張 嫻，武 玉，張 艷

(聊城市人民醫(yī)院婦科，山東 聊城 252000)

宮頸癌是全球最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。早期宮頸癌治愈率較高，但晚期患者總生存率不令人滿意[1]。宮頸癌是目前唯一病因明確并有疫苗可進(jìn)行預(yù)防的惡性腫瘤，其主要危險(xiǎn)因素是高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染，以HPV16/18亞型致病性最強(qiáng)。HR-HPV持續(xù)感染發(fā)展為宮頸癌的時(shí)間為15～20年。目前，最常見(jiàn)的宮頸癌篩查方法是宮頸液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢查和HPV檢測(cè)，其中TCT成本較低，但受人為客觀因素的影響，容易導(dǎo)致誤診漏診，準(zhǔn)確性較差[2]。HPV檢測(cè)技術(shù)可顯著提高細(xì)胞學(xué)的敏感性，目前細(xì)胞學(xué)和高危型HPV聯(lián)合檢測(cè)已成為宮頸癌篩查的策略之一[3]。但是，HPV檢測(cè)結(jié)果單一，不能提供腺體病變等額外信息，其在宮頸癌及癌前病變檢查中缺乏特異性。因此，迫切需要一種特異性的新型分子標(biāo)志物對(duì)宮頸癌及癌前病變進(jìn)行早期識(shí)別。近年來(lái)的研究表明，腫瘤相關(guān)基因的DNA甲基化和抑癌基因的表達(dá)與腫瘤的早期進(jìn)展密切相關(guān)[4-7]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要表現(xiàn)形式。啟動(dòng)子高甲基化是抑癌基因失活的一種重要機(jī)制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化可改變基因的表達(dá)模式，導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制或沉默。盡管啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的DKK2(Dickkopf2)基因沉默現(xiàn)象出現(xiàn)在人類多種癌癥中，但其在宮頸癌中的研究較少見(jiàn)。本研究探討了DKK2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及HR-HPV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義，旨在為宮頸癌的早期防控提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年5月至2017年11月本院確診的79例宮頸癌患者(宮頸癌組)及63例宮頸癌前病變患者(癌前病變組)組織標(biāo)本，其中高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)38例，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)25例。同時(shí)選取29例子宮平滑肌瘤行子宮全切的患者作為對(duì)照組。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，標(biāo)本均在化療或放療前采集，所有標(biāo)本保存于-80 ℃。排除妊娠、急慢性病毒感染、免疫缺陷疾病、合并其他惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬均知情同意。

1.2方法

1.2.1HPV基因分型 采集宮頸脫落細(xì)胞保存于采集瓶中，保存于4 ℃。標(biāo)本采集前72 h禁止性行為、陰道用藥及沖洗。采用雜交捕獲法進(jìn)行HPV篩查及基因分型。

1.2.2DNA的準(zhǔn)備和亞硫酸鹽處理 按照DNA提取試劑盒(日本Takara公司)說(shuō)明書(shū)從凍存組織中提取DNA樣本，并測(cè)定其純度和濃度。使用EZ-DNA甲基化試劑盒(美國(guó)Zymo Research公司)對(duì)1 μg基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。最終產(chǎn)物經(jīng)氫氧化鈉脫硫、乙醇沉淀后溶于20 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP) 使用MSP試劑盒檢測(cè)DKK2基因的甲基化狀態(tài)。DKK2基因啟動(dòng)子甲基化和未甲基化形式的特異性引物被用于擴(kuò)增特定區(qū)域[8]，甲基化分析所用引物及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物大小見(jiàn)表1，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)條件：反應(yīng)體積30 μL，95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火54 ℃或58 ℃ MSP 30 s，在72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳、溴化乙啶染色后在凝膠成像系統(tǒng)下可視化并記錄結(jié)果。僅將未甲基化引物的陽(yáng)性擴(kuò)增解釋為未甲基化，將甲基化引物或甲基化和未甲基化引物的正擴(kuò)增視為甲基化。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組患者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率比較 癌前病變組中HSIL患者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率與宮頸癌組、對(duì)照組患者及癌前病變組中LSIL患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

續(xù)表2 3組患者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率比較

2.23組患者HR-HPV感染率及感染者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率比較 3組患者HR-HPV感染率及其DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。宮頸癌組中，HPV16/18陽(yáng)性患者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率高于非HPV16/18陽(yáng)性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。癌前病變組中，HPV16/18陽(yáng)性患者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率高于非HPV16/18陽(yáng)性患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組患者HR-HPV感染率及感染者DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率比較

3 討 論

表觀遺傳學(xué)概念是由英國(guó)科學(xué)家Waddington在1942年首次提出，指的是非基因序列改變導(dǎo)致的表型變化，與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，并在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)病機(jī)理研究中被廣泛應(yīng)用[9]。表觀遺傳學(xué)的主要表現(xiàn)形式包括：DNA/RNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位、非編碼RNA、基因印記等。其中，DNA甲基化是目前研究較清楚的表觀遺傳修飾機(jī)制之一，指的是生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程，其能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。由此看出，DNA修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，所以這一機(jī)制的缺陷可能導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病[10-11]。在癌癥發(fā)生時(shí)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)為高甲基化，基因啟動(dòng)子甲基化后，基因表達(dá)就會(huì)減弱甚至關(guān)閉。如腫瘤細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子通常為高甲基化，抑制抑癌基因表達(dá)使其喪失抑癌功能，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生，且多發(fā)生在癌癥的早期階段，因此基因啟動(dòng)子甲基化程度的檢測(cè)可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)指標(biāo)。目前，DNA甲基化在宮頸癌及宮頸病變中的研究較多，引入新的高效腫瘤生物標(biāo)志物能夠降低手術(shù)切除率，可更好地預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生情況。

Wnt通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要途徑有3條，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路為經(jīng)典通路，受多種分泌拮抗劑調(diào)控，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、器官形成等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。β-catenin是一種重要的促癌蛋白，可與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin通路的靶基因，如c-MYC、Cyclin D1、MMP-2等，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。一些基因作用于該通路的某些環(huán)節(jié)，抑制其過(guò)度激活，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化是這些基因失活的重要機(jī)制。DKK是Wnt/β-catenin信號(hào)通路最常見(jiàn)的負(fù)調(diào)控因子，包含DKK1、DKK2、DKK3、DKK4共4個(gè)家族成員，均為具有2個(gè)由連接區(qū)分隔的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白。其中，DKK2位于染色體4q25位點(diǎn)，基因長(zhǎng)度149 kb，編碼的蛋白約28 kD，可與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合。作為典型的Wnt/β-catenin拮抗劑，DKK2啟動(dòng)子中具有典型的CpG島。啟動(dòng)子CpG甲基化受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化失控[12]。啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的DKK2表觀遺傳沉默已在多種人類癌癥中被觀察到，如卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌和胃癌組織中存在著不同程度的甲基化及組織表達(dá)下調(diào)，同時(shí)有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等生物學(xué)能力[13-17]，然而其確切的細(xì)胞功能尚不明確，其在宮頸癌中的功能及相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚[18-19]。宮頸鱗癌患者DKK1基因啟動(dòng)子甲基化與高危HPV感染、組織分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期有關(guān)，而DKK-1基因啟動(dòng)子甲基化程度與高危HPV感染類型無(wú)關(guān)[20]。本研究檢測(cè)了DKK2啟動(dòng)子在宮頸癌、癌前病變及正常宮頸組織中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，51.9%的患者宮頸癌組織中DKK2啟動(dòng)子為高甲基化狀態(tài)，而在正常宮頸組織中未發(fā)生甲基化，隨著宮頸病變的加重，DKK2基因啟動(dòng)子甲基化呈上升趨勢(shì)，證實(shí)DKK2基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。在許多癌癥中，表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致CpG島啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，可導(dǎo)致DNA結(jié)合蛋白發(fā)生基因沉默，然后阻斷轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，最終導(dǎo)致DKK2基因表達(dá)減少[21]。有研究顯示，用抗體阻斷DKK2可通過(guò)免疫細(xì)胞激活和腫瘤血管生成抑制腫瘤進(jìn)展，提示抗DKK2和抗VEGFR的聯(lián)合可能是晚期結(jié)直腸癌的潛在治療方法[22]。

HPV感染占宮頸癌病例的90%以上，高危型HPV與87%～88%的鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)。HPV感染可引導(dǎo)宿主細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳學(xué)變化，最終導(dǎo)致宮頸癌[23-24]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組、癌前病變組及對(duì)照組HR-HPV感染率分別為92.4%、82.5%、6.9%，具有明顯的差異，提示HR-HPV的篩查對(duì)宮頸癌及癌前病變的早期診斷具有極其重要的意義。降低和清除HPV對(duì)宮頸癌及癌前病變有良好的防治作用，但治療HPV感染目前尚無(wú)特效藥物。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，DKK2基因啟動(dòng)子甲基化的檢出率逐漸升高。在HR-HPV陽(yáng)性宮頸癌患者中，HPV16/18陽(yáng)性患者的DKK2基因啟動(dòng)子甲基化率高于非HPV16/18陽(yáng)性患者，但在癌前病變組中，二者無(wú)顯著差異，可能與樣本量小有關(guān)。隨著診斷技術(shù)的發(fā)展、細(xì)胞學(xué)檢查等技術(shù)的推廣，以及HPV病毒微量提取與雜交法的廣泛應(yīng)用，宮頸癌發(fā)病率和病死率已明顯降低[25-27]。HPV感染者并不一定會(huì)發(fā)生癌前病變或?qū)m頸癌，在宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，可能存在其他協(xié)同因子的共同促進(jìn)效應(yīng)，因此基于基因水平的特異性檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生?；蚣谆治鍪且环N非形態(tài)學(xué)的分子檢測(cè)方法，可為HR-HPV陽(yáng)性患者提供一種客觀、潛在的分流方法。對(duì)于癌前病變，HPV基因分型與甲基化標(biāo)記物分析相結(jié)合，既可以避免細(xì)胞學(xué)檢查的局限性，又可以保證診斷的準(zhǔn)確性。DNA甲基化的分流檢測(cè)可將宮頸癌高危患者和低?；颊邊^(qū)分開(kāi)來(lái)。

綜上所述，DKK2常因其啟動(dòng)子高甲基化而失活，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能是一種潛在的宮頸癌分子標(biāo)志物。細(xì)胞基因組的表觀遺傳學(xué)變化在宮頸腫瘤的發(fā)生中很常見(jiàn)，在臨床和診斷研究中，腫瘤抑制基因的DNA甲基化可能是理想的分子生物學(xué)標(biāo)記物。DKK2的表觀遺傳變化可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，DKK2基因啟動(dòng)子的高甲基化可作為篩查、早期診斷、宮頸癌前病變分級(jí)管理及宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)分層的重要手段，期待大樣本前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生關(guān)系明確，但仍有諸多問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，以便更好地了解DNA甲基化調(diào)控過(guò)程，從而為宮頸癌的早期診斷和治療提供新思路。