亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        全內反射熒光顯微研究磷脂支撐膜形成中的片層前沿成長*

        2022-08-28 09:28:20馬貝貝王凡林玲朱濤蔣中英
        物理學報 2022年16期
        關鍵詞:結構實驗

        馬貝貝 王凡 林玲 朱濤 蔣中英?

        1)(伊犁師范大學電子與工程學院,微納電傳感技術與仿生器械重點實驗室,伊寧 835000)

        2)(南京大學物理學院,固體微結構物理國家重點實驗室,南京 210093)

        3)(伊犁師范大學網絡安全與信息技術學院,伊寧 835000)

        基于支撐磷脂雙層膜(SLB)的生物傳感器越來越多地被用于快速測定抗原、檢測細胞色素等.囊泡在襯底的吸附和自發(fā)破裂可形成SLB,最近的研究強調在此過程中考察個體囊泡吸附和破裂的重要性.本研究利用全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)實時監(jiān)測熒光標記的納米級個體囊泡的吸附、破裂,追蹤片層前沿成長動力學過程.結合帶耗散的石英晶體微天平(QCM-D)的表征和分析,發(fā)現囊泡尺寸對片層前沿成長有顯著影響.通過片層前沿平均成長速度(vafv )定量分析片層成長,不同尺寸囊泡的 vafv存在 數量級差異.理論分析小囊泡具有較高的表面濃度(C)和擴散性,加快了片層前沿成長,與實驗值能夠較好地符合.此外,通過全局成長理論模型,解釋了對于相同的片層,前沿加速成長主要取決于C和囊泡破裂時的磷脂丟失率.計算的小囊泡成片層的磷脂丟失率略大于大囊泡,但更大差異的C是片層加速成長程度不同的關鍵.囊泡供應影響片層前沿成長的機理詮釋深化了磷脂在界面再組裝的認識.

        1 引言

        生物膜與細胞的能量轉換、信息傳遞以及物質運輸等生物活動密切相關.為了簡化生物膜體系,開發(fā)出多種仿生膜模型.其中磷脂支撐膜(SLB)具有與生物膜相近的生物物理性質、極高的穩(wěn)定性,可通過多種表征手段研究其形成過程,應用前景廣闊.文獻[1-5]基于SLB 等仿生膜體系,開展了一系列膜物理機理與傳感應用研究.

        SLB 的深入應用要求研究者考察囊泡在襯底吸附、形變破裂等相應的動力學過程,得到可控實驗參數來制備高質量仿生膜[6].有文獻報道了使用具有耗散監(jiān)測的石英晶體微天平(QCM-D)[7]、表面等離振子共振(SPR)[8]等群體表征手段來考察多種實驗條件對SLB 形成的影響.如囊泡特性(磷脂組分[7]、囊泡大小[9,10])、環(huán)境條件(溫度[9,11]、離子類型[12,13]、溶液pH值[14]、鹽濃度[15])和襯底特性(原子組成[16]、表面處理方法[17]).研究者們普遍認為囊泡可在襯底上形成完整的囊泡吸附層或破裂形成支撐膜.當吸附囊泡密度超過臨界覆蓋密度時才會發(fā)生破裂[18,19].囊泡破裂的速度取決于吸附過程中囊泡的形變[20,21].一般來說,隨著囊泡尺寸的增大,其在表面形變越大,破裂率可能更高[22,23].然而小囊泡的膜曲率較大,這可能會促進破裂[24,25].Reimhult等[9]發(fā)現,減小囊泡尺寸可以加快囊泡向SLB 的轉變.不一致的實驗結果增加了研究的不確定性.此外,由于很難捕捉單囊泡吸附和破裂的動力學行為,囊泡在襯底破裂后形成完整支撐膜的中間步驟仍未得到清晰的理解.

        為了進一步研究囊泡向支撐膜轉變中重要的階段,使用熒光顯微鏡、原子力顯微鏡(AFM)[7]、干涉散射顯微鏡技術(iSCAT)[26]等個體表征手段考察囊泡在襯底表面的組裝.AFM 研究表明,單個的囊泡可以破裂形成片層結構[7],該結構的邊界存在磷脂排布缺陷;之后實驗發(fā)現片層邊緣增強了囊泡與表面的黏附性并誘導囊泡破裂,從而催化了SLB 的形成[27];Andrecka等[26]研究表明,只有在多個囊泡緊密接觸條件下,片層結構才能發(fā)生波狀推進形成完整的SLB;Hook 課題組[28]最近報道了片層前沿加速成長.所有研究均表明,片層結構在形成支撐膜過程中的重要性,但片層加速成長本質尚不清楚.不同因素譬如磷脂組分、囊泡尺寸等如何調控片層的前沿成長仍需探究.

        本文在個體囊泡水平上重點考察了囊泡向支撐膜轉變過程中片層的前沿成長.全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)可實時監(jiān)測熒光標記的單納米囊泡在襯底的再組裝,捕獲囊泡破裂后形成片層結構的過程,追蹤片層前沿成長動力學.通過片層前沿平均成長速度(vafv)定量描述不同尺寸囊泡破裂產生的片層前沿成長.此外,使用全局成長模型理解了片層前沿成長的關鍵調控物理參量.研究為SLB的可控制備與應用提供了參考[5,29].

        2 實驗部分

        2.1 磷脂囊泡的制備

        囊泡通過擠出法制備[30].將DOPC 中摻雜1%的DiI 熒光染料,氯仿溶劑通過真空干燥箱除去.在搖床中水化得到多層磷脂囊泡,分別使用100和30 nm 孔徑的聚碳酸酯膜擠出器(Avanti Polar Lipids)制備單層囊泡(補充信息中動態(tài)光散射表征后對應尺寸為112和40 nm).

        2.2 全內反射熒光顯微鏡觀察

        基于OlympusIX-81 TIRFM 采集了囊泡在玻璃表面的沉積過程.將硅膠片黏貼在干凈硼硅酸鹽玻璃上形成艙室,在靜置條件下觀測囊泡向支撐膜的轉變.溫度通過InstecHCS60 冷熱臺控制在25 ℃.使用ImageJ 軟件統(tǒng)計片層數量、面積和囊泡數量.誤差棒表示三次重復實驗的結果.

        2.3 片層前沿成長速度計算

        片層前沿成長速度是基于顯微鏡前后圖像中邊界間的最短距離lmin確定的.ImageJ 軟件標定片層邊緣所有像素點的坐標,使用自編的Python 代碼計算出lmin.拍照時間間隔為 Δt,利用(1)式計算片層前沿成長速度vfv:

        定義片層前沿平均成長速度為單個片層結構前沿成長速度的平均值:

        3 結果與討論

        使用TIRFM 在硼硅酸鹽玻璃上觀察單囊泡形成SLB 的動力學過程.采用漸消逝波激發(fā)玻璃-水界面處的熒光樣品,該顯微技術能夠快速獲取低背景熒光的信息.混摻標記和未標記的囊泡混合物,提高了單個磷脂組裝結構(囊泡/片層)的辨識度.通過這種方式,能夠實時監(jiān)測并追蹤吸附囊泡的表面密度,觀察初始片層的形成,并研究片層的成長動力學.

        所有實驗均在PDMS 艙中靜置的條件下進行.圖1 給出了SLB 形成過程中的熒光圖像,其中吸附囊泡為熒光強度較高的圓點;隨著囊泡破裂形成支撐膜,出現熒光強度偏低的片層結構(紅色箭頭標記).囊泡向片層結構轉變,熒光強度降低,源于單位吸附投影面積磷脂層數的降低、標記與未標記磷脂結構間的融合.隨著片層結構面積的提高,最終形成完整的支撐膜結構.

        圖1 支撐雙層膜形成的動力學過程: 四張典型TIRFM 照片顯示了SLB 形成過程的不同階段.第一次觀測到的囊泡破裂用紅色箭頭標記表示形成了初始片層.比例尺為20 μmFig.1.Spatiotemporal kinetics of the SLB formation: Four typical TIRFM images illustrating different stages of SLB formation.The first observed vesicle rupture is marked with red arrows to indicate the formation of the initial patch.The scale bar is 20 μm.

        采用直徑為40和112 nm 兩種尺寸囊泡,定量考察了片層成長的動力學過程.首先,片層數量小幅提高(圖2(a)),片層所占面積緩慢增長(圖2(b)),表明囊泡破裂形成片層結構,該過程占據了整體成膜時間的約60%—70%;隨后,片層數量達到峰值并降低,同時片層所占面積快速增大.表明囊泡形成大量片層結構后,片層間大量融合并迅速形成了完整的支撐膜.但40 nm 囊泡達到轉變峰值的時間(14 min)明顯早于112 nm 囊泡(50 min).說明尺寸較小的囊泡更易向片層結構轉變.圖2(c)和圖2(d)給出了不同尺寸囊泡在同時段的圖像,可以觀察到小尺寸囊泡有更多的低熒光強度片層面積、數量,并實現了片層間的連接;與之相對,大尺寸囊泡的數量、面積增長緩慢.

        圖2 定量兩種囊泡尺寸下,片層成長動力學(統(tǒng)計區(qū)域為5812 μm2)(a)片層數量隨時間(t)變化;(b)片層歸一化面積隨時間的變化,插圖為局域放大圖;(c)112 nm 囊泡與 (d)40 nm 囊泡的TIRFM 圖像.比例尺為20 μmFig.2.The kinetics of patch growth was quantitatively investigated using two vesicle samples with different sizes (Area of interest is 5812 μm2): (a)The number of patches changes with time (t);(b)the normalized area of patches changes with time.The inset shows the data on enlarged scales;TIRFM images of (c)112 nm vesicles and (d)40 nm vesicles.The scale bar is 20 μm.

        采用前沿成長速度描述了片層成長.將相鄰時間圖片中片層邊界之間的最短距離(lmin)與拍照時間間隔(Δt)之比定義為前沿成長速度(vfv),vfv≈lmin/Δt,某給定時刻的平均成長速度vafv發(fā)現vafv隨時間變大,說明片層的成長是隨時間逐漸加速的.這與其他物理、化學過程中眾多的前沿成長存在顯著差異(一般為恒定或逐漸降低),是囊泡向支撐膜轉變體系特有的動力學現象,下文將進行細致的定量闡述.圖3 給出在773 s 的記錄時間內,112 nm 囊泡的vafv值(<10 nm/s)與40 nm 囊泡的vafv值(10—102nm/s)存在量級區(qū)別,這與之前觀測到的小囊泡更易向片層結構轉變是一致的.

        圖3 片層成長期間觀察到的代表性圖像以及 vafv 對時間的依賴性,顏色指代了其前沿的成長速度 (a)112 nm 囊泡;(b)40 nm囊泡.比例尺為20 μmFig.3.Representative images observed during the patch growth and the dependence of vafv on t,colors refer to the growth rate of patch boundary: (a)112 nm vesicles;(b)40 nm vesicles.The scale bar is 20 μm.

        圖4(a)給出了不同尺寸囊泡形成初始片層、片層數量峰值以及完全成膜的時間.發(fā)現囊泡尺寸對形成初始片層的時間沒有明顯影響,但對后兩個階段影響較明顯.相對于40 nm 囊泡,112 nm囊泡實驗中片層達到加速成長和完全形成支撐膜的時間均增長了約2.8—3.4 倍.說明不同尺寸囊泡對片層成長的影響強于片層產生的影響.此外,對吸附囊泡的數量進行了統(tǒng)計(圖4(b)),發(fā)現囊泡數先增加后減少,表明囊泡數量發(fā)生了由吸附主導向破裂成片層主導的轉變.對于該轉變,小囊泡所消耗的時間也顯著短于大囊泡.

        圖4 (a)通過TIRFM 表征不同尺寸囊泡初始片層形成、片層數量達到峰值及完全成膜的時間;(b)囊泡數量與隨時間變化(統(tǒng)計區(qū)域為5812 μm2);(c)通過QCM-D 表征不同尺寸囊泡的吸附與成膜Fig.4.(a)The time spent for the initial patch formation,the maximum of patch number,and complete SLB formation using vesicles with different sizes,characterized by TIRFM;(b)The number of vesicles changes with time (The area of interest is 5812 μm2);(c)The vesicle-to-SLB transformation using vesicles with different sizes,characterized by QCM-D.

        另采用QCM-D 對成膜動力學進行了表征(圖4(c)).該技術基于壓電石英晶體的共振頻率(Δf)和能量耗散(ΔD)的偏移,獲取了二氧化硅表面吸附物質的質量與黏質性變化.實驗發(fā)現,—Δf和ΔD隨時間先增加,表明襯底表面吸附了高黏滯性的囊泡.隨后二者減小,表明囊泡逐漸破裂釋放出內含水,形成高剛性的片層結構.40 nm 囊泡的Δf和ΔD變化轉折時間均短于112 nm 囊泡,證實了小囊泡更迅速地向片層結構轉變.最終兩者的Δf和ΔD平衡在—25 Hz,ΔD< 1× 10—6,表明都形成了完整的支撐雙層膜.在QCM-D 實驗的二氧化硅襯底和TIRFM 實驗的玻璃襯底上,小囊泡均展現出更強的片層形成效率,表明該結果是不依賴于襯底種類的.

        更為重要的是,玻璃表面吸附的囊泡數量、QCM-D 表面的囊泡吸附質量變化均具有顯著的囊泡尺寸依賴性.如圖4(b),40 nm 囊泡吸附數量在600 s 即達到峰值(約1400 個),而112 nm 囊泡吸附數量在1000 s 才達到峰值(約480 個).該統(tǒng)計不包含囊泡破裂造成的吸附數量損失,下文將對囊泡吸附動力學進行深入的定量研究.同時,圖4(c)顯示40 nm 囊泡造成的 Δ 下降快于112 nm 囊泡,說明小尺寸的囊泡更利于吸附質量(含水)增長.因此,囊泡吸附數量與質量統(tǒng)計結果均表明,磷脂向襯底的輸運效率是與囊泡尺寸相關的.

        理論上,囊泡的尺寸越大,它在襯底表面的形變越大.囊泡形變產生的高膜張力與局域高曲率均造成了膜結構穩(wěn)定性的下降(易破裂)[22,23,31].但本文和之前報道的實驗[9]均發(fā)現小囊泡更快地形成了支撐膜.該不一致性可能與襯底的表面囊泡濃度(即囊泡向襯底的供給效率)相關.在實驗囊泡濃度下,囊泡向底面吸附過程符合擴散受限動力學模型[20].在該模型中,單位支撐面積的擴散通量定義為

        其中D為擴散系數(c m2/s ),n為溶液中囊泡濃度(m ol/m3).DkBT/(6πηR),其中kB為玻爾茲曼常數,T為溫度,η為黏滯性,R為囊泡半徑.表面濃度和擴散通量滿足關系 dC/dtJ.從而得到囊泡的表面濃度(C,cm—2):

        表面濃度隨擴散系數的增大、時間的延長和囊泡濃度的增大而增大.由(3)式可得,在任意時刻,40 與112 nm 囊泡的表面濃度均相差一個量級.同時,在熒光圖像中選取未破裂的區(qū)域(圖5(a)),對囊泡的表面濃度進行了統(tǒng)計,發(fā)現在初始500 s,40 與112 nm 囊泡的表面濃度之比在7—11 之間.圖5(b)顯示數值計算的表面濃度與實驗統(tǒng)計值基本符合.因此,理論與實驗均說明,囊泡尺寸的改變產生了囊泡表面濃度跨量級的變化.

        圖5 擴散受限的囊泡吸附動力學 (a)40 nm (上)和112 nm (下)的囊泡表面濃度隨時間變化的TIRFM 圖像;(b)吸附囊泡數量的實驗統(tǒng)計與理論計算值.比例尺為20 μmFig.5.Diffusion-limited kinetics of vesicle adsorption: (a)TIRFM images of surface-attached vesicles,whose concentration changes with time.Vesicle diameter=40 nm (upper)and 112 nm (lower);(b)Experimental statistics and theoretical estimation of the number of adsorbed vesicles.The scale bar is 20 μm.

        為了闡明尺寸帶來的供給差異是否產生了片層前沿成長的差異,采用全局成長(GGM)和局域成長(LGM)兩種模型進行分析[28].假定吸附的半球形囊泡-襯底接觸區(qū)域的半徑等于囊泡半徑R,片層以恒定的速度常數k(由片層前沿的表面能決定)誘導與之接觸的囊泡破裂形成多層磷脂膜堆疊結構[19].GGM 認為[28]多層磷脂膜堆疊結構能夠迅速再組裝,其中θ比例的磷脂與半徑為rf(t)的圓形片層相結合(其余磷脂形成多層磷脂膜或斷裂丟失)[32].即單個囊泡破裂可導致片層面積增加4πR2 θ.而rf(t)的片層是由位于rf(t-Δt)之內的囊泡破裂形成的.形成片層的囊泡數為(t-Δt)C.因此,(t-Δt)4πR2θC或rf(t)βrf(t-Δt),這里:

        由此可得:

        這里rf(0)為初始的片層半徑.

        而LGM 認為[28],囊泡破裂時,釋放的磷脂再組裝能力弱.該囊泡破裂形成多層磷脂膜堆疊結構與早期片層的重疊部分不對片層面積的成長產生貢獻.rf單位時間的增量與R相關:rf(t+Δt)rf(t)+αR.當t ?Δt時滿足rf(t)αkRt,其中α是無量綱因數(與囊泡表面濃度和形變相關)[28].

        由于多層磷脂膜堆疊結構的再組裝依賴于磷脂膜與襯底間的吸引作用[33].因此LGM 適用于弱的吸引作用條件(如囊泡與襯底存在靜電排斥),而GGM 適用于強的吸引作用條件.選取兩個近圓的片層(圖6(a))考察了本文實驗中片層前沿成長動力學.圖6(b)給出了兩個模型下實驗數據的擬合結果,相較于LGM,本文實驗中的片層前沿成長更符合GGM.40 與112 nm 囊泡擬合獲得的β值分別約為1.14和1.08.由(3)式可得,40 與112 nm 囊泡的C值之比為10.5.計算可得兩者的θ值之比為0.92.即C的差異遠大于θ.而β的差異取決于C與θ的乘積((4)式),因此對于同樣的片層,囊泡尺寸造成的片層成長速率(由β反映)的不同主要由C主導.同時GGM 模型中,各時刻片層前沿的成長速度主要由rf與C決定((5)式).而根據(6)式與(3)式,rf與C隨時間增長,即片層總能夠在下一時刻誘導更大面積、更高表面濃度的囊泡破裂,因此片層結構呈現出加速成長(圖3).擬合還給出大小囊泡的θ值,反映片層成長時磷脂丟失是存在區(qū)別的.小囊泡的磷脂丟失率略大于大囊泡,原因可能是囊泡表面濃度越高,片層成長造成的磷脂丟失比例越高.我們將在后續(xù)的研究中繼續(xù)探索囊泡尺寸影響成膜過程中磷脂丟失率的物理機理.

        圖6 片層的半徑隨kt 的變化 (a)選用的40和112 nm囊泡形成的片層;(b)兩種尺寸囊泡的片層成長的全局(實線)和局域(虛線)模型擬合.比例尺為20 μmFig.6.Radius of the patch changes as a function of kt:(a)Patches formed by 40 and 112 nm vesicles;(b)fit of the experimental data to the GGM and LGM using the vesicles with two sizes.The scale bar is 20 μm.

        4 結論

        本文通過TIRFM和QCM-D 結合的表征手段,研究了不同尺寸囊泡條件下片層前沿的成長動力學.與之前其他實驗中研究囊泡破裂的方法相比,混摻標記和未標記的囊泡混合物,提高了單個磷脂組裝結構的辨識度.TIRFM 能夠快速獲取低背景熒光的信息,捕捉囊泡破裂后形成的片層結構及其成長的動力學.我們觀察到囊泡尺寸不同,成膜所經歷階段大致相似,但片層的數量、面積、前沿成長速度具有顯著差異.發(fā)現片層成長符合全局模型,囊泡表面濃度是產生片層成長差異的主要因素.囊泡吸附符合擴散受限模型,因此小囊泡產生的片層成長顯著快于大囊泡.本研究深化了片層成長機制的認識,為支撐磷脂膜在仿細胞載藥和生物芯片體系中的優(yōu)化設計與可控制備提供參考.

        猜你喜歡
        結構實驗
        記一次有趣的實驗
        微型實驗里看“燃燒”
        《形而上學》△卷的結構和位置
        哲學評論(2021年2期)2021-08-22 01:53:34
        論結構
        中華詩詞(2019年7期)2019-11-25 01:43:04
        做個怪怪長實驗
        新型平衡塊結構的應用
        模具制造(2019年3期)2019-06-06 02:10:54
        論《日出》的結構
        NO與NO2相互轉化實驗的改進
        實踐十號上的19項實驗
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        創(chuàng)新治理結構促進中小企業(yè)持續(xù)成長
        激情综合色综合啪啪开心| 中国老太老肥熟女视频| 亚洲av天堂在线免费观看| 男吃奶玩乳尖高潮视频| 柠檬福利第一导航在线| 国产亚洲AV无码一区二区二三区| 少妇激情一区二区三区久久大香香| 国内自拍色第一页第二页| 狠狠色狠狠色综合| 亚洲乳大丰满中文字幕| 无码精品a∨在线观看十八禁| 在线视频这里只有精品| 亚洲精品一区二区在线播放| 人妻少妇精品视频一区二区三区l| 亚洲a∨无码一区二区三区| 亚洲网站地址一地址二| 亚洲一区二区女优av| 在线不卡av一区二区| 精品国产综合区久久久久久 | 一区二区三区四区在线观看日本| 99精品国产在热久久无码| 亚洲饱满人妻视频| 亚洲av高清资源在线观看三区| 国产免费人成视频网站在线18| 国产精品永久久久久久久久久| 成年无码av片在线| 精品无码AⅤ片| 国产在线观看免费不卡视频| 成人自拍一二在线观看| 欧美人与动人物牲交免费观看久久| 热99精品| 亚洲一区二区三区资源| 亚洲成av人片乱码色午夜| 国产又黄又猛又粗又爽的a片动漫 亚洲精品毛片一区二区三区 | 无码国产日韩精品一区二区| 女同恋性吃奶舌吻完整版| 国产成人无码精品久久二区三区| 18禁美女裸身无遮挡免费网站| 国产乱子伦农村xxxx| 日韩精品一区二区三区人妻在线 | 人妻少妇一区二区三区|