周美玉，王 偉，劉 立，楊在亮，譚永紅

(重慶市涪陵中心醫(yī)院腫瘤血液科，重慶 408000)

食管癌是消化道的常見腫瘤之一，其不但發(fā)病率高，且死亡率更高，居全球癌癥死亡數(shù)的第6位[1-2]。食管癌多見于中老年男性，其中90%以上為鱗狀細胞癌，其次為腺癌。食管癌具有高度侵襲性、浸潤性、轉移性等特征，可導致患者預后較差，5年生存率不超過20%[3-4]。食管癌患者出現(xiàn)進行性吞咽梗阻、聲音嘶啞、飲水嗆咳等典型臨床表現(xiàn)時，多數(shù)已進展至中晚期，即使給予手術、化療、放療及免疫治療等多種治療方式，該類患者仍不能很好地達到根治目的且容易復發(fā)[5]。隨著病情進展，食管癌患者胃腸道反應逐漸加重，進食困難，嚴重影響患者生活質(zhì)量，同時也限制了后線治療方案的實施[6]。既往有研究表明，中醫(yī)中藥在降低食管癌放療及化療不良反應、協(xié)助抗癌治療、改善進食、延長患者生存時間等方面均取得了很好的效果[7-8]。

中藥復方黃連湯(載于《圣濟總錄》卷一七八)主要由中藥單體黃連、烏梅、艾葉和干姜組成，具有平調(diào)寒熱、和胃降逆之藥效，主要用于消化系統(tǒng)疾病[9]?，F(xiàn)代研究表明，黃連湯能夠保護胃腸道黏膜[10]，對于多種消化系統(tǒng)腫瘤具有不同程度的抑制作用。復方黃連湯中有效成分在食管癌治療中具有潛在功效和靶點，但目前尚無更多系統(tǒng)性文獻報道。本研究通過構建“復方黃連湯-有效成分-靶點-食管癌”網(wǎng)絡，以生物信息學分析方法尋找復方黃連湯與食管癌治療靶點之間的有效聯(lián)系，探索其分子機制，并用分子對接給予驗證，為復方黃連湯治療食管癌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)及DrugBank、UniProt、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB等數(shù)據(jù)庫。

1.2方法

1.2.1復方黃連湯有效成分篩選 在TCMSP中分別檢索“黃連”“烏梅”“艾葉”“干姜”的活性成分，篩選條件設置為類藥性(DL)≥0.18、口服生物利用度(OB)≥30%[11]。將候選化合物在DrugBank中匹配靶點，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對藥物靶點英文全名進行標準化。

1.2.2黃連湯治療食管癌潛在靶點篩選 利用GeneCards、PharmGKB、DrugBank、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞Esophagus cancer，篩選、下載與食管癌相關的靶標，匯總數(shù)據(jù)庫后去除重復值，獲得疾病靶點。

1.2.3“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建 對復方黃連湯活性成分的對應靶點及食管癌的靶點蛋白取交集后獲得共同靶點，繪制韋恩圖，并在Cytoscape3.8.0軟件中構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，借以研究復方黃連湯的中藥成分。

1.2.4蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建與分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡，采用Cytoscape3.8.0軟件進行網(wǎng)絡結構可視化處理。根據(jù)Degree值中位數(shù)篩選核心靶點[12]。

1.2.5基因富集分析 為探討中藥化合物對應的預測潛在靶點在基因功能和通路中的作用，將1.2.4收集的共同靶點蛋白導入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,對獲得的潛在有效靶點，采用R軟件進行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，分析其主要的生物學過程和代謝通路，將結果繪制成柱狀圖和氣泡圖進行可視化。

1.2.6分子對接 小分子配體的2D結構文件從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載，應用ChemOffice軟件將其轉換為3D結構文件。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白分子結構文件，采用PyMOL軟件刪除溶劑分子和小分子。采用AutoDock Tools軟件通過調(diào)整X、Y、Z坐標軸并進行分子對接模擬，并利用PyMOL軟件對其進行可視化。

2 結 果

2.1復方黃連湯有效成分篩選結果 通過TCMSP檢索黃連湯的化學成分，獲得黃連14個，烏梅8個，艾葉9個，干姜5個，去重后共計30個，對應靶點211個。通過UniProt數(shù)據(jù)庫校正后最終得到183個靶點。

2.2復方黃連湯治療食管癌潛在靶點篩選結果 共檢索到食管癌相關靶點5 965個，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫5 332個，OMIM數(shù)據(jù)庫168個，PharmGkb數(shù)據(jù)庫388個,TTD數(shù)據(jù)庫11個,DrugBank數(shù)據(jù)庫66個。利用韋恩圖取交集得到5 625個靶點。見圖1。進一步分析食管癌相關靶點與黃連湯化學成分相關靶點的相互交集，最終得出藥物與疾病共同靶點154個，即為復方黃連湯治療食管癌的潛在靶點。見圖2。

圖1 食管癌交集靶點韋恩圖

圖2 藥物與食管癌交集靶點韋恩圖

2.3“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建情況 網(wǎng)絡圖見圖3，其中有154個食管癌癌靶點基因(圖中右側節(jié)點)，節(jié)點越大代表與之相連的化合物越多，網(wǎng)絡中有22個化合物成分。

圖3 “中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.4PPI網(wǎng)絡構建與分析情況 PPI網(wǎng)絡中共有109個節(jié)點，通過307條邊發(fā)生相互作用。在該網(wǎng)絡中，每條邊代表靶點之間的靶向相互作用關系。篩選潛在核心目標，創(chuàng)建子網(wǎng)絡，見圖4。結果顯示，JUN、RELA、TP53、TNF、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1 11個基因是復方黃連湯治療食管癌的潛在關鍵靶基因。

圖4 核心網(wǎng)絡圖

2.5富集分析情況 GO富集分析確定了2 598個條目，其中生物學過程2 331條，包括對脂多糖、細菌起源分子、金屬離子、營養(yǎng)水平的反應等，尤其對脂多糖反應顯示出較高的調(diào)節(jié)能力。細胞成分77條，分別是膜筏、膜微結構域、膜區(qū)域、轉錄因子復合物、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合物、蛋白激酶復合物、小凹、神經(jīng)元細胞體。復方黃連湯作用區(qū)域主要是細胞膜，其次是線粒體和細胞體等結構。分子功能189條，主要包括DNA-結合轉錄激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ-特異性、組蛋白激酶活性等。取排名靠前的10個條目作圖。見圖5。

圖5 GO富集分析柱狀圖

KEGG通路富集分析中獲得166條通路(P<0.05)，排序后取前30條信號通路(富集基因數(shù)目降序排列)作圖，見圖6。復方黃連湯作用于食管癌的主要靶點集中在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路(39個靶點，占27%)、乙型肝炎信號通路(31個靶點，占21%)、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路(30個靶點，占20%)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(28個靶點，占19%)、腫瘤壞死因子信號通路(24個靶點，占17%)等。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6分子對接 通過查閱文獻從核心基因中篩選與食管癌密切相關的關鍵基因RELA、TN及JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1，分別與治療食管癌的有效成分山柰酚、槲皮素進行分子對接，以結合能小于或等于-5.0 kcal/mol作為篩選標準。結果顯示，復方黃連湯核心活性成分槲皮素、山柰酚與食管癌關鍵分子對接結合能均小于-5.0 kcal/mol。

3 討 論

食管癌屬于中醫(yī)“哽噎”范疇，病因一為飲食勞倦、情志不調(diào)；二為外感六淫、穢濁之邪。內(nèi)外之邪可單獨致病，也可交互影響，共同致病，最終導致臟腑功能失調(diào)、氣血失和、邪氣阻滯、日久生癌，辨證多為氣郁、痰阻、血瘀、氣血津虧。臨床發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，部分患者經(jīng)常規(guī)手術、放療、化療等治療后，氣血虧虛更嚴重，不利于疾病恢復。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療食管癌作用平穩(wěn)、不良反應小，尤其在改善食管癌患者生活質(zhì)量和延長患者生存時間等方面療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有保護心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[13]。陳梅等[14]研究指出，黃連湯主要用于消化系統(tǒng)疾病，以及辨證屬上熱下寒、寒熱錯雜者，效果明顯。復方黃連湯具有抗氧化、病毒、炎癥、細菌，同時具有增強機體免疫等多種作用[15]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析，共篩選出復方黃連湯的有效化學成分30個，對應靶點183個，食管癌相關靶點5 625個，最終得出藥物與疾病共同靶標154個；通過PPI網(wǎng)絡分析得到網(wǎng)絡核心基因11個，分別為RELA、TNF、TP53、JUN、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1。上述11個核心基因通過基因ID轉換，獲得復方黃連湯的活性分子為槲皮素、山柰酚。為了進一步明確復方黃連湯治療食管癌的作用機制，本研究采用分子對接技術對關鍵化合物山柰酚與關鍵蛋白(RELA、TNF)、槲皮素與關鍵蛋白(JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1)進行分子對接。結果顯示，山柰酚、槲皮素與靶蛋白均可進行很好地結合。

槲皮素是一種具有潛在化學預防活性的多酚類黃酮，其可上調(diào)Bax蛋白及下調(diào)Bcl-2蛋白表達，從而誘導食管癌細胞凋亡[16]。這種作用呈劑量依賴性地抑制食管癌細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成[17]，LIU等[18]進一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過降低血管內(nèi)皮生長因子A、基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，從而抑制食管癌細胞侵襲和血管生成。WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過誘導miR-1-3p對食管癌細胞產(chǎn)生抑制作用。槲皮素-3-甲基醚可有效抑制食管鱗狀細胞癌中蛋白激酶B(Akt)及下游雷帕霉素靶蛋白表達，減弱食管癌細胞增殖和錨定能力[20]。山柰酚可顯著抑制人Ea-109細胞增殖和凋亡[21]，參與調(diào)控細胞周期。此外，山柰酚還可明顯抑制腫瘤糖酵解和表皮生長因子受體活性，進而抑制腫瘤生長，是治療食管癌的有效化合物[22]。

本研究結果顯示，復方黃連湯治療食管癌的靶點位于細胞膜，主要信號通路涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路等。脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物4-hydroxynonenal(4-HNE)被認為是一種氧化應激誘導劑。ZHANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中4-HNE的表達水平顯著升高，且其表達水平與臨床分期和炎癥嚴重程度顯著相關，并隨著癌前病變的進展而升高，與染色陰性患者相比，4-HNE染色陽性患者臨床結局較差。提示氧化應激是食管癌患者癌變的驅動力。有研究發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE信號通路通過Rb蛋白磷酸化增強前列腺癌細胞的增殖，其在食管癌中的機制尚不明確[24]。

綜上所述，復方黃連湯中藥物有效成分山柰酚、槲皮素可能通過MAPK等信號通路發(fā)揮抑制食管癌的作用。復方黃連湯治療食管癌具有多成分、多靶點、多通路特點，為其臨床應用提供了基礎。本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，從潛在化學成分、靶標、信號通路、生物學過程等角度分析復方黃連湯治療食管癌潛在作用機制，為臨床提供了理論依據(jù)。由于網(wǎng)絡藥理學的局限性，后續(xù)基礎研究可圍繞預測得到的化合物、作用靶點及信號通路作進一步研究。