喻 莉，楊 靜，宋泰來

（西安市第三醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710000）

牙周膜干細胞（PDLSCs）是牙周組織再生領域重要的種子細胞。在正畸治療過程中，正畸牽張力對PDLSCs增殖及成骨分化的調控有利于牙槽骨的重塑[1-2]。有研究報道，10%、12%、14%靜態(tài)牽張力（SMS）對健康PDLSCs的增殖及成骨分化具有促進作用，能夠為正畸牙齒移動及牙槽骨重塑創(chuàng)造有利的局部微環(huán)境；但合并牙周炎的患者在接受正畸治療時，炎癥PDLSCs在相同程度SMS的作用下會出現(xiàn)增殖及成骨分化受抑制的狀況，不利于正畸牙齒的移動[3-4]。目前，10%、12%、14%SMS抑制炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的機制尚不十分清楚。

國內學者采用芯片技術檢測了炎癥PDLSCs在SMS作用前后長鏈非編碼RNA（lncRNA）表達的變化，發(fā)現(xiàn)linc00638、Uc011jsq.2、AK021458 3種lncRNAs的變化最為顯著[5]。微小RNA（microRNA，miR）-29a是一種對間充質干細胞成骨分化具有促進作用的miR[6]，筆者通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)linc00638對miR-29a具有靶向調控作用?；诖颂岢黾僭O，炎癥PDLSCs在SMS作用下高表達的linc00638可能靶向miR-29a并削弱其促進成骨分化的作用，進而抑制炎癥PDLSCs的成骨分化。為了驗證這一假設，本研究將以linc00638/miR-29a軸為切入點，研究14%SMS對人炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響及分子機制。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集我院2019年3月—2021年3月期間因正畸治療拔除的健康牙齒8顆及牙周炎牙齒8顆。健康牙齒組男性5例、女性3例，年齡（33.48±6.28）歲；牙周炎牙齒組男性4例、女性4例，年齡（33.71±8.12）歲。本研究均取得患者知情同意。

1.2 試劑

陰性對照（NC）shRNA慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒、miR-NC慢病毒、miR-29a抑制物慢病毒（北京英茂盛業(yè)生物公司，中國）；miR-NC、miR-29a（上海吉瑪生物公司，中國）；linc00638野生型及突變型雙熒光素酶報告基因及檢測系統(tǒng)（Promega公司，丹麥）；MTS法細胞增殖檢測試劑盒（Biovision公司，美國）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅（Sigma公司，美國）；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、lncRNA及miR熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化公司，中國）。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）；酶標儀（Biotek公司，美國）；熒光定量PCR儀（Bio-rad公司，美國）。

1.4 方法

1.4.1 PDLSCs的培養(yǎng)及鑒定 將健康牙齒和牙周炎牙齒放入4℃無菌的磷酸鹽緩沖液中，在超凈臺下進行牙齒清洗，無菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶，沒過組織塊，37℃下消化1 h，隨后加入等體積含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液以終止消化，組織懸液在離心機中以800 r/min的速度離心5 min，棄去上清液，保留沉淀，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸并接種在培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)3～7 d。當細胞從組織塊周圍爬出且密度達到90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代PDLSCs并采用流式細胞術進行干細胞特性鑒定，分別對干細胞標志物CD29、CD105進行檢測，陽性率均達到99%以上。

1.4.2 PDLSCs的分組及干預 取第3代PDLSCs，按3×105個/孔的密度將其接種在Bioflex 6孔板中并進行分組，分組實驗分為3個部分。

第1部分實驗探究不同程度SMS的生物學效應：對照組不給予SMS；在FX-4000T牽張力加載系統(tǒng)上給予SMS，10%、12%、14%SMS組分別給予力值10%、12%、14%及頻率0.1 Hz的SMS干預。各組均持續(xù)12 h。

第2部分實驗探究linc00638在14%SMS中的作用：細胞分為sh-NC組、sh-NC+14%SMS組、shlinc00638+14%SMS組，分別進行NC shRNA慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒感染[感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=30]，感染72 h后在FX-4000T牽張力加載系統(tǒng)上給予14%SMS，持續(xù)12 h。

第3部分實驗探究miR-29a在linc00638調控中的作用：細胞分為sh-NC+miR-NC組、sh-NC+miRNC+14%SMS組、sh-linc00638+miR-NC+14%SMS組、sh-linc00638+miR-29a+14%SMS組，分別進行NC shRNA慢病毒聯(lián)合miR-NC慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒聯(lián)合miR-NC慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒聯(lián)合miR-29a抑制物慢病毒感染（MOI=30），感染72 h后在FX-4000T牽張力加載系統(tǒng)上給予14%SMS，持續(xù)12 h。

1.4.3 細胞增殖的檢測 各組細胞加載SMS 12 h后進行細胞增殖的檢測，每孔加入MTS法檢測液500μL，繼續(xù)孵育4 h后充分混勻，每孔取50μL液體加入96孔培養(yǎng)板內，在酶標儀上檢測405 nm波長處的吸光度值（A405）。

1.4.4 細胞成骨分化的誘導及檢測 配制含有0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清的成骨誘導培養(yǎng)液，應用SMS干預12 h后更換為成骨誘導培養(yǎng)液，進行成骨誘導分化。誘導分化過程中，每2天更換1次成骨誘導培養(yǎng)液。第14天時，收集細胞并進行漂洗，用0.1%茜素紅在37℃下染色30 min，在顯微鏡下觀察鈣結節(jié)形成情況并拍照記錄，而后加入10%氯化十六烷基吡啶（500μL/孔），使鈣結節(jié)充分溶解后取50μL液體加入96孔培養(yǎng)板內，在酶標儀上檢測490 nm波長處的吸光度值（A490）。

1.4.5 linc00638、mi R-29a表達的檢測 各組細胞加載SMS 12 h后進行l(wèi)inc00638、miR-29a表達的檢測。首先采用RNA提取試劑盒分離得到細胞中的RNA，而后采用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉錄合成為cDNA，最后分別采用lncRNA及miR熒光定量檢測試劑盒對linc00638及miR-29a進行熒光定量PCR擴增，同時也對內參U6進行熒光定量PCR擴增。擴增反應程序如下：95℃15 min，94℃20 s、60℃34 s，重復40個循環(huán)。反應結束后生成循環(huán)曲線并得到循環(huán)閾值，以U6為內參，計算linc00638、miR-29a的表達水平。

1.4.6 在線生物信息學分析 在Starbase3.0網(wǎng)站（https://starbase.sysu.edu.cn）進行在線生物信息學分析，輸入linc00638的基因信息，分析linc00638序列中與miR-29a互補配對結合的堿基位點。

1.4.7 雙熒光素酶報告基因實驗 在24孔培養(yǎng)板內接種炎癥PDLSCs，將linc00638野生型及突變型雙熒光素酶報告基因與miR-NC或miR-29a共同轉染進入細胞，24 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對細胞內的海腎熒光值及螢火蟲熒光值進行檢測，按照公式（熒光活力=螢火蟲熒光值/海腎熒光值）計算報告基因的熒光活力。

1.4.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義的資料進一步采用LSD-t檢驗兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 10%、12%、14%SMS對健康PDLSCs及炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響

在健康PDLSCs中，與對照組比較，10%、12%、14%SMS組的增殖A490、茜素紅A405均明顯增加（P＜0.05），且隨SMS越大，增殖A490、茜素紅A405越高；在炎癥PDLSCs中，與對照組比較，10%、12%、14%SMS組的增殖A490、茜素紅A405均明顯降低（P＜0.05），且隨SMS越大，增殖A490、茜素紅A405越低。詳見圖1。

圖1 各組健康PDLSCs及炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的比較Figure 1 Comparison of proliferation and osteogenic differentiation between healthy PDLSCs and inflammatory PDLSCs in each group

2.2 10%、12%、14%SMS對健康PDLSCs及炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638、miR-29a表達水平的影響

在健康PDLSCs中，對照組linc00638、miR-29a表達水平與10%、12%、14%SMS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在炎癥PDLSCs中，與對照組比較，10%、12%、14%SMS組linc00638的表達水平明顯增加，miR-29a的表達水平明顯降低（P＜0.05），且隨SMS越大，細胞中l(wèi)inc00638表達水平越高、miR-29a表達水平越低。詳見圖2。

圖2 各組健康PDLSCs及炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638、miR-29a表達水平的比較Figure 2 Comparison of linc00638 and miR-29a expression levels betweem healthy PDLSCs and inflammatory PDLSCs in each group

2.3 敲低linc00638對14%SMS調控炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響

與sh-NC組比較，sh-NC+14%SMS組炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638的表達水平明顯增加，增殖A490、茜素紅A405均明顯降低（P＜0.05）；與sh-NC+14%SMS組比較，sh-linc00638+14%SMS組炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638的表達水平明顯降低，增殖A490、茜素紅A405均明顯增加（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 敲低linc00638對14%SMS調控炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響Figure 3 Effect of knockdown of linc00638 on 14%SMS regulating proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory PDLSCs

2.4 敲低linc00638對14%SMS調控炎癥PDLSCs中miR-29a表達的影響

與sh-NC組比較，sh-NC+14%SMS組炎癥PDLSCs中miR-29a的表達水平明顯降低（P＜0.05）；與sh-NC+14%SMS組比較，sh-linc00638+14%SMS組炎癥PDLSCs中miR-29a的表達水平明顯增加（P＜0.05）。詳見圖4。

圖4 敲低linc00638對14%SMS調控炎癥PDLSCs中miR-29a表達的影響Figure 4 Effect of knockdown of linc00638 on 14%SMS regulating miR-29a expression in inflammatory PDLSCs

2.5 炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638靶向miR-29a的生物信息學及雙熒光素酶報告基因驗證

linc00638靶向miR-29a的生物信息學預測分析結果見圖5A；與miR-NC組比較，miR-29a組炎癥PDLSCs中野生型linc00638報告基因的熒光活力明顯降低（P＜0.05），突變型linc00638報告基因的熒光活力無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖5。

圖5 炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638靶向miR-29a的驗證Figure 5 Validation of linc00638 targeting miR-29a in inflammatory PDLSCs

2.6 抑制miR-29a對敲低linc00638促進14%SMS作用下炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響

與sh-NC+miR-NC組比較，sh-NC+miR-NC+14%SMS組炎癥PDLSCs的miR-29a表達水平、增殖A490、茜素紅A405均明顯降低（P＜0.05）；與sh-NC+miR-NC+14%SMS組比較，sh-linc00638+miR-NC+14%SMS組炎癥PDLSCs中的miR-29a表達水平、增殖A490、茜素紅A405均明顯增加（P＜0.05）；與shlinc00638+miR-NC+14%SMS組比較，sh-linc00638+miR-29a+14%SMS組炎癥PDLSCs的miR-29a表達水平、增殖A490、茜素紅A405均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖6。

圖6 抑制miR-29a對敲低linc00638促進14%SMS作用下炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的影響Figure 6 Effects of miR-29a inhibition on knockdown of linc00638 promoting proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory PDLSCs intervened by 14%SMS

3 討論

PDLSCs是存在于牙周組織中的間充質干細胞，其具有自我更新及多向分化的潛能，參與牙周組織的再生和修復。在正畸治療過程中，正畸牙齒移動與正畸力作用下牙槽骨的改建有關，PDLSCs在正畸力作用下發(fā)生成骨分化在牙槽骨改建中起重要作用[7-8]。臨床研究證實，與牙周組織健康的正畸患者比較，牙周炎患者對相同等級正畸力的反應較為緩慢[9-10]，可能的原因是炎癥狀態(tài)下PDLSCs對正畸力的耐受性下降，其在正畸力作用下發(fā)生的增殖及成骨分化均會受到影響，進而不利于牙槽骨的改建及正畸牙齒的移動。

國內外的多項正畸與PDLSCs相關的細胞實驗發(fā)現(xiàn)，10%～14%SMS對健康PDLSCs的增殖和成骨分化均具有促進作用，但同等級的SMS對炎癥PDLSCs的增殖和成骨分化卻產(chǎn)生抑制作用[3-4]。這些研究的結果與臨床上牙周炎患者在正常正畸力作用下牙齒移動緩慢的現(xiàn)狀相吻合。本研究也對不同SMS作用下健康PDLSCs與炎癥PDLSCs的差異表現(xiàn)進行了驗證，給予10%～14%的SMS干預12 h后，健康PDLSCs的增殖活力及成骨分化水平均明顯增強，炎癥PDLSCs的增殖活力及成骨分化水平均明顯減弱，上述結果與國內外已有的研究結果[3-4]一致，但炎癥PDLSCs在10%～14%SMS作用下，增殖及成骨分化受抑制的分子機制尚不十分清楚。

表觀遺傳學機制是近些年干細胞成骨分化相關機制的研究熱點，lncRNAs及miRs在轉錄后水平實現(xiàn)基因表達的表觀遺傳學調控[11-13]。秦文等[5]通過芯片技術發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs的差異表達與SMS作用下炎癥PDLSCs生物學特性的變化有關，其中l(wèi)inc00638是SMS干預后表達差異顯著的lncRNA之一。Zhang等[14]和Wen等[15]的2項研究分別在椎間盤退行性變及關節(jié)滑膜炎癥改變中證實，linc00638發(fā)揮了生物學作用。本研究在SMS干預后檢測到炎癥PDLSCs中l(wèi)inc00638表達明顯增加，而健康PDLSCs中l(wèi)inc00638表達無明顯變化。健康及炎癥PDLSCs在SMS作用下，linc00638表達的差異可能是造成細胞增殖及成骨分化差異的分子機制。為了驗證linc00638在SMS作用下炎癥PDLSCs增殖及成骨分化中的調控作用及機制，本研究通過慢病毒感染的方式敲低linc00638的表達，在敲低linc00638后進行14%SMS的干預，結果發(fā)現(xiàn)細胞增殖活力及成骨分化均明顯增強，表明SMS作用下linc00638表達增加對炎癥PDLSCs的增殖和成骨分化具有抑制作用。

LncRNA能夠通過“分子海綿”的作用機制吸附miR、削弱miR對靶基因的調控作用，進而產(chǎn)生不同的生物學效應。在間充質干細胞增殖及成骨分化過程中，miR-29a是起到促進作用的miR[16-17]。本研究通過在線生物信息學分析已經(jīng)預測linc00638中存在與miR-29a互補配對的序列，同時雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-29a能夠使linc00638野生型報告基因的熒光活力降低，表明linc00638靶向miR-29a并通過“分子海綿”的作用吸附miR-29a?；诖?，本研究進一步分析了linc00638/miR-29a軸在調控炎癥PDLSCs增殖及成骨分化中的作用。在SMS干預后，炎癥PDLSCs中miR-29a的表達水平明顯降低，而健康PDLSCs中miR-29a的表達水平無明顯變化，這與炎癥及健康PDLSCs在SMS作用下linc00638表達的變化趨勢一致。在敲低linc00638的同時抑制miR-29a，而后進行14%SMS干預，結果發(fā)現(xiàn)通過敲低linc00638，14%SMS對炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的促進作用發(fā)生逆轉，表明linc00638調控炎癥PDLSCs增殖及成骨分化的作用與miR-29a有關。

綜上所述，炎癥PDLSCs在SMS作用下增殖及成骨分化能力減弱會影響牙周炎患者的正畸效果。本研究通過細胞實驗初步探究了炎癥PDLSCs在SMS加載下增殖及成骨分化減弱的分子機制，linc00638/miR-29a軸在這一過程中發(fā)揮重要調控作用。SMS作用于炎癥PDLSCs能夠增加linc00638的表達，通過linc00638的“分子海綿”作用機制與miR-29a結合，進而削弱miR-29a促進干細胞增殖及成骨分化的作用，最終抑制炎癥PDLSCs的增殖及成骨分化。這為今后深入認識牙周炎患者正畸牙齒移動慢的分子機制提供了實驗依據(jù)，也為促進牙周炎患者正畸過程中PDLSCs的增殖及成骨分化提供了新的治療思路。