應(yīng)晨希 胡龍嬌 劉紅斌 吳小芹

（1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同中心，林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus）是松樹(shù)萎蔫病（亦稱(chēng)松材線蟲(chóng)?。┑牟≡璠1]。自1982年我國(guó)南京首次報(bào)道松材線蟲(chóng)病發(fā)生以來(lái)[2]，該病在38年的時(shí)間里，已先后在我國(guó)18省666個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生為害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)破壞，松材線蟲(chóng)已成為我國(guó)最具危險(xiǎn)性的林業(yè)有害生物之一。近年來(lái)，松材線蟲(chóng)病在我國(guó)的傳播危害呈現(xiàn)一些新特點(diǎn)：發(fā)生區(qū)突破了傳統(tǒng)理論的北部適生界線；傳播媒介蟲(chóng)種增加；有研究表明，目前除松墨天牛外林間的其他天牛科（Cerambycidae）昆蟲(chóng)以及象甲科（Curculionidae）、吉丁科（Buprestidae）、叩甲科 （Elateridae）和小蠹科 （Scolytidae）等昆蟲(chóng)也可攜帶松材線蟲(chóng)[3?7]；感病樹(shù)種由過(guò)去的黑松（Pinus thunbergii）、赤松（P. densiflora）和馬尾松（P. massoniana）等，擴(kuò)展到黃山松 (P. taiwanensis)、云南松 (P. yunnanensis)、油 松（P. tabuliformis）、華山松（P. armandii）、紅松（P. koraiensis）和落葉松（Larixspp.）等[8?12]。松材線蟲(chóng)病在我國(guó)遠(yuǎn)距離傳播的主要方式是人為傳播含松材線蟲(chóng)和媒介昆蟲(chóng)的病木及其制品。

研究表明，在自然界中病原物和昆蟲(chóng)均存在寄主轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，它們的寄生適應(yīng)性將直接影響其種群的定殖、擴(kuò)張繼而影響病蟲(chóng)害的發(fā)生[13]。有學(xué)者對(duì)B型煙粉虱（Bemisia tabaci）在寄主轉(zhuǎn)換時(shí)的適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱的寄主適應(yīng)度變化符合一般的寄主轉(zhuǎn)移規(guī)律，即嗜性相對(duì)較強(qiáng)的過(guò)渡寄主可以刺激煙粉虱提高寄主適應(yīng)性[14?16]。而棉蚜（Aphis gossypii）從棉花種群被轉(zhuǎn)到甜瓜（Cucumis melo）上時(shí)，其壽命比轉(zhuǎn)到原寄主棉花的成蚜壽命明顯降低[17]。目前松材線蟲(chóng)的寄主范圍不斷擴(kuò)大，其由媒介昆蟲(chóng)攜帶從病死木傳播到健康木、從病害發(fā)生區(qū)傳播到新地區(qū)的過(guò)程中都有可能在不同抗性松樹(shù)之間發(fā)生轉(zhuǎn)換，但目前松材線蟲(chóng)在傳播過(guò)程中寄主發(fā)生變化時(shí)的寄生適應(yīng)性和致病力變化狀況尚不清楚。

馬尾松作為我國(guó)本土重要的松屬樹(shù)種，多年來(lái)其抗性種源和抗病單株選擇在江蘇和安徽等省陸續(xù)被進(jìn)行研究，目前已篩選出了一批高抗馬尾松，在安徽初步建立了抗松材線蟲(chóng)病候選個(gè)體保存園[18]。目前對(duì)于松材線蟲(chóng)病的寄主范圍和寄主抗性等問(wèn)題已有相關(guān)研究[19?21]，而松材線蟲(chóng)在寄主體內(nèi)的種群增殖力是關(guān)乎松樹(shù)是否發(fā)病的關(guān)鍵因子，但關(guān)于松材線蟲(chóng)在不同抗性松樹(shù)體內(nèi)的種群繁殖參數(shù)等與寄生適應(yīng)性相關(guān)因素的研究還少見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)，在松材線蟲(chóng)相關(guān)致病機(jī)理的研究中，對(duì)于纖維素酶在松材線蟲(chóng)病發(fā)生中的作用研究報(bào)道較多[22?23]，但對(duì)于在不同抗性寄主體內(nèi)松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶活性變化狀況不甚明確。為此，本研究選取不同致病力的松材線蟲(chóng)通過(guò)多次接種不同抗性的寄主松樹(shù)，對(duì)松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)后的種群繁殖力、致病力變化及其分泌纖維素酶的能力進(jìn)行研究，以期闡明松材線蟲(chóng)種群的寄生適應(yīng)性及其在寄主變換時(shí)種群繁殖力和致病力的變化規(guī)律，為進(jìn)一步揭示松材線蟲(chóng)種群的入侵定殖及流行為害機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其培養(yǎng)

供試松材線蟲(chóng)為經(jīng)前期致病力測(cè)定表現(xiàn)為強(qiáng)毒的蟲(chóng)株ZJ和弱毒的蟲(chóng)株YW4，分別分離自浙江富陽(yáng)馬尾松和云南德宏思茅松（P.kesiyavar.langbianensis）[24]，保存于江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。松材線蟲(chóng)生長(zhǎng)適溫為 25 ℃[19]，通過(guò)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板在 25 ℃ 無(wú)光照條件下培養(yǎng)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）4～5 d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn) PDA 后接入供試松材線蟲(chóng)，相同的條件下培養(yǎng) 5～6 d，待灰葡萄孢菌絲被吃光后采用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲(chóng)[25]。將收集的線蟲(chóng)懸浮液 4000 r/min，離心 3 min，棄去上清；再用雙蒸水（ddH2O）清洗 3 次，4000 r/min 離心，每次 3 min，備用。

供試植物為3～4年生生長(zhǎng)狀況基本一致的健康黑松幼樹(shù)、火炬松（P. taeda）幼樹(shù)和高抗馬尾松幼樹(shù)（由江蘇省林科院抗性馬尾松種源篩選獲得，種源編號(hào)為GD5），培養(yǎng)于南京林業(yè)大學(xué)溫室，培養(yǎng)溫度控制在28～32 ℃，相對(duì)濕度控制在65%～75%。

1.2 松材線蟲(chóng)接種松樹(shù)及致病力測(cè)定

將2種不同毒力的松材線蟲(chóng)制備成蟲(chóng)懸液（3000 條/mL），以皮接法對(duì)3種松幼樹(shù)進(jìn)行人工接種，用無(wú)菌刀片在近地約10 cm的莖干處割開(kāi)樹(shù)皮深達(dá)木質(zhì)部，用鑷子取無(wú)菌棉球塞入，每株接1 mL的蟲(chóng)懸液，以接種1 mL ddH2O的松樹(shù)作為對(duì)照，封口膜做成漏斗狀將切口及棉球包裹住，保證蟲(chóng)液不滲漏。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。根據(jù)針葉顏色變化程度，將松樹(shù)的感病程度劃分為以下5個(gè)等級(jí)：0級(jí)：所有針葉均健康呈綠色；Ⅰ級(jí)：小部分針葉開(kāi)始變黃；Ⅱ級(jí)：一半左右的針葉變黃或萎蔫；Ⅲ級(jí)：大部分針葉褐變萎蔫；Ⅳ級(jí)：所有針葉失綠枯萎。在接種后的第15天、30 天和45 天統(tǒng)計(jì)松苗的發(fā)病率和感病指數(shù)，發(fā)病率和感病指數(shù)按如下公式進(jìn)行計(jì)算[26]：

當(dāng)任一處理中松幼樹(shù)全部死亡或感病指數(shù)不變時(shí)，將所有供試松幼樹(shù)按不同處理分別剪成細(xì)條收集，通過(guò)貝爾曼漏斗法分離線蟲(chóng)并洗凈，接種至灰葡萄孢培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁再收集，方法同1.1所述。將收集到的線蟲(chóng)按照上述方法再次接種于健康的松幼樹(shù)并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。重復(fù)該過(guò)程即為第3次接種。

1.3 松材線蟲(chóng)寄生適應(yīng)性與雌雄性比的檢測(cè)

采用Braach[27]提出的相關(guān)寄生適應(yīng)性（RHS）系數(shù)分析不同毒力松材線蟲(chóng)在3種松樹(shù)中的定殖狀況。

2種不同毒力松材線蟲(chóng)（強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4）與3種不同抗性松幼樹(shù)（抗性馬尾松、火炬松、黑松）共組成6組接種處理，接種后獲得的線蟲(chóng)按上述順序分別命名為ZJ?Ma、ZJ?Huo、ZJ?Hei和YW4?Ma、YW4?Huo、YW4?Hei。在上述的3次接種試驗(yàn)中，當(dāng)任一處理中松幼樹(shù)全部死亡或感病指數(shù)不變時(shí)，通過(guò)貝爾曼漏斗法分離松苗中的線蟲(chóng)，并在蔡司顯微鏡Axio Lab A1下統(tǒng)計(jì)每次接種試驗(yàn)中的松材線蟲(chóng)數(shù)量（區(qū)分死亡松幼樹(shù)中的線蟲(chóng)數(shù)量）和雌雄蟲(chóng)性比（記錄接種前線蟲(chóng)性比）。根據(jù)RHS系數(shù)公式計(jì)算3次接種試驗(yàn)中各處理的RHS系數(shù)：

1.4 松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶活性測(cè)定

1.4.1 松材線蟲(chóng)胞外纖維素酶的提取

提取從不同抗性松幼樹(shù)上分離得到的線蟲(chóng)分泌的纖維素酶，參考Kojima等[22]的方法稍作修改，將線蟲(chóng)收集后調(diào)整濃度為5×104/mL，于20 ℃下不時(shí)震蕩搖動(dòng)， 48 h后收集上清液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取DNS 10.0 g，加400 mL去離子水使之懸浮，邊混合邊慢慢加入150 mL氫氧化鈉溶液（每300 mL去離子水中含32.0 g氫氧化鈉）。將該懸浮液置于50 ℃水浴中溫?zé)嶂脸吻?，不斷混合下緩緩加?00 g酒石酸甲鈉至溶液中，用去離子水稀釋至1000 mL，貯存于棕色瓶中。

取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖溶液分別加入0、1、2、3、4、5號(hào)管中，每管用去離子水補(bǔ)足體積為2.0 mL，然后加DNS溶液，沸水浴10 min，補(bǔ)足體積為14 mL，以0號(hào)管為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)（CARY100，Agilent）測(cè)定490 nm吸光度，在Excel中求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值。

1.4.3 纖維素酶活性的測(cè)定

參考王琳等[28]的DNS法和公式進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系為1 mL 含1%羧甲基纖維素鈉（CMC，國(guó)藥集團(tuán)，上海）的醋酸鈉緩沖液和1 mL酶液，經(jīng)50 ℃反應(yīng)30 min，加2 mL DNS溶液，置沸水浴15 min，冷卻后加入去離子水使得總體積為14 mL，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm吸光度。以每分鐘每毫升酶液產(chǎn)生1微克葡萄糖的量作為1個(gè)活性單位，將測(cè)的葡萄糖含量值（C）代入公式E=C×1000/30×1，求得纖維素酶活性值（E）。

1.5 接種后不同松材線蟲(chóng)種群致病力的比較測(cè)定

選取2年生健康且生長(zhǎng)狀況基本一致的黑松幼樹(shù)為致病力測(cè)定的接種對(duì)象，對(duì)經(jīng)過(guò)3次循環(huán)接種不同抗性松幼樹(shù)上分離的松材線蟲(chóng)進(jìn)行致病力統(tǒng)一測(cè)定比較。接種量為3000條/株，各處理分別包含8個(gè)重復(fù)，接種后每5 d觀察并記錄松樹(shù)發(fā)病情況，直至供試松幼樹(shù)全部死亡或感病指數(shù)不再變化。以持續(xù)在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)的強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株（即出發(fā)種群，分別命名為ZJ?CK和YW4?CK）接種黑松幼樹(shù)作為對(duì)照。接種方法和指標(biāo)測(cè)定同1.2所述。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel計(jì)算重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并使用SPSS Statistics 17.0軟件（IBM中國(guó)公司，北京），采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)各處理的差異顯著性，顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲(chóng)接種不同抗性松幼樹(shù)后致病力的變化

將松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4分別接種不同抗性松幼樹(shù)（高抗馬尾松、火炬松及黑松），通過(guò)接種—分離培養(yǎng)—再接種的方式，持續(xù)進(jìn)行3輪接種試驗(yàn)，比較3次試驗(yàn)中不同松樹(shù)的發(fā)病率和感病指數(shù)的變化。3次循壞接種強(qiáng)弱毒松材線蟲(chóng)的抗性馬尾松幼樹(shù)的發(fā)病率和感病指數(shù)變化見(jiàn)表1。在第1輪及第2輪接種中，松材線蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株YW4對(duì)抗性馬尾松幼樹(shù)未表現(xiàn)出致病性，即在持續(xù)觀察的45 d中未出現(xiàn)發(fā)病癥狀；接種強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ后抗性馬尾松幼樹(shù)的發(fā)病率也僅有16.7%，感病指數(shù)僅為8.3。在第3輪接種中，各松材線蟲(chóng)蟲(chóng)株對(duì)抗性馬尾松幼樹(shù)的致病力均有較大程度的提高，其中接種弱毒蟲(chóng)株YW4的抗性馬尾松的發(fā)病率為50%，感病指數(shù)為16.7，而接種強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的抗性馬尾松幼樹(shù)發(fā)病率為50%，感病指數(shù)達(dá)到37.5?？剐择R尾松幼樹(shù)對(duì)松材線蟲(chóng)的抗性隨著松材線蟲(chóng)接種次數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。這些結(jié)果表明無(wú)論是強(qiáng)毒還是弱毒松材線蟲(chóng)，通過(guò)反復(fù)侵染抗性松樹(shù)幼樹(shù)其致病力均得到了明顯增強(qiáng)。

表1 抗性馬尾松幼樹(shù)循環(huán)接種松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株的發(fā)病情況Table 1 The incidence of resistant P. massoniana seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

松材線蟲(chóng)循環(huán)接種火炬松幼樹(shù)后致病力的變化趨勢(shì)見(jiàn)表2。在3次接種中，強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4對(duì)火炬松幼樹(shù)的致病力隨著接種次數(shù)的增加而增強(qiáng)。接種強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的火炬松幼樹(shù)的發(fā)病率從第1次接種的66.7%增長(zhǎng)至第2次接種的83.3%，最后增長(zhǎng)至第3次接種的100%，感病指數(shù)由37.5增長(zhǎng)至66.7，最后增長(zhǎng)至100；接種弱毒蟲(chóng)株YW4的火炬松幼樹(shù)的發(fā)病率從16.7%增長(zhǎng)至33.3%，最后增長(zhǎng)至66.7%，感病指數(shù)由8.30增長(zhǎng)至20.1，最后增長(zhǎng)至52.08。該結(jié)果表明，隨著接種次數(shù)的增加火炬松幼樹(shù)也對(duì)松材線蟲(chóng)的抗性呈明顯下降趨勢(shì)。

表2 火炬松幼樹(shù)循環(huán)接種松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株的發(fā)病情況Table 2 The incidence of P. taeda seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

松材線蟲(chóng)循環(huán)接種黑松幼樹(shù)后致病力的變化趨勢(shì)見(jiàn)表3。對(duì)易感寄主黑松，松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ在第1輪測(cè)定中已表現(xiàn)出較高致病力，黑松幼樹(shù)發(fā)病率為75%，感病指數(shù)為66.7，在第3輪測(cè)定中感病指數(shù)上升為100。接種弱毒蟲(chóng)株YW4的黑松幼樹(shù)的發(fā)病率由第1次測(cè)定的33.3%上升為第3次測(cè)定的83.3%，感病指數(shù)由20.1上升為81.25，YW4致病力提高尤為顯著。

表3 黑松幼樹(shù)循環(huán)接種松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株的發(fā)病情況Table 3 The incidence of P. thunbergii seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

綜合比較不同毒力松材線蟲(chóng)循環(huán)接種3種不同抗性松幼樹(shù)的結(jié)果可知，寄主松樹(shù)無(wú)論接種的是強(qiáng)毒蟲(chóng)株還是弱毒蟲(chóng)株，其感病程度高低的順序依次為黑松種群>火炬松種群>抗性馬尾松種群，且經(jīng)過(guò)循環(huán)接種3次后測(cè)定的發(fā)病率和感病指數(shù)均顯示出較大程度的提升。表明無(wú)論強(qiáng)毒或弱毒的松材線蟲(chóng)經(jīng)多次侵染寄主松樹(shù)后，其致病力會(huì)明顯增強(qiáng)。

2.2 松材線蟲(chóng)接種不同抗性幼樹(shù)后種群寄生適應(yīng)性的變化

對(duì)松材線蟲(chóng)侵染不同松幼樹(shù)1～3輪后各個(gè)種群的寄生適應(yīng)性RHS系數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。在第1輪的接種試驗(yàn)中，從抗性馬尾松幼樹(shù)中僅分離得到極少量強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4，且接種YW4的抗性馬尾松幼樹(shù)死亡率為0，因此來(lái)自抗性馬尾松幼樹(shù)的ZJ種群（ZJ?Ma）RHS系數(shù)為0.72，而YW4種群（YW4?Ma）的RHS系數(shù)為0。RHS系數(shù)最高的為來(lái)自易感寄主黑松幼樹(shù)的ZJ種群（ZJ?Hei），RHS值為9.6；弱毒蟲(chóng)株YW4侵染不同松幼樹(shù)后各種群的RHS系數(shù)均較低，其中最高值為4.5，是來(lái)自黑松幼樹(shù)的YW4種群（YW4?Hei）。

表4 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹(shù)過(guò)程中松材線蟲(chóng)種群RHS系數(shù)Table 4 The RHS coefficient of B. xylophilus populations during cyclic infection with different resistant pine seedlings

在第3輪測(cè)定中，強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4在抗性馬尾松幼樹(shù)中的RHS系數(shù)均有上升，其中ZJ?Ma種群的RHS系數(shù)達(dá)到10.5，已高于第1次測(cè)定中接種黑松幼樹(shù)的ZJ?Hei種群的最高值；同時(shí)，弱毒蟲(chóng)株YW4?Ma種群的RHS系數(shù)達(dá)到3.8，已明顯高于前2次測(cè)定中的YW4?Ma（0）和YW4?Huo的種群（0.4），說(shuō)明YW4?Ma種群經(jīng)多次接種高抗性寄主后寄生適應(yīng)性明顯增強(qiáng)。在第3次測(cè)定中，松材線蟲(chóng)RHS系數(shù)最高仍為接種黑松幼樹(shù)的ZJ?Hei種群，達(dá)到21.6，約達(dá)到第1次測(cè)定值的2倍，而來(lái)自黑松幼樹(shù)的弱毒YW4?Hei種群的RHS系數(shù)為14.1，約達(dá)到第1次試驗(yàn)中測(cè)定值的3倍。

2.3 松材線蟲(chóng)接種不同抗性幼樹(shù)后種群性比的變化

松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ和弱毒蟲(chóng)株YW4在每次接種前的雌雄性比均為2.2～2.4，雌蟲(chóng)數(shù)量較多，有利于繁殖。將線蟲(chóng)循環(huán)接種于不同抗性松樹(shù)1～3次后，統(tǒng)計(jì)分離自寄主體內(nèi)的松材線蟲(chóng)種群的雌雄性比，結(jié)果如圖1。在第1輪測(cè)定結(jié)果中，雌雄性比小于1的種群有3個(gè)，分別為ZJ?Ma種群、YW4?Ma種群和YW4?Huo種群；性比為1的種群有1個(gè)，為ZJ?Huo種群；雌雄性比大于1的種群有2個(gè)，是ZJ?Hei種群和YW4?Hei種群。說(shuō)明松材線蟲(chóng)在第1次侵染抗性馬尾松幼樹(shù)中雄成蟲(chóng)數(shù)量大于雌成蟲(chóng)，而在易感寄主黑松幼樹(shù)中強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株的雌成蟲(chóng)明顯增多，這暗示，松材線蟲(chóng)在易感松樹(shù)中適應(yīng)性和繁殖力較強(qiáng)從而導(dǎo)致松樹(shù)發(fā)病快，發(fā)病程度重。

圖1 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹(shù)過(guò)程中松材線蟲(chóng)種群性比的變化Fig. 1 Variation of population sex ratio of B. xylophilus during cyclic infection with different resistant pine seedlings

在第3輪侵染寄主測(cè)定中，松材線蟲(chóng)種群的雌雄性比有一定程度的上升，除了YW4?Huo種群為0.98小于1之外，其余5個(gè)松材線蟲(chóng)種群的雌雄性比均高于1，即循環(huán)侵染寄主后松材線蟲(chóng)多數(shù)種群中雌蟲(chóng)所占比例增加，進(jìn)一步表明循環(huán)侵染可以提高松材線蟲(chóng)種群的寄生適應(yīng)性。ZJ?Hei種群的雌雄性比在3次測(cè)定中結(jié)果基本保持一致，可見(jiàn)易感黑松幼樹(shù)是其適宜的寄主，在該寄主環(huán)境下松材線蟲(chóng)種群擴(kuò)繁順利。這也說(shuō)明，當(dāng)松材線蟲(chóng)種群在寄主體內(nèi)適應(yīng)性較好時(shí)，種群性比趨于穩(wěn)定。

2.4 松材線蟲(chóng)接種不同抗性幼樹(shù)后纖維素酶活性的比較

為測(cè)定不同抗性松幼樹(shù)上松材線蟲(chóng)纖維素酶活性，首先進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，經(jīng)計(jì)算所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算公式為：y=1.5213x+0.0319。相關(guān)系數(shù)R2=0.9984。之后對(duì)來(lái)自不同抗性松幼樹(shù)上松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶活性測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖2。

比較強(qiáng)弱毒松材線蟲(chóng)多次接種不同抗性松幼樹(shù)后其分泌的纖維素酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒蟲(chóng)株群體的纖維素酶活性依次為ZJ?Ma >ZJ?Hei >ZJ?Huo，均高于弱毒蟲(chóng)株；而弱毒蟲(chóng)株YW4的纖維素酶活性依次為YW4?Hei> YW4?Ma>YW4?Huo，但第3次接種后變化為YW4?Ma> YW4?Hei> YW4?Huo。循環(huán)侵染不同抗性寄主不同程度地增加了松材線蟲(chóng)種群的纖維素酶活力，其中松材線蟲(chóng)ZJ?Ma和YW4?Ma種群的纖維素酶活力均出現(xiàn)顯著上升，ZJ?Huo、YW4?Huo、ZJ?Hei、YW4?Hei種群的纖維素酶活力上升差異不顯著（圖2）。由此可見(jiàn)，循環(huán)侵染高抗性寄主對(duì)松材線蟲(chóng)種群纖維素酶活力的增強(qiáng)效應(yīng)較大。

圖2 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹(shù)過(guò)程中松材線蟲(chóng)纖維素酶活性的比較Fig. 2 Comparison of the cellulose activity of B. xylophilus during cyclic infection with different resistant pine seedlings

2.5 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹(shù)后松材線蟲(chóng)種群致病力的比較

將經(jīng)不同抗性松幼樹(shù)體內(nèi)增殖后的松材線蟲(chóng)6個(gè)種群與對(duì)照（出發(fā)種群ZJ?CK和YW4?CK）在2年生黑松幼樹(shù)上進(jìn)行致病力的比較測(cè)定（表5）。結(jié)果表明，作為對(duì)照的松材線蟲(chóng)強(qiáng)、弱毒蟲(chóng)株出現(xiàn)第1株病死植株的時(shí)間分別為第21天和第33天，而在經(jīng)循環(huán)多次接種不同抗性松幼樹(shù)后的不同種群中，出現(xiàn)第1株病死植株的時(shí)間均不同程度的縮短，其中發(fā)病最快的為來(lái)自經(jīng)抗性松幼樹(shù)接種的ZJ?Ma種群和ZJ?Huo種群，接種松幼樹(shù)后第15天即出現(xiàn)病死植株；發(fā)病最慢的為YW4?Huo種群和YW4?Hei種群，接種黑松幼樹(shù)后第21天出現(xiàn)病死植株，但也比原始出發(fā)蟲(chóng)株提前12 d發(fā)病。同時(shí)，接種ZJ?Ma種群的松幼樹(shù)全部死亡的歷期最短，為21 d，其發(fā)病率為100%，感病指數(shù)為100，可見(jiàn)該種群致病力最強(qiáng)。接種YW4?Hei種群的發(fā)病松幼樹(shù)死亡歷期較長(zhǎng)為36 d，但這一數(shù)值也低于接種原蟲(chóng)株YW4?CK（45 d，松幼樹(shù)未全部死亡，發(fā)病率和感病指數(shù)不再變化）。在發(fā)病率和感病指數(shù)方面，弱毒蟲(chóng)株YW4接種各個(gè)不同松幼樹(shù)種群的變化數(shù)值較為明顯，其中經(jīng)接種抗性松幼樹(shù)的YW4?Ma和YW4?Huo種群的發(fā)病率為87.5%，已達(dá)到強(qiáng)毒蟲(chóng)株的水平。接種易感松幼樹(shù)的YW4?Hei種群的發(fā)病率為75%，感病指數(shù)為77.5，也成為中等致病力的蟲(chóng)株。這些結(jié)果表明松材線蟲(chóng)強(qiáng)、弱毒蟲(chóng)株均可以通過(guò)多次侵染松幼樹(shù)的方式提高其致病力，且循環(huán)侵染高抗松幼樹(shù)后，線蟲(chóng)致病力提高更為顯著。

表5 循環(huán)接種后不同松材線蟲(chóng)種群的致病力比較Table 5 The comparison of pathogenicity of different B. xylophilus populations after cyclic inoculation

3 結(jié)論與討論

有研究表明，不同寄主和地理來(lái)源的松材線蟲(chóng)其致病力存在差異[29?30]。而這種差異與松材線蟲(chóng)侵染不同抗性松樹(shù)后而產(chǎn)生的獲得致病力是否有關(guān)并不清楚。在以往有關(guān)寄主適應(yīng)性的研究中，有人認(rèn)為病原從嗜好性較強(qiáng)的寄主轉(zhuǎn)移到嗜好性相對(duì)較弱的寄主后，其寄主適應(yīng)性會(huì)迅速下降[31?32]。本研究中將松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株和弱毒蟲(chóng)株接種到不同抗性寄主松幼樹(shù)中，通過(guò)接種—分離—再接種的不斷侵染寄主的循環(huán)方式，發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒和弱毒蟲(chóng)株對(duì)不同松幼樹(shù)的致病力均得到了不同程度的提高，這種致病力的提升在弱毒蟲(chóng)株侵染抗性松樹(shù)上的表現(xiàn)更為明顯。同時(shí)，強(qiáng)毒松材線蟲(chóng)在侵染抗性寄主馬尾松幼樹(shù)后致病力的增幅顯著大于其侵染易感松幼樹(shù)黑松。另外，無(wú)論是松材線蟲(chóng)強(qiáng)毒或弱毒蟲(chóng)株，其在接種抗性馬尾松幼樹(shù)后引起的發(fā)病率和感病指數(shù)均低于其在火炬松幼樹(shù)中引起的發(fā)病率和感病指數(shù)，說(shuō)明本試驗(yàn)采用的抗性馬尾松幼樹(shù)的抗性較高，對(duì)于抗松材線蟲(chóng)病具有較明顯的效果。

采用種群相關(guān)寄生適應(yīng)性（RHS）系數(shù)來(lái)描述不同種群對(duì)不同寄主的致病力差異能較好地反映線蟲(chóng)種群和寄主之間的關(guān)系。張治宇等在測(cè)定松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)致病性時(shí)，表明線蟲(chóng)群體的致病力差異明顯，RHS系數(shù)變化較大[33?34]。本研究通過(guò)對(duì)多次接種不同抗性松幼樹(shù)中的線蟲(chóng)RHS系數(shù)的測(cè)定，較好的反映了松材線蟲(chóng)種群在寄主體內(nèi)適應(yīng)性的變化。在第1次接種測(cè)定中，各松材線蟲(chóng)種群的RHS系數(shù)在0～10之間，其中，在抗性馬尾松幼樹(shù)體內(nèi)的弱毒蟲(chóng)株種群不能正常繁殖，線蟲(chóng)數(shù)量很少；而隨著反復(fù)的侵染，線蟲(chóng)的寄生適應(yīng)性得到提高，在第3次接種測(cè)定中，線蟲(chóng)所有種群的RHS系數(shù)均處于上升趨勢(shì)，而在抗性馬尾松幼樹(shù)體內(nèi)的強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ?Ma種群的RHS系數(shù)甚至超過(guò)了第1次測(cè)定中在感病寄主黑松幼樹(shù)體內(nèi)蟲(chóng)株的水平。該結(jié)果表明，無(wú)論是強(qiáng)毒還是弱毒松材線蟲(chóng)，通過(guò)反復(fù)侵染寄主，其種群適應(yīng)性均可得到較大的提高，最終都可在高抗寄主中生存并增殖?？梢酝茰y(cè)，如果繼續(xù)侵染不同抗性寄主，松材線蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株的致病力會(huì)得到增強(qiáng)，同時(shí)原本高抗的松樹(shù)種群也可能因線蟲(chóng)種群適應(yīng)性的提高而抗性下降。

有研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)條件可以調(diào)節(jié)生物種群性比[35]。如馬尾松松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在饑餓條件下，性比下降為0. 67，對(duì)照性比為0. 95，表明在饑餓條件下存在明顯的雄性化傾向，而試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)食量大，資源需求閾值較高，饑餓導(dǎo)致雌蟲(chóng)死亡比例明顯偏高[36]。本研究對(duì)接種不同抗性松幼樹(shù)松材線蟲(chóng)種群雌雄性比的變化進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在易感黑松幼樹(shù)體內(nèi)，松材線蟲(chóng)種群適應(yīng)性較好，種群雌雄性比也保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。而在高抗寄主幼樹(shù)體內(nèi)松材線蟲(chóng)種群適應(yīng)性較低（第1次接種）時(shí)，雌雄性比值小于1，種群中雄成蟲(chóng)數(shù)量相對(duì)較多；隨著線蟲(chóng)種群適應(yīng)性的提高（第3次接種），雌雄性比值也隨之升高，比值大于1，說(shuō)明通過(guò)不斷侵染寄主其雌蟲(chóng)數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，種群繁殖量也隨之增長(zhǎng)。因此，當(dāng)線蟲(chóng)種群適應(yīng)性提高時(shí)，其種群繁殖力增強(qiáng)從而使高抗松幼樹(shù)抗病力下降。在對(duì)松材線蟲(chóng)相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默與松材線蟲(chóng)生存相關(guān)基因如半胱氨酸蛋白酶基因（Bx-cpls）及自噬相關(guān)基因（Bx-ATG1及BxATG8）后，松樹(shù)體內(nèi)的線蟲(chóng)數(shù)量相應(yīng)減少，且松樹(shù)的發(fā)病推遲。由此說(shuō)明線蟲(chóng)的繁殖力減弱相應(yīng)地會(huì)降低其致病力[37?38]。

松材線蟲(chóng)種群分泌的纖維素酶一直被認(rèn)為是松材線蟲(chóng)可能的致病因素之一，相關(guān)研究也反映了纖維素酶在發(fā)病過(guò)程中所起的一定作用，即松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)過(guò)程中，可通過(guò)分泌纖維素酶軟化松樹(shù)細(xì)胞壁，從而有利于其侵染[39?43]。本研究比較了來(lái)自不同抗性松幼樹(shù)上松材線蟲(chóng)纖維素酶活性的變化。結(jié)果表明，強(qiáng)毒蟲(chóng)株的纖維素酶活性整體高于弱毒蟲(chóng)株，接種高抗寄主幼樹(shù)的松材線蟲(chóng)種群的纖維素酶活力明顯高于接種低抗寄主幼樹(shù)的松材線蟲(chóng)種群；循環(huán)接種后，接種不同抗性寄主幼樹(shù)的松材線蟲(chóng)種群的纖維素酶活力隨著接種次數(shù)的增加均有一定程度的提高。這暗示在多次接種過(guò)程中，松材線蟲(chóng)致病力的增強(qiáng)與松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶活提高有一定關(guān)系。

上述研究表明松材線蟲(chóng)通過(guò)不斷侵染松幼樹(shù)，其在寄主松幼樹(shù)體內(nèi)的種群性比會(huì)不斷上升并趨于穩(wěn)定，線蟲(chóng)種群持續(xù)增殖，分泌的纖維素酶活力增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出對(duì)寄主適生性和致病力的提高。同時(shí)，在自然環(huán)境中，松材線蟲(chóng)的寄主發(fā)生轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象是存在的。因此推測(cè)，當(dāng)線蟲(chóng)從易感寄主由媒介昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)換至高抗寄主時(shí)，其種群適應(yīng)性最初還不高，短期內(nèi)可能并不會(huì)對(duì)寄主產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但如果這種情況持續(xù)發(fā)生，存活的線蟲(chóng)種群的寄生適應(yīng)性就會(huì)不斷提高，導(dǎo)致線蟲(chóng)致病力增強(qiáng)而最終成功侵染為害抗病的寄主種群。本研究結(jié)果有助于解釋在松材線蟲(chóng)病傳入我國(guó)初期，大多數(shù)馬尾松是較抗病的而如今馬尾松普遍發(fā)病的現(xiàn)象。至于目前松材線蟲(chóng)在我國(guó)的寄主范圍不斷擴(kuò)大是否與此有一定關(guān)聯(lián)尚待進(jìn)一步研究。

松材線蟲(chóng)無(wú)論是強(qiáng)毒還是弱毒蟲(chóng)株，均可通過(guò)不斷侵染松幼樹(shù)的方式提高其種群適應(yīng)性、雌雄性比和分泌的纖維素酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)其致病力，且循環(huán)侵染高抗松幼樹(shù)的增強(qiáng)效應(yīng)更為顯著。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示松材線蟲(chóng)病在我國(guó)的發(fā)生流行規(guī)律提供了重要的科學(xué)依據(jù)。