現(xiàn)出下降的趨勢，這是因為內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的作用是降解纖維素?zé)o定型區(qū)域和結(jié)晶區(qū)域，由于酶的生產(chǎn)需要底物的誘導(dǎo)，所以該菌株在缺乏纖維素的底物中分泌的酶活性較低。Johnson 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，纖維二糖作為底物時可顯著抑制熱纖梭菌纖維小體中外切葡萄糖苷酶的合成。Raman[14]對熱纖梭菌生長降解纖維二糖過程進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明，熱纖梭菌中的纖維素體亞基組成具有底物特異性調(diào)節(jié)能力，以更好地適應(yīng)生物體在不同條件下的生長需要，與生長在纖維素上相比，生長在纖維二糖上時，錨定蛋白Olpb，外切葡聚糖酶基因CelS、CelK,內(nèi)切葡聚糖酶基因CelJ(GH9)表達降低。

表1 不同溫度、不同質(zhì)量濃度纖維二糖對R. thermocellum M3菌體生長的影響

2.2 溫度條件

從圖2中可以看出，培養(yǎng)溫度為30 ℃時，R.thermocellumM3在3種不同底物質(zhì)量濃度下產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性始終高于內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，這與R.thermocellumM3在高溫下降解纖維二糖的酶活特性相同。在以質(zhì)量濃度為10 g/L的纖維二糖培養(yǎng)基中所檢測出的β-葡萄糖苷酶酶活性最高，達到0.148 IU/mL，其次是質(zhì)量濃度為20 g/L和30 g/L的纖維二糖培養(yǎng)基，活性分別為0.124 IU/mL和0.113 IU/mL?？梢钥闯?隨著底物質(zhì)量濃度的升高，并沒有對β-葡萄糖苷酶的活性造成太顯著的影響。

圖2 30 ℃下R. thermocellum M3降解不同質(zhì)量濃度纖維二糖酶活特性Fig. 2 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading different concentrations of cellobiase at 30 ℃

熱纖梭菌是一種革蘭氏陽性嗜熱厭氧菌，在纖維素等為底物時的最佳生長溫度為55～60 ℃[8]。從表1中可以看出，以纖維二糖為底物時R.thermocellumM3在30 ℃培養(yǎng)條件下的菌濁高于60 ℃。纖維二糖作為底物時，β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖，葡萄糖進入細菌的糖酵解環(huán)節(jié)生成丙酮酸，丙酮酸進一步降解生成乙酸和乳酸等代謝副產(chǎn)物,同時為細胞的新陳代謝提供ATP。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，高溫條件下有利于熱纖梭菌生長，但纖維小體中承載纖維素酶的支架蛋白在高溫條件下不穩(wěn)定，因此細菌分泌的酶活穩(wěn)定性會受到抑制，進而不能為細菌生長提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和能量。同時，菌體產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物會影響菌體細胞本身的生長。Herrer等[16]對熱纖梭菌在不同底物上的生長溫度進行了考察，結(jié)果表明，熱纖梭菌的最佳生長溫度并不是最佳酶活溫度，同時纖維素酶的分泌與細胞的生長息息相關(guān)。

2.3 KEGG代謝通路

Sheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，R.thermocellumM3不僅可糖化纖維素類底物，且糖化產(chǎn)物中單糖的質(zhì)量分數(shù)高達97%，纖維二糖僅占2%左右。本研究的結(jié)果表明，R.thermocellumM3可以在纖維二糖質(zhì)量分數(shù)超過2%的底物上生長，雖然β-葡萄糖苷酶的活性有所降低，但并沒有被完全抑制，R.thermocellumM3纖維小體可在一定程度上緩解纖維二糖的反饋抑制作用。為了研究差異基因涉及的通路，對差異基因進行了KEGG代謝通路分析。結(jié)果顯示，與纖維二糖降解相關(guān)的基因包括BglA(EC3.2.1.86)、BglX(EC3.2.1.21)與BglB(EC3.2.1.21)，由圖3可以看出，BglA (EC3.2.1.86)基因涉及的通路是Gly-

圖3 R. thermocellum M3 降解纖維二糖KEGG相關(guān)通路(部分)Fig. 3 KEGG pathways of R. thermocellum M3 degrading cellobiose (part)

colysis(糖酵解)：map00010及Starch and sucrose metabolism(淀粉及蔗糖代謝)：map00500代謝通路。在淀粉及蔗糖代謝通路下，BglA主要的功能是將一分子磷酸化纖維二糖轉(zhuǎn)化為一分子葡萄糖和一分子磷酸化葡萄糖，隨后進入糖降解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽并產(chǎn)生少量的ATP(能量)和NADH(還原力)[17]，與此同時，熊果苷與水楊苷類物質(zhì)也可被BglA轉(zhuǎn)化為磷酸化葡萄糖，最終進入糖酵解代謝路徑。BglX(EC3.2.1.21)和BglB(EC3.2.1.21)基因主要涉及淀粉及蔗糖代謝通路，BglB是熱纖梭菌中常見的β-葡萄糖苷酶基因，其主要的功能是將一分子纖維二糖分解為兩分子葡萄糖，有研究表明，BglB在有低濃度葡萄糖存在的時候會受到抑制，并且溫度較高會對該基因表達的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[18]。

3 結(jié) 論

(1)R.thermocellumM3在批式培養(yǎng)下以纖維二糖為底物時，細菌的生長具有延滯性，檢測出最大β-葡萄糖苷酶酶活為0.314 IU/mL，隨著底物濃度的升高，β-葡萄糖苷酶酶活逐漸降低，葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶活遠低于β-葡萄糖苷酶酶活。

(2)以纖維二糖為底物時，R.thermocellumM3在30 ℃培養(yǎng)條件下的β-葡萄糖苷酶酶活低于60 ℃培養(yǎng)條件下，但菌體的生長能力與酶活呈負相關(guān)。

(3)與纖維素相比，R.thermocellumM3降解纖維二糖有3個基因表達差異明顯，分別為BglA、BglB和BglX，以上基因涉及的代謝通路分別是糖酵解通路和淀粉與蔗糖代謝通路。