江燕

(廣東省城市技師學(xué)院 廣東廣州 510000)

殼聚糖是一種白色無定形、半透明、略帶珍珠色的固體。由于原料不同，制備方法不同，相對分子量從幾十萬到幾百萬不等。殼聚糖及其衍生物無毒、無害，具有較好的保濕性、滲透性、電解性、降解性、吸附性、吸濕性，使其在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、水處理、紡織、化工、化妝品等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。此外，殼聚糖具有抗菌、殺菌、抗腫瘤、增強免疫力、促進組織修復(fù)及止血等生物活性，使其在醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，建立殼聚糖的定量分析方法尤為重要。

目前，國內(nèi)、外殼聚糖的含量測定方法主要有電化學(xué)法、分光光度法、高效液相色譜法、滴定分析法、紅外光譜法等。受國內(nèi)實驗條件的限制以及沒有殼聚糖純品，殼聚糖含量的測定仍采用間接測定為主，即先將殼聚糖水解成氨基葡萄糖，再用HPLC-折光測定法或分光度法對單糖定量。該文利用超聲波具有空化作用、機械力和熱效應(yīng)作用，用于輔助酸水解殼聚糖生成D-氨基葡萄糖，在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)生成吡咯，然后與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)生成紅色化合物，在波長525 nm 處測定，在標準系列的葡萄糖鹽酸質(zhì)量作為橫坐標，對應(yīng)的吸光度為縱坐標的工作曲線上查得對應(yīng)的氨基葡萄糖質(zhì)量，從而間接測定殼聚糖的含量[1]。

1 材料

1.1 材料與試劑

材料：殼聚糖。試劑：鹽酸、硫酸、冰乙酸、無水碳酸鈉、乙酰丙酮、無水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛，均為AR。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平、水浴恒溫振蕩器、超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱、可見分光光度計。

2 方法

2.1 溶液的配制

乙酰丙酮溶液：準確吸取乙酰丙酮2.00 mL，加入1 moL/L碳酸鈉溶液至50 mL，置冰箱中備用，應(yīng)于使用前一日配制。

對二甲氨基苯甲醛溶液：稱取4-（二甲氨基）苯甲醛0.8 g，加無水乙醇15 mL及鹽酸15 mL，搖勻。

氨基葡萄糖酸的標準溶液：在105 ℃干燥至0.050 0 g氨基葡萄糖酸在50 mL 容量瓶中，溶于水并稀釋成水垢，搖勻，去除2 mL，置于100 mL 容量瓶中，加水至水垢中，搖勻。

殼聚糖溶液：稱取60 ℃干燥至恒重的殼聚糖0.5 g（準確至0.000 2 g），加入1%的醋酸溶液，待其完全溶解后，定容于100 mL容量瓶中。

2.2 水解殼聚糖

取10 mL 比色管，依次準確地吸取殼聚糖溶液1.00 mL，分別加入一定濃度、體積的鹽酸和硫酸，混勻，置于沸水中水浴一段時間，一定溫度下超聲一段時間，取出冷卻至室溫，把溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH 為7.2～7.5，用蒸餾水定量刻度，搖勻，放到一邊。

2.3 鹽酸氨基葡萄糖標準曲線的繪制

分別移取鹽酸氨基葡萄糖的標準溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL置于10 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至5.00 mL，分別加入乙酰丙酮溶液1.00 mL，搖勻，置于90 ℃水浴靜置25 min，取出，迅速用流動水冷卻，加入無水乙醇3.00 mL，于60 ℃水浴靜置10 min后，再加入對二氨基苯甲醛溶液1.00 mL，用力搖勻后，于60 ℃水浴靜置60 min，取出立即用冷水冷卻至室溫，在波長525 nm處，用1 cm比色皿，以試劑空白為參比液，測其吸光度值。工作曲線以標準系列鹽酸氨基葡萄糖為水平坐標，吸光度值為垂直坐標。

2.4 殼聚糖含量的測定

移取殼聚糖水解溶液1.00 mL 置于比色管中，按2.3的步驟測定其吸光度值。

以質(zhì)量分數(shù)表示殼聚糖含量ω1，按公式（1）計算：

式（1）中：m1為由工作曲線查得的鹽酸氨基葡萄糖的質(zhì)量，單位為mg；m為用于測定吸光度的殼聚糖質(zhì)量，單位為mg；0.746 6 為鹽酸氨基葡萄糖折算為殼聚糖的系數(shù)。

公式（1）是以鹽酸氨基葡萄糖折算為殼聚糖的系數(shù)計算殼聚糖含量。

2.5 產(chǎn)率的計算

產(chǎn)率按以下（2）公式計算：

式（2）中：m1為由工作曲線查得的鹽酸氨基葡萄糖的質(zhì)量，單位為mg；M1為鹽酸氨基葡萄糖的相對分子質(zhì)量；m2為用于測定吸光度的殼聚糖質(zhì)量，單位為mg；M2為殼聚糖的相對分子質(zhì)量[2]。

3 結(jié)果與分析

3.1 鹽酸氨基葡萄糖-吸光度標準曲線

在波長525 nm處測定吸光度值，以鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量m為橫坐標，單位為mg，對應(yīng)的吸光度A為縱坐標，繪制鹽酸氨基葡萄糖～吸光度標準曲線，得回歸方程為A=6.0171m+0.0081，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

3.2 水解條件的選擇

3.2.1 樣品量對殼聚糖含量測定的影響

分別吸取3.00 mg/mL、5.00 mg/mL、7.00 mg/mL、10.00 mg/mL、15.00 mg/mL的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，搖勻，置于沸水中水浴25 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。結(jié)果顯示樣品量為5.00 mg時測定殼聚糖含量最高，隨著樣品量的增加，水解程度逐漸降低。

3.2.2 水浴時間對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL、75%硫酸3.50 mL，搖勻，分別在沸水中水浴10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，取出，置于50℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[3]。

結(jié)果表明，在實驗條件下，隨著水浴時間延長，殼聚糖逐漸被水解，當水浴時間達到30 min時，測定的殼聚糖含量最高，隨后則有所下降。這是由于隨著時間延長，殼聚糖糖苷鍵逐漸被打斷，但在濃酸和長時間高溫水解情況下，會出現(xiàn)焦化現(xiàn)象，導(dǎo)致氨基葡萄糖產(chǎn)率下降。

3.2.3 鹽酸用量對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL的殼聚糖溶液1.00 mL，分別加入0.168 mol/L 鹽酸0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL，75%硫酸3.50 mL，搖勻，置于沸水中水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。

從試驗結(jié)果可看出鹽酸用量為0.80 mL 殼聚糖含量最高，隨著鹽酸用量的增加殼聚糖含量顯著下降。

3.2.4 硫酸濃度對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，分別加入65%、70%、75%、80%、85%的硫酸3.50 mL，搖勻，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[4]。

硫酸濃度越高反應(yīng)越充分，但同時也伴隨副反應(yīng)的發(fā)生，水解產(chǎn)物的碳化也越嚴重，當硫酸濃度達85%時，溶液呈現(xiàn)為棕褐色，所以選擇濃度為70%的硫酸。

3.2.5 硫酸用量對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL搖勻，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。

硫酸用量過少，則體系粘度大，易引起局部焦化且反應(yīng)不充分；如果用量過高，會給后處理調(diào)節(jié)pH 值帶來困難，綜合考慮，硫酸用量為4.00 mL較合適。

3.2.6 超聲時間對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸4.00 mL，搖勻，沸水浴30 min，取出，50 ℃分別超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min、70 min、80 min、90 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量，結(jié)果證明超聲時間為70 min 測定殼聚糖含量最高。

3.2.7 超聲溫度對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸4.00 mL搖勻，沸水浴30 min，取出，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃條件下超聲70 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[5]。

結(jié)果證明：提高超聲溫度略能提高水解反應(yīng)的速率，但效果不明顯；當超聲溫度超過50 ℃，反而減弱了超聲在樣品水解中的促進作用。

3.3 殼聚糖含量的測定

采用正交試驗得到的優(yōu)組合條件進行6次平行驗證試驗，結(jié)果測得殼聚糖含量的均值為76.804%，較單因素試驗中測得的殼聚糖含量低。分析是由于正交試驗所得的最優(yōu)條件組合只是所選因素及其所取水平范圍內(nèi)得到的結(jié)論，這樣的條件就所考查的因素和水平而言，可視為最佳條件；但影響殼聚糖含量測定結(jié)果的因素較多，并未全部納入正交試驗中進行考察，因此采用單因素試驗中的最優(yōu)條件：樣品量2.00 mg，0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，沸水浴30 min，50 ℃超聲60 min進行平行驗證實驗[6]。

該試驗測得的殼聚糖含量為82.89%，產(chǎn)率達83.13%，產(chǎn)率較高，其具體情況如表1所示。

表1 平行驗證試驗（單位：%）

4 結(jié)語

該文通過考察樣品量、鹽酸用量、硫酸用量、硫酸濃度、水浴時間、超聲時間、超聲溫度等因素對殼聚糖水解的影響，確定了適宜的水解條件及工作曲線，并且進行了樣品中殼聚糖含量、精密度及加標回收率的測定。試驗得到的最佳測定條件為：樣品量為2 mg，0.168 mol/L 鹽酸用量0.8 mL，75%硫酸用量3.5 mL，沸水浴30 min，50 ℃超聲60 min，測定的殼聚糖含量達82.89%，精密度為1.21%，平均回收率為97.7%。同時，通過實驗證明采用超聲輔助酸水解殼聚糖的測定結(jié)果明顯高于只用酸水解的測定結(jié)果，表明超聲波對酸水解殼聚糖有明顯的促進作用。試驗結(jié)果證明，該方法操作簡單，測定的準確性和精密度高，采用超聲波輔助酸水解殼聚糖具有減少硫酸用量、縮短水浴時間、提高產(chǎn)量等優(yōu)點，適用于殼聚糖含量的測定。