陳 均， 高 揚(yáng)， 蘇香楠， 于 亮,2△

(1. 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院， 北京 100084； 2. 北京體育大學(xué)體能訓(xùn)練學(xué)院， 北京 100084)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥疾病，當(dāng)發(fā)生在下肢時(shí)臨床特征為間歇性跛行、嚴(yán)重肢體缺血[1]，并伴有運(yùn)動(dòng)能力降低、骨骼肌功能受損[2,3](如收縮功能下降)等[4]。研究已證實(shí)，AS小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力下降、心肌/平滑肌肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣調(diào)控失衡以及鈣調(diào)控釋放蛋白蘭尼定受體(Ryanodine receptor，RyR)[5,6]和回收蛋白肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)[7]表達(dá)異常，而有氧運(yùn)動(dòng)可逆轉(zhuǎn)心肌肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣紊亂[8]以及相應(yīng)的鈣調(diào)控蛋白。目前未見(jiàn)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)AS小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白R(shí)yR及SERCA的影響報(bào)道。此外，越來(lái)越多的研究表明，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)在AS發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。作為血漿脂蛋白的重要構(gòu)成，ApoE是細(xì)胞表面的一類(lèi)脂蛋白受體(如LDL受體)的配體，而ApoE缺失可導(dǎo)致循環(huán)血液中膽固醇積累進(jìn)而誘發(fā)AS，并在此基礎(chǔ)上予以高脂膳食喂養(yǎng)可以進(jìn)一步加速AS形成[4]。然而，目前鮮有AS對(duì)骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的影響的相關(guān)報(bào)道?；诖?，本研究選取ApoE敲除小鼠作為研究對(duì)象，從骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的角度入手，探討六周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE敲除小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

采用健康25只9周齡ApoE敲除小鼠(ApoE knockout mice，ApoE KO)和10只野生型C57BL/6J小鼠(wild type mice，WT)作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司(SCXK(京)2016-0006)，體重為(25±0.6)g。

ApoE KO鼠和WT鼠各隨機(jī)分為三組：野生鼠組(WT)、ApoE敲除鼠喂高脂鼠組(KO)、ApoE敲除鼠喂高脂+有氧運(yùn)動(dòng)鼠組(KE)，每組10只。其中高脂飼料的成分：脂肪含量為21%(w/w)，膽固醇含量為1.5%(w/w)，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；普通飼料的成分：脂肪含量為4～5%(w/w)，無(wú)膽固醇，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

所有動(dòng)物飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)科研中心小鼠飼養(yǎng)室內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。小鼠房溫度維持在20～25℃，相對(duì)濕度維持在50%～70%，小鼠房提供模擬自然光照，周期為每天12 h，并保證小鼠的自由進(jìn)食和飲水。本次實(shí)驗(yàn)方案被北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

安靜組小鼠正?；\中活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組小鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，方案為：坡度0°，跑速12 m/min，持續(xù)時(shí)間15 min/d，運(yùn)動(dòng)頻率每周5 d。

最大跑速測(cè)試方案 5只用于測(cè)定最大跑速的小鼠及有氧訓(xùn)練組小鼠在測(cè)試及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前均進(jìn)行3 d的適應(yīng)性訓(xùn)練。

5只ApoE-/-小鼠在跑步機(jī)上進(jìn)行最大跑速測(cè)試。測(cè)試方案為：初始速度為4.8 m/min，坡度為0°，持續(xù)5 min后，每3 min速度增加1.2 m/min，直至小鼠力竭。判斷標(biāo)準(zhǔn)為小鼠在電網(wǎng)上連續(xù)停留3 s以上或接受100次電擊[9]。最大跑速的測(cè)試結(jié)果為(27.0±2.4)m/min。

有氧運(yùn)動(dòng)正式訓(xùn)練方案：速度為最大跑速的40%(10.8 m/min)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間40 min/d，運(yùn)動(dòng)頻率每周3 d，共持續(xù)6周。

1.3 取材

所有小鼠取材均在最后一次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后休息至少48 h后進(jìn)行，小鼠麻醉后經(jīng)心臟穿刺取血并脫頸處死，立即取小鼠雙側(cè)腿部腓腸肌，迅速稱(chēng)量，取約100 mg，然用錫紙包裹，標(biāo)記，立刻投入液氮中。然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 骨骼肌蛋白提取

將100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A(已加入EDTA)中，勻漿機(jī)高速充分勻漿；于冰上靜置10 min，渦旋振蕩5 s，再于冰上靜置10 min，渦旋振蕩5 s，15 000 r/min，4℃離心10 min；取上清液于離心管中，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 組織Ca2+含量測(cè)定

根據(jù)鈣(Ca)測(cè)試盒(C004-2-1)說(shuō)明書(shū)，準(zhǔn)確稱(chēng)取組織含量(50 mg)按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的去離子水，冰水浴勻漿， 2 500 r/min，離心10 min，取10%的勻漿上清液待測(cè)，加入工作液，酶標(biāo)儀(BIO-RAD，USA)測(cè)定吸光度計(jì)算出組織中Ca2+含量。根據(jù)以下計(jì)算公式：

注：?jiǎn)挝粸椋簃mol/gprot

1.6 Western blot測(cè)定骨骼肌蛋白表達(dá)

采用美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)的蛋白濃度試劑盒，BCA方法測(cè)定骨骼肌的蛋白濃度。以上樣蛋白量20 μg為一次上樣量，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算蛋白上樣量。采用美國(guó)life technologies公司生產(chǎn)的Bolt 3%～8%Bis-Tris Plus凝膠(用于測(cè)定RyR)以及Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠，電泳分離目的蛋白(RyR、CaM、CaMKⅡ、SERCA1)及內(nèi)參(β-actin)，而后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot2進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃一抗搖床過(guò)夜。一抗稀釋比例為：RyR(1∶200，SC-376507)、CaM(1∶500，SC-5537)、CaMKⅡ(1∶500，SC-9035)、SERCA2(1∶1 000，SC-365098)以及內(nèi)參蛋白β-actin(1∶ 1 000，SC-47778)。次日以1×TBST洗3次，每次10 min。加二抗(RyR(1∶2 000)，CaM(1∶2 000)，CaMKⅡ(1∶2 000)，SERCA2(1∶3 000)，β-actin(1∶2 500))室溫孵育1 h，然后用1×TBST洗3次，每次10 min。洗膜后，加入發(fā)光液(Thermo 34095)，曝光結(jié)果采用Image Lab軟件讀取條帶積分灰度值，結(jié)果用以下公式計(jì)算的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠骨骼肌Ca2+濃度的影響

與WT組相比，KO組Ca2+濃度顯著性降低(WT組Ca2+濃度為(0.052±0.012)mmol/g prot，KO組Ca2+濃度為(0.028±0.007)mmol/g prot，P<0.01)，然而KE組Ca2+濃度無(wú)明顯變化。但是，與KO組相比，KE組Ca2+濃度明顯升高，KE組Ca2+濃度為 (0.045±0.013)mmol/g prot，P<0.01)。

2.2 6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)，如表1、圖1所示，與WT組相比，KO組骨骼肌RyR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，KE組骨骼肌RyR蛋白表達(dá)雖有下降趨勢(shì)但無(wú)顯著差異。KE組與KO組相比，骨骼肌RyR蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。

由表1、圖1可知，與WT組相比，KO組和KE組骨骼肌CaM蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化。與KO組相比，KE組骨骼肌CaM蛋白表達(dá)雖有降低趨勢(shì)但無(wú)顯著性。

如表1、圖1所示，KO組與WT相比，骨骼肌CaMKⅡ蛋白表達(dá)顯著低(P<0.05)。與KO組相比，KE組CaMKⅡ蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性變化。

Tab. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression n=10)

Fig. 1 Mice skeletal muscle SR calcium releasing protein expression

2.3 6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣回收蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)，如表2、圖2所示，與WT組比較，KO組骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。KE組與KO組相比，骨骼肌SERCA1和SERCA2蛋白的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。

Tab. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression n=10)

Fig. 2 Mice skeletal muscle SR calcium uptake protein expression

3 討論

機(jī)體細(xì)胞得以維持正常生理功能的基礎(chǔ)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Ca2+在AS中扮演重要作用，但Ca2+在疾病發(fā)病機(jī)制中的具體機(jī)制仍不清楚，尚待進(jìn)一步研究。Van等[10]以4周齡ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量無(wú)明顯變化。本研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌Ca2+濃度明顯降低。與Van等研究結(jié)果不一致，本實(shí)驗(yàn)采取6周高脂膳食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，而Van等的實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)4周干預(yù)且組織類(lèi)型為心肌，因此，推測(cè)造模時(shí)間以及組織類(lèi)型差異對(duì)骨骼肌Ca2+濃度有影響。此外，目前關(guān)于AS中骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+之間關(guān)系的報(bào)道尚少，相關(guān)機(jī)制仍不明確，故未來(lái)可深入探究。

眾所周知，運(yùn)動(dòng)作為一種新的防治AS的有效手段，正逐漸受到學(xué)者關(guān)注。研究已證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠通過(guò)預(yù)防肌萎縮，繼而改善骨骼肌氧化能力引起的毛細(xì)血管稀疏以及降低心衰小鼠的氧化應(yīng)激，從而逆轉(zhuǎn)外周動(dòng)脈引起的骨骼肌肌??；此外，運(yùn)動(dòng)還可以預(yù)防心血管疾病患者的Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)[8]，但相關(guān)機(jī)制仍不明確。越來(lái)越多的研究表明，在心肌/骨骼肌中，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增加心衰小鼠的心臟收縮力，并改善Ca2+穩(wěn)態(tài)，推測(cè)可能是參與了肌漿網(wǎng)Ca2+釋放(不同的DHPR亞基和RyR)和再攝取(SERCA和NCX)蛋白表達(dá)顯著降低有關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌Ca2+濃度顯著升高。目前，關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中Ca2+相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的探索研究。

肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白主要由RyR通道蛋白構(gòu)成，在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的RyR有三種類(lèi)型：RyR1、RyR2和RyR3。其中，RyR1在骨骼肌中表達(dá)；RyR2在心肌中廣泛表達(dá)；RyR3在多種組織(神經(jīng)系統(tǒng)和膈肌)中以低水平表達(dá)。RyR蛋白的活性主要受到細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度、CaM和CaMKII的影響。CaMKⅡ由鈣結(jié)合鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)激活，磷酸化多種底物，協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞功能改變，而CaMKⅡ活性受到CaM和Ca2+濃度的共同調(diào)節(jié)[12]。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為AS對(duì)肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達(dá)的影響降低。馮利霞等[5]觀察到ApoE-/-小鼠經(jīng)喂養(yǎng)高脂喂養(yǎng)20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌細(xì)胞內(nèi)RyR3蛋白表達(dá)顯著下降，同時(shí)隨著小鼠周齡的延長(zhǎng)其RyR3的表達(dá)亦降低。但也有部分研究認(rèn)為AS中RyR蛋白的表達(dá)上升。經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)20周后，ApoE-/-小鼠平滑肌RyR3蛋白的表達(dá)明顯增加，進(jìn)而導(dǎo)致AS斑塊的形成，推測(cè)可能是由于miR-29b表達(dá)下降所引起的[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達(dá)明顯降低，與上述研究結(jié)果相一致，盡管組織類(lèi)型、蛋白亞型有差異，但可能其相關(guān)機(jī)制一致。據(jù)前文可知，RyR通道活性受CaMKⅡ和CaM蛋白影響，當(dāng)ApoE-/-小鼠骨骼肌RyR蛋白表達(dá)下降，進(jìn)而引起RyR通道活性減弱，導(dǎo)致骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表達(dá)明顯降低；而骨骼肌組織內(nèi)Ca2+濃度的降低，促使骨骼肌CaMKII活性降低，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣釋放功能減弱。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨骼肌CaMKⅡ蛋白的表達(dá)顯著降低，而CaM蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。故未來(lái)可深入探究AS對(duì)骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白的影響。

目前研究已證實(shí)長(zhǎng)期的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以引起心肌/骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生適應(yīng)性變化。與大多數(shù)人的研究一致，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)能夠使肌漿網(wǎng)上RyR蛋白表達(dá)增加[13]。例如，Bueno等[14]以腎上腺素受體敲除(ARKO)小鼠為研究對(duì)象，經(jīng)8周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)比目魚(yú)肌RyR蛋白表達(dá)顯著升高。然而亦有部分文獻(xiàn)報(bào)道，M?nttiri等[15]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)15周有氧低強(qiáng)度訓(xùn)練干預(yù)后，小鼠腓腸肌和股直肌RyR蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，可能與機(jī)體產(chǎn)生了適應(yīng)性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。與M?nttiri等研究結(jié)果一致，但與Morán研究結(jié)果不一致?？赡芘c運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、干預(yù)周期以及研究對(duì)象不同而引起的。綜合以上研究結(jié)果，6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌RyR蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；此外，骨骼肌CaMKⅡ和CaM蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)可能與骨骼肌RyR蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化有關(guān)。目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)與AS模型中骨骼肌肌漿網(wǎng)鈣釋放蛋白表達(dá)之間的研究尚少，相關(guān)機(jī)制仍不清晰，故未來(lái)可進(jìn)一步深入研究以厘清二者關(guān)系。

SERCA作為肌漿網(wǎng)上Ca2+的回收通道蛋白，將Ca2+運(yùn)回肌漿網(wǎng)官腔，從而控制肌漿網(wǎng)中Ca2+的濃度。目前，現(xiàn)有研究集中探討了AS模型中心肌/平滑肌SERCA蛋白的表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)16周后，ApoE-/-小鼠平滑肌SERCA2b蛋白的表達(dá)顯著下降[7]。此外，亦有研究探討了人體AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。Fodor等[16]以AS股骨截肢患者為研究對(duì)象，觀察到骨骼肌SERCA1a蛋白的表達(dá)明顯增加。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠經(jīng)6周高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌SERCA蛋白的表達(dá)明顯降低。與上述研究結(jié)果一致[6]，但與Fodor等研究結(jié)果不一致。主要原因與研究對(duì)象不同，人體骨骼肌SERCA1a高表達(dá)表明在AS缺血性肌肉中存在代償機(jī)制[16]。

目前普遍認(rèn)為，長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠明顯增強(qiáng)骨骼肌SERCA蛋白表達(dá)。例如，Bueno等[14]以心力衰竭的小鼠為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)8周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，結(jié)果顯示，小鼠骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白的表達(dá)均明顯增加。但急性運(yùn)動(dòng)使骨骼肌SERCA蛋白表達(dá)降低。丁海麗等[17]觀察到SD大鼠經(jīng)一次性離心運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)比目魚(yú)肌SERCA蛋白表達(dá)呈降低后逐漸回升趨勢(shì)、在0 h、12 h、24 h和48 h均顯著降低。SERCA2分別在慢肌纖維以及心肌中廣泛表達(dá)，而SERCA1僅在快肌纖維中特異性表達(dá)[18]。因此，運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌SERCA不同亞型的影響機(jī)制也存在差異。例如，MELO等[19]以心肌梗塞大鼠為研究對(duì)象，經(jīng)10周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，結(jié)果表明，心肌梗塞大鼠SERCA2蛋白的表達(dá)顯著增加，進(jìn)而恢復(fù)了心肌梗塞大鼠心室舒張功能，推測(cè)可能長(zhǎng)期的耐力訓(xùn)練可以引起microRNA-1和microRNA-214的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)心肌梗塞大鼠SERCA2a蛋白表達(dá)。也有研究報(bào)道了不一致的結(jié)果，Morissette等[20]進(jìn)一步觀察到AMPKα2激酶轉(zhuǎn)基因小鼠心肌SERCA2明顯增加，提示，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌SERCA2a蛋白變化可能依賴(lài)于AMPKα功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，6周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠高脂膳食喂養(yǎng)后，骨骼肌SERCA1/SERCA2蛋白表達(dá)明顯增加。但是，目前運(yùn)動(dòng)對(duì)AS模型中骨骼肌SERCA蛋白表達(dá)的報(bào)道尚少，鑒于運(yùn)動(dòng)調(diào)控AS中骨骼肌SERCA的分子機(jī)制仍不明確，故未來(lái)可進(jìn)一步在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)上給予佐證，以期為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練防治AS提供有益策略。

綜上所述，高脂膳食可使ApoE敲除小鼠骨骼肌Ca2+濃度降低、肌漿網(wǎng)鈣釋放作用和鈣回收作用減弱，6周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠顯著提高其Ca2+濃度、促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣回收作用。