宋國(guó)林 ，趙映燦，劉 哲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

南美白對(duì)蝦(Litopenaeusannamei)學(xué)名為凡納濱對(duì)蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、對(duì)蝦科(Penaeidae)、濱對(duì)蝦屬(Litopenaeus)的動(dòng)物[1]，其外形與中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、墨吉對(duì)蝦(Penaeusmerguiensis)極為相似。南美白對(duì)蝦為廣溫廣鹽性熱帶蝦類(lèi)，成蝦多生活于離岸較近的沿岸水域，幼蝦棲息于餌料豐富的河口區(qū)，是目前世界上三大養(yǎng)殖對(duì)蝦中單產(chǎn)量最高的優(yōu)良品種[2-3]，原產(chǎn)于南美太平洋沿岸的水域，我國(guó)于1988年引進(jìn)并大規(guī)模地推廣養(yǎng)殖[4]。

隨著市場(chǎng)需求的增加，全國(guó)沿海掀起南美白對(duì)蝦大規(guī)模養(yǎng)殖熱潮，其產(chǎn)量約占中國(guó)所有養(yǎng)殖蝦類(lèi)總產(chǎn)量的80%。但隨著近海養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖總量的增加，近海海水環(huán)境惡化，蝦病發(fā)生日趨頻繁。這促使南美白對(duì)蝦在內(nèi)陸淡水水域的養(yǎng)殖市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，尤其是在鹽堿地水域[5]，內(nèi)陸鹽堿水多表現(xiàn)為低鹽度高堿度，鹽堿水對(duì)南美白對(duì)蝦脅迫相關(guān)的研究也受到了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注[6]。氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中重要的污染脅迫因子，特別是在養(yǎng)殖的中后期，水體中氨氮積累過(guò)量對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有明顯毒害作用[7-9]。長(zhǎng)時(shí)間高濃度氨氮脅迫會(huì)影響到甲殼動(dòng)物的免疫力及生長(zhǎng)速度，甚至出現(xiàn)死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的毒性研究主要集中于自然海水養(yǎng)殖[9]，但對(duì)于內(nèi)陸鹽堿地低鹽高堿度條件下氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的急性毒性研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)模擬西北地區(qū)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，研究氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的急性毒性試驗(yàn)，找出半致死濃度(LC50)和安全質(zhì)量濃度(SC)，以期為內(nèi)陸地區(qū)南美白對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蝦苗：本試驗(yàn)采用的南美白對(duì)蝦幼蝦購(gòu)買(mǎi)于廣東湛江育苗場(chǎng)。試驗(yàn)前，幼蝦置于體積為0.91 m×0.50 m×0.58 m、有效水量176 L的水箱中淡化暫養(yǎng)。初始暫養(yǎng)鹽度為25，水溫為21℃，穩(wěn)定2 d后逐步降低鹽度，待鹽度降至5時(shí)添加NaHCO3，逐步升高總堿度至250 mg/L。暫養(yǎng)期間用氣石連續(xù)微量充氣，并利用鹵蟲(chóng)、蝦片等進(jìn)行少量多次的投喂，隨機(jī)挑選體質(zhì)健壯、大小均勻、平均全長(zhǎng)為(1.12±0.45)cm的南美白對(duì)蝦幼蝦作為試驗(yàn)對(duì)象。

試驗(yàn)藥品：分析純NH4Cl(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；分析純NaHCO3(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

試驗(yàn)用水：充分曝氣后的自來(lái)水，用加熱棒控制水溫至(21.0±0.5)℃、用海水晶調(diào)節(jié)鹽度至5、溶解氧7.0 mg/L，pH 8.30，用NaHCO3調(diào)節(jié)總堿度為250 mg/L。

試驗(yàn)容器：使用容積為2.5 L的塑料盒作為試驗(yàn)容器，每盒裝2 L鹽度為5、總堿度為250 mg/L的人工配制海水。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)參照《魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)方法》[10]中毒性測(cè)定法的相關(guān)規(guī)定：在塑料盒中加入1.5 L經(jīng)處理鹽度為5、總堿度為250 mg/L的試驗(yàn)用水，參照北方養(yǎng)殖初期池塘水溫，將試驗(yàn)水溫設(shè)置為21℃，溶解氧為6.5 mg/L，pH 8.30；每個(gè)塑料盒中放入試驗(yàn)對(duì)蝦10尾，將氯化銨分別以10倍級(jí)差稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度組(0、0.1、1、10、100 mg/L)。試驗(yàn)期間停止投喂，測(cè)定水體pH值和水溫，及時(shí)清污、記錄并撈出死亡個(gè)體，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定24 h氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦全部存活時(shí)的最高質(zhì)量濃度和全部致死時(shí)最低質(zhì)量濃度。

1.2.2 急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的試驗(yàn)液質(zhì)量濃度的范圍，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置7個(gè)試驗(yàn)濃度梯度組(組別1～7)及1個(gè)空白對(duì)照組，同時(shí)每個(gè)梯度設(shè)置4個(gè)平行(表1)。每組放10尾活力好、大小均勻的南美白對(duì)蝦幼蝦，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程不充氣、不投餌，為保證試驗(yàn)液的濃度保持穩(wěn)定并有充足的溶解氧，每隔12 h進(jìn)行吸污一次，及時(shí)用鑷子剔除死亡個(gè)體并觀察其特征，每隔24 h用等濃度人工配制海水換水一次，換水率為100%。用納氏試劑光度法[11]進(jìn)行氨氮測(cè)定調(diào)節(jié)，并間隔12 h監(jiān)測(cè)各試驗(yàn)液中氨氮濃度以及水溫、pH值等各項(xiàng)指標(biāo)。定時(shí)觀察南美白對(duì)蝦幼蝦的活力及死亡情況，并記錄24、48、72、96 h南美白對(duì)蝦幼蝦的死亡尾數(shù)。

表1 氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦急性毒性試驗(yàn)濃度梯度

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，計(jì)算各處理組24、48、72、96 h的死亡率，死亡率=死亡的對(duì)蝦數(shù)/試驗(yàn)對(duì)蝦總數(shù)×100%；利用SPSS 25.0軟件的Probit回歸算法計(jì)算氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的半致死質(zhì)量濃度。再根據(jù)下列公式(1)計(jì)算安全質(zhì)量濃度[12]：

安全質(zhì)量濃度(SC)= 96 h LC50×0.1

(1)

分子氨(NH3-Nm)在氨氮(NH3-Nt)中所占的比例，與pH、水溫及鹽度有關(guān)。根據(jù)氨氮濃度可以求出分子氨濃度：

(2)

式(2)中，pKaS，T=9.24+0.003 091S+0.032 4(298-T)(T為開(kāi)氏溫度，T=273+t，t為攝氏溫度；S為鹽度；pKaS，T為電離常數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 南美白對(duì)蝦幼蝦對(duì)氨氮的中毒反應(yīng)

南美白對(duì)蝦幼蝦從暫養(yǎng)水箱放入盛有試驗(yàn)液的塑料盒后，最初各組幼蝦大多數(shù)在塑料盒底部正常游動(dòng)。隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，低氨氮濃度組的南美白對(duì)蝦幼蝦行為變化不明顯；而高氨氮濃度組南美白對(duì)蝦幼蝦表現(xiàn)為焦躁不安，在水中多沿著塑料盒壁快速游動(dòng)(離群獨(dú)游)，2 h后軟弱無(wú)力，易被抓捕，12 h后幼蝦鰓區(qū)呈藍(lán)綠色、蝦體肌肉白濁、肝胰臟白化或淡黃色、空腸不空胃，嚴(yán)重者喪失游泳能力、沉于塑料盒盒底，腹肢和游泳足不擺動(dòng)，用玻璃棒碰觸無(wú)反應(yīng)，陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死后鰓蓋張開(kāi)。

2.2 氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的急性毒性作用

氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的急性毒性作用見(jiàn)表2。對(duì)照組的蝦全部存活，在相同時(shí)間內(nèi)，隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加，南美白對(duì)蝦幼蝦的死亡率逐漸增加。氨氮為2.23 mg/L時(shí)，96 h累積死亡率為0%；當(dāng)氨氮為89.12 mg/L時(shí)，96 h的累積死亡率均達(dá)到100%；氨氮為190.00 mg/L時(shí)，48、72、96 h累積死亡率全為100%。同一藥物濃度下，隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，南美白對(duì)蝦幼蝦的死亡率也隨之增加，具有明顯的劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

表2 氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2所得試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Probit法對(duì)各時(shí)間段的死亡率對(duì)數(shù)與氨氮質(zhì)量濃度進(jìn)行擬合回歸分析，得出半致死濃度和安全質(zhì)量濃度結(jié)果(表3)。在低鹽高堿度條件下，氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的24、48、72、96 h半致死質(zhì)量濃度分別為1 001.17、63.41、47.98、28.30 mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.83 mg/L；分子氨的半致死質(zhì)量濃度分別為76.06、4.82、3.64、2.15 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.22 mg/L。

表3 氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的半致死濃度(LC50)和安全質(zhì)量濃度(SC)

3 討論

氨氮是指水中以分子氨和銨離子形式存在的氮，它是引起水生生物中毒的主要環(huán)境因子[14]。在養(yǎng)殖水體中，有機(jī)物中的氮被微生物降解、氨化，最終轉(zhuǎn)化為氨氮。另外，蝦類(lèi)屬于直接排氨型，其中約60%～70%的含氮排泄物是以氨氮的形式經(jīng)鰓組織直接排入到養(yǎng)殖水環(huán)境中，其余的少數(shù)含氮排泄物以尿酸鹽或尿素的形式排出[15]。氨氮中起毒害作用的物質(zhì)主要是分子氨，分子氨在氨氮中占比與pH、鹽度和溫度密切相關(guān)，分子氨和銨離子可以相互轉(zhuǎn)化。當(dāng)pH值升高時(shí)，銨離子轉(zhuǎn)化分子氨，分子氨含量增加，氨氮的毒性增強(qiáng)；水溫升高，氨氮的毒性增加[13]。氨氮嚴(yán)重影響蝦類(lèi)的育苗和健康養(yǎng)殖，當(dāng)氨氮在水中不斷積累時(shí)，其自身的細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)的生理活動(dòng)將受到嚴(yán)重的影響[16-18]。南美白對(duì)蝦氮代謝產(chǎn)物主要是氨氮[15]，當(dāng)養(yǎng)殖水體環(huán)境中氨氮含量過(guò)高時(shí)，動(dòng)物對(duì)氨氮代謝活動(dòng)受阻，并且水體中氨氮可以通過(guò)其鰓上皮大量滲入體內(nèi)[18]，會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物自身代謝所產(chǎn)生氨氮的正常排泄引發(fā)抑制，導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)血氨的濃度升高，進(jìn)而降低血液的載氧能力，影響?zhàn)B殖動(dòng)物的呼吸作用[19]。本研究中，高濃度氨氮組幼蝦死亡時(shí)鰓蓋張開(kāi)、體色發(fā)白，表明血藍(lán)蛋白處于還原態(tài)，此時(shí)血液中氧含量不足，幼蝦因缺氧窒息死亡，與王桂霞等[19]結(jié)論吻合。

有關(guān)氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的毒性已有較多的報(bào)道[20-23]，而關(guān)于低鹽高堿度條件下氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的急性毒性試驗(yàn)未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置的氨氮濃度范圍內(nèi)，幼蝦的存活率與氨氮濃度呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這與上述報(bào)道中的結(jié)果類(lèi)似，表明氨氮濃度升高會(huì)對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦產(chǎn)生毒性效應(yīng)。甲殼動(dòng)物的幼體對(duì)氨氮比較敏感，而隨著個(gè)體生長(zhǎng)以育，對(duì)氨氮的耐受性增強(qiáng)[24]。本試驗(yàn)使用全長(zhǎng)為1.12 cm的幼蝦，對(duì)氨氮和分子氨的安全質(zhì)量分別為2.83、0.22 mg/L，和表4中全長(zhǎng)5 cm幼蝦的耐受性相當(dāng)[22]，遠(yuǎn)高于彭自然等[21]的研究結(jié)果，因此，在低鹽高堿度條件下，離子強(qiáng)度也會(huì)影響分子氨的濃度，其濃度隨離子強(qiáng)度的增大而降低，氨氮毒性作用減弱。歐洲內(nèi)陸漁業(yè)咨詢委員會(huì)規(guī)定魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的分子氨濃度不得超過(guò)0.025 mg/L[25]，與該標(biāo)準(zhǔn)相比，在低鹽高堿度條件下，南美白對(duì)蝦幼蝦對(duì)氨氮的耐受性較強(qiáng)，且南美白對(duì)蝦具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，適合在西北內(nèi)陸進(jìn)行大面積推廣養(yǎng)殖。

表4 氨氮對(duì)不同發(fā)育階段南美白對(duì)蝦的安全質(zhì)量濃度

蝦苗集中標(biāo)粗時(shí)密度大，而且處于密閉的大棚中，氨氮往往超過(guò)3 mg/L，這是誘發(fā)南美白對(duì)蝦“轉(zhuǎn)肝期”發(fā)病的主要環(huán)境因素之一。為此，提出以下降低養(yǎng)殖水體中氨氮的有效途徑：1)合理設(shè)計(jì)養(yǎng)殖密度，根據(jù)養(yǎng)殖條件設(shè)計(jì)適宜的養(yǎng)殖密度，避免放養(yǎng)密度過(guò)大。2)科學(xué)投餌管理，選用優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料，最好含有微生態(tài)制劑的飼料，控制投喂量，盡可能采用少量多次的方式，以防止飼料過(guò)剩帶來(lái)的水質(zhì)敗壞。3)合理使用增氧機(jī)，增加水體的溶解氧含量，從而加快硝化反應(yīng)，降低水中的氨氮濃度。4)定期更換新水，是最快、最有效減少水中氨氮的方法，降低環(huán)境脅迫力。更換的水質(zhì)要好，水的溫度與養(yǎng)殖用水體的溫度要基本一致，避免幼蝦因溫度突變而使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激。5)定時(shí)監(jiān)測(cè)水體中pH值和溫度等各項(xiàng)指標(biāo)，避免因養(yǎng)殖水體中pH和溫度過(guò)高而導(dǎo)致有毒性的分子氨含量增加[26]。

4 結(jié)論

在水溫為21℃、鹽度為5、總堿度為250 mg/L、pH=8.3條件下，氨氮和分子氨對(duì)南美白對(duì)蝦的安全質(zhì)量濃度分別為2.83、0.22 mg/L。