李琳，杜倩，劉鐵男，王琪瑤，梁素鈺，田松巖，柳參奎

(1.黑龍江省生態(tài)研究所森林生態(tài)與林業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081；2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300)

0 引言

土壤是地球系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物是土壤中最活躍的組分，其多樣性和活性是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定的基礎(chǔ)。土壤微生物不僅受地表植被影響，而且還通過自身變化對植被做出反應(yīng)，形成與植被相互作用的反饋系統(tǒng)[1-3]。黃河三角洲地區(qū)鹽生植被演替過程中，土壤微生物代謝活性、功能多樣性以及土壤環(huán)境顯著優(yōu)化[4-5]，微生物群落結(jié)構(gòu)同樣對植被演替有一定響應(yīng)[6-7]。同時(shí)，土壤微生物也反作用于植物，如石油污染鹽堿地土壤分離的克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)菌株能夠促進(jìn)高羊茅(Festucaelata)植被生長[8]。由此可見，鹽堿地植被演替過程中土壤微生物可能發(fā)揮了一定作用，研究鹽堿地土壤微生物群落功能多樣性對鹽堿地退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)具有科學(xué)意義。

松嫩平原鹽堿地是世界三大蘇打鹽堿地分布區(qū)域之一[9]，是我國次生鹽漬化最嚴(yán)重的地區(qū)[10]，土壤陰離子以碳酸根、碳酸氫根為主，土壤pH較高，在嚴(yán)重鹽堿地分布中堿性斑塊(pH>10)伸展較長且不間斷[11-12]。柳參奎等[13]利用微客土技術(shù)對安達(dá)地區(qū)鹽堿地進(jìn)行恢復(fù)，15 a從堿斑逐步恢復(fù)到羊草(Aneurolepidiumchinense)頂級群落，并伴生蒙古柳(Salixlinearistipularis)、直穗粉花地榆(Sanguisorbagrandiflora)等灌木，為研究松嫩平原蘇打鹽堿地土壤微生物多樣性與植被演替關(guān)系提供了很好的研究基礎(chǔ)。本研究采用Biolog Eco微平板法，對松嫩平原鹽堿地自然演替序列和人工恢復(fù)后不同植被土壤微生物群落代謝水平(Community-Level Physiological Profiles，CLPP)及微生物功能多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，并結(jié)合土壤理化性狀進(jìn)行相關(guān)性研究，探尋松嫩平原蘇打鹽堿地土壤微生物功能多樣性隨植被演替的變化規(guī)律，以期為鹽堿地植被演替研究提供重要參考依據(jù)，為松嫩平原生態(tài)恢復(fù)和利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 研究區(qū)概況與材料、方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于安達(dá)實(shí)驗(yàn)基地(46°27′N，125°22′E)和肇東實(shí)驗(yàn)林場(46°20′N，125°36′E)，地處松嫩平原腹地，以溫帶大陸性季風(fēng)氣候?yàn)橹鳎昃鶜鉁?.2 ℃，年均降水量400～650 mm，其中80%～90%發(fā)生在生長期(5—9月)。土壤為典型的富含碳酸鹽和碳酸氫鹽的鈣黑土，pH較高。自然狀態(tài)下，植被演替過程為堿斑(Alkaline Patches)→堿蓬(Suaedakomarovii)+星星草(Puccinelliatenuiflora)→堿蓬+星星草+伴生種→羊草+伴生種→羊草，如圖1所示。

Ap,堿斑; Sk,堿蓬; Pt,星星草; Ac,羊草。

1.2 土壤樣品采集與保存

依據(jù)《森林生態(tài)系統(tǒng)長期研究觀測方法》(GB/T 33027—2016)采集土壤樣品，樣地植被信息見表1。堿斑及人工林樣地內(nèi)“S”形選取9點(diǎn)，土鉆采集0～20 cm土壤，去除植物根系和大塊雜質(zhì)，每3個(gè)取樣點(diǎn)樣品混合為1個(gè)土壤樣品。草本植物群落樣地內(nèi)隨機(jī)選取9個(gè)20 cm×20 cm樣方，樣方內(nèi)全部植被連根挖出，抖落大塊疏松土壤，將附著于根部的土壤用毛刷收集到無菌自封袋內(nèi)，每3個(gè)樣方土壤混合為1個(gè)土壤樣品。土壤樣品置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室過2 mm篩除根系、石塊等雜質(zhì)，均分為2份，一份于4 ℃冰箱內(nèi)保存，1周內(nèi)進(jìn)行微生物群落代謝水平測定；一份于通風(fēng)處陰干，用于土壤理化性質(zhì)測定。

表1 樣地植被信息

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

1.4 土壤微生物群落代謝水平測定

采用Biolog Eco微平板(Biolog，美國)對不同植被土壤微生物群落代謝水平進(jìn)行分析。稱取相當(dāng)于10 g烘干土質(zhì)量的新鮮土壤樣品，加入90 mL無菌磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH7.0)于三角瓶內(nèi)，250 r/min震蕩30 min，吸取上清液，按10倍稀釋法稀釋至10-3，吸取150 μL接種到Biolog Eco微平板上，28 ℃培養(yǎng)10 d，每24 h用酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)測定590 nm和750 nm波長下的吸光度。

每孔平均吸光度(Average Well Color Development，AWCD,公式中用AWCD表示)代表微生物群落代謝水平，可反映利用不同碳源的土壤微生物總體情況[14]，計(jì)算公式為

AWCD=∑(Ci-R)/n。

(1)

式中：Ci為第i孔吸光度差值(OD590—OD750)；R為對照孔吸光度；n為碳源數(shù)(31)。

基于吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)(H)、Shannon 豐富度指數(shù)(E)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D) 和 McIntosh 指數(shù)(U)，其可代表微生物群落功能多樣性[15-16]，計(jì)算公式為

H=-∑Pi/lnPi；

(2)

E=H/Hmax=H/lnS；

(3)

D=1-∑P2i；

(4)

(5)

式中：Pi為第i孔相對吸光度與整個(gè)平板相對吸光度的比值；S為每孔中相對吸光度大于0.2的孔數(shù)；ni為第i孔的相對吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

選取96 h Biolog Eco微平板獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性指數(shù)、碳源代謝水平及相關(guān)性分析，這一微生物代謝最活躍的時(shí)期為對數(shù)生長期[17]。AWCD、多樣性指數(shù)采用基于Microsoft Excel VBA的自動(dòng)化程序A-BEP-DSAS計(jì)算[18]。碳源代謝水平使用R軟件pheatmap包進(jìn)行。為分析不同環(huán)境因子與碳源代謝水平的相關(guān)性，采用CANOCO 4.5進(jìn)行冗余分析(Leps and Smilauer 2003)。應(yīng)用單因素(ANOVA) 和Tukey's法進(jìn)行方差分析和多重比較，利用Pearson相關(guān)系數(shù)對土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行相關(guān)分析。運(yùn)用Excel 2010軟件作圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

鹽堿地不同演替階段土壤理化性質(zhì)見表2。堿斑-強(qiáng)耐鹽堿植物(堿蓬、星星草)-輕耐鹽堿植物(羊草)自然演替序列下(N1→N5)，土壤密度、總含鹽量和pH呈下降趨勢，土壤肥力指標(biāo)和土壤碳特性呈升高趨勢。人工恢復(fù)后，土壤密度、總含鹽量、pH由大到小順序?yàn)椋翰荼局参锶郝?RV1、RV2)、灌草植物群落(RV3—RV7)、人工林植物群落(RV8—RV12)，土壤肥力指標(biāo)和土壤碳特性由大到小順序?yàn)椋汗嗖葜参锶郝?RV3—RV7)、人工林植物群落(RV8—RV12)、草本植物群落(RV1、RV2)。

表2 不同植物群落土壤理化性質(zhì)Tab.2 Soil physical and chemical properties of different phytocoenosium (mean±SD)

2.2 土壤微生物群落碳源利用特征

Biolog Eco微孔板每孔平均吸光度(AWCD)可表明自然演替階段和不同恢復(fù)階段土壤微生物群落碳源利用情況。由圖2可知，各樣品每孔平均吸光度曲線在240 h內(nèi)呈“S”形增長，24～96 h樣品微生物呈快速增長趨勢，草本及灌草群落在96 h后增長趨勢逐步趨于平緩，喬木群落在168 h后增長趨勢趨于平緩。自然演替過程中圖2(a)，堿斑(N1)土壤微生物碳源利用幾乎無增長，高耐鹽植物群落(N2、N3)土壤微生物碳源利用顯著(P<0.05)低于低耐鹽植物群落(N5、N6)?？屯良夹g(shù)恢復(fù)后植物群落AWCD曲線圖2(b)顯示，草本群落(RV1、RV2)與自然演替序列高耐鹽植物(N2、N3、N4)土壤微生物群落碳源利用趨勢相同，顯著(P<0.05)低于灌草群落(RV3—RV7)土壤微生物群落，客土恢復(fù)后灌草群落土壤微生物群落碳源利用趨勢與自然演替下羊草群落(N5、N6)相似。人工林群落圖2(c)土壤微生物AWCD曲線對數(shù)增長期較長，從24 h持續(xù)到168 h。

(c) 人工林恢復(fù)后不同林型

進(jìn)一步分析不同演替階段土壤微生物對6類碳源的利用情況，由圖3可知，各樣品中微生物群落分布明顯不同。自然演替序列下，堿斑土壤樣品中利用氨基酸類碳源微生物的活性顯著高于其他類型碳源，利用羧酸類、胺類和酚類碳源微生物的活性極低?？屯粱謴?fù)及人工林種植后，土壤微生物群落利用碳源根據(jù)植物群落不同具有各自特性。

圖3 不同演替階段土壤微生物群落對6種碳源的相對利用率Fig.3 Relative utilization rate of soil microbial community to six types of carbon sources under different re-vegetation stages

2.3 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分析

根據(jù)96 h AWCD計(jì)算土壤微生物Shannon物種豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh物種均勻度指數(shù)，反映樣品土壤微生物群落功能多樣性，由表3和表4可知，不同演替階段土壤微生物功能多樣性指標(biāo)存在差異。Shannon指數(shù)表明碳源利用數(shù)量，自然演替序列下表現(xiàn)為輕度耐鹽堿植被高于重度耐鹽堿植被、高于堿斑土壤，植被恢復(fù)后也表現(xiàn)相同趨勢，由大到小為：喬木群落、灌木-草本群落、草本群落，但喬木與灌草群落之間差異不顯著(P>0.05)。不同演替階段及恢復(fù)后的Simpson優(yōu)勢度指數(shù)表明部分優(yōu)勢菌生長隨植被演替進(jìn)行而增加，但差異不顯著(P>0.05)。McIntosh指數(shù)則表明土壤微生物在碳源數(shù)量和利用程度上的差異，由大到小順序?yàn)椋汗嗄?草本群落、草本群落、喬木群落。

表3 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Tab.3 Functional diversity indices of soil microbial communities

表4 平均吸光度值、土壤微生物多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients between AWCD, soil microbial diversity indices and physicochemical properties

相關(guān)分析結(jié)果(表4)表明，AWCD 與全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)、總有機(jī)碳、微生物生物量碳和含水率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與土壤密度、pH和土壤鹽度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。土壤密度、pH和土壤鹽度與3種多樣性指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與有機(jī)質(zhì)、全氮和有機(jī)碳含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

2.4 不同演替階段土壤微生物功能多樣性冗余分析(RDA)

采用冗余分析(RDA)探討環(huán)境因素對土壤微生物碳源利用的影響，由圖4可知，第一軸和第二軸分別占方差的 45.6%和 6.2%。環(huán)境因子即土壤理化性質(zhì)用箭頭表示，箭頭之間的夾角代表相關(guān)性，夾角越小，相關(guān)性越高。土壤肥力指標(biāo)及土壤碳特征之間呈正相關(guān)，與土壤密度、土壤含鹽量和土壤pH呈負(fù)相關(guān)。土壤肥力指標(biāo)及土壤碳特征與微生物碳源代謝呈正相關(guān)，其中對土壤氨基酸類、多聚物類、酚類及胺類碳源利用影響相對較大。樣方之間的距離代表樣方之間的相異程度，樣方點(diǎn)到環(huán)境因子的投影點(diǎn)，可以表示該環(huán)境因子的值在樣方內(nèi)的情況。自然演替序列與客土恢復(fù)后草本(RV1、RV2)與其他植物群落碳源利用上存在一定差異，而客土恢復(fù)后蒙古柳(RV7)群落具有其特異的碳源利用方式。

SBD,密度; TSC,土壤總含鹽量; pH,土壤pH; SMC,土壤含水率; SOM,土壤有機(jī)質(zhì)含量;STN,土壤總氮含量; STP,土壤總磷含量; STK,土壤總鉀含量；TOC,土壤總有機(jī)碳含量; WOC,土壤水溶性有機(jī)碳含量; MBC,土壤微生物生物量碳含量。

3 結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)以及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力,參與到土壤生態(tài)系統(tǒng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，不僅直接影響土壤理化性質(zhì)，也間接影響植物生長[19-20]。杜瀅鑫等[21]對石油污染鹽堿地9種不同植物根際土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同植物根際土壤細(xì)菌群落對底物碳源的代謝特征存在著一定差異。楊賽等[22]對東北蘇打鹽堿土植被演替下的土壤微生物進(jìn)行高通量測序，獲得377屬細(xì)菌、169屬真菌。裴振等[23]探討了黃河三角洲地區(qū)土壤微生物碳源代謝水平與鹽生植被演替的關(guān)系。本研究利用Biolog Eco微平板技術(shù)對松嫩平原鹽漬土壤植被演替與土壤微生物功能多樣性的關(guān)系進(jìn)行探討，為松嫩平原鹽堿地植被演替下的土壤微生物群落研究提供了更加豐富的數(shù)據(jù)。

松嫩平原鹽漬土壤自然演替序列下，隨著植被從堿斑土壤向頂級羊草群落演替，微生物利用碳源種類有所增加。堿斑土壤對各種碳源的利用極低，強(qiáng)耐堿植被堿蓬為典型1年生聚鹽植物，植被死亡后儲(chǔ)存在植物內(nèi)的鹽分歸還于土壤，導(dǎo)致其根際土壤pH有時(shí)會(huì)高于堿斑土壤(表2)，因此土壤微生物群落碳源利用與同是強(qiáng)耐堿植被星星草存在很大差異，其中星星草土壤微生物對肝糖(Glycogen，C5)的利用顯著高于堿蓬。羊草群落利用酚類(丙酮酸甲脂、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄胺)及多聚物類(吐溫40、吐溫80)碳源的能力高于堿蓬群落，尤其是肝糖的利用隨著植被演替呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢。由客土恢復(fù)及人工林種植后不同植物群落對碳源的利用情況可知，植被從草本演替到灌草群落，微生物利用碳源能力有所增加，而向木本植物演替過程中，微生物利用碳源能力降低，微生物多樣性并沒有顯著增加，而微生物的均勻度也有所下降(表3)。造成這一現(xiàn)象的原因可能是木本植物生長受土壤理化性質(zhì)的影響更大，鹽漬土壤上種植樹木雖然能夠存活，但是生長緩慢，凋落物及細(xì)根周轉(zhuǎn)受限，從而影響土壤有機(jī)質(zhì)、土壤全氮、全磷含量，因此木本植物群落的微生物群落多樣性及碳源利用能力要低于灌草群落。這一結(jié)果說明，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、pH是引起微生物碳源代謝發(fā)生分異的重要因素[24-26]。

植物群落與土壤微生物多樣性之間存在相互作用。裴振等[23]研究表明土壤微生物群落多樣性指數(shù)隨著鹽生植被演替顯著增加，土壤微生物群落趨于更加穩(wěn)定的系統(tǒng)，許多研究也發(fā)現(xiàn)不同植物群落下土壤微生物種類的差異性[27-28]。不同植被根際向土壤中釋放的分泌物及凋落物組成不同，對偏好性微生物進(jìn)行富集，導(dǎo)致了微生物群落差異性，從而影響微生物對碳源的利用。自然演替序列下，堿斑土壤微生物主要利用多聚物、氨基酸及糖類碳源，對酚類、胺類及羧酸類碳源利用極低，隨著演替進(jìn)行，微生物利用碳源種類更加豐富，利用碳源數(shù)量增多，但不同植物群落對碳源的利用存在一定偏好性。

綜上，隨著演替進(jìn)行，土壤微生物AWCD顯著增加(P<0.05)，微生物利用碳源種類有所增加，客土技術(shù)恢復(fù)后草本及灌草植物群落土壤微生物利用碳源數(shù)量最多，而人工林植物群落利用碳源數(shù)量反而降低。不同植物群落下土壤微生物AWCD、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與土壤密度、pH和總鹽含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。