李旭東，劉永濤，楊先樂，楊移斌，*，艾曉輝，

(1.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

我國蛙類養(yǎng)殖歷史悠久，目前養(yǎng)殖的主要品種包括黑斑蛙()、牛蛙()、棘胸蛙()、林蛙()等。養(yǎng)殖蛙類主要以藥用和食用為主，如棘胸蛙、林蛙等均是重要藥用材料來源，而黑斑蛙、牛蛙則主要用于食用。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，人們對(duì)蛙類產(chǎn)品的需求日益增多，導(dǎo)致野生種群數(shù)量急劇減少，如棘胸蛙已被我國列為易危等級(jí)，同時(shí)也被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)確定為全球性易危物種。鑒于野生種群無法滿足人們生活需要，蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示，蛙類年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到10.7萬t，其中，江西年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)3.8萬噸，位居全國第一。蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在一定程度緩解了需求壓力，也給養(yǎng)殖戶帶來了較好的經(jīng)濟(jì)效益。但與此同時(shí)，也激發(fā)了養(yǎng)殖戶對(duì)蛙類養(yǎng)殖的熱情，養(yǎng)殖密度、產(chǎn)量不斷上升，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，發(fā)病率不斷升高。蛙類主要疾病病原有病毒、霉菌、寄生蟲、細(xì)菌等。

2017年6月份起，福建、湖北等蛙類主養(yǎng)區(qū)陸續(xù)發(fā)生以歪頭、破頭與白眼為主要病征的疾病，蛙類發(fā)病后死亡率不高，但發(fā)病率非常高，癥狀呈現(xiàn)多樣性，影響了蛙類銷售，損失極大。本研究就該系列疾病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查、病原確定與藥物篩選等，以期為該系列病害防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：2017年6月份開始在福建、湖北蛙主養(yǎng)區(qū)采集具有典型癥狀的牛蛙、黑斑蛙樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室后用于診斷和病原分離。用于感染實(shí)驗(yàn)的黑斑蛙購自無此類病史農(nóng)場(chǎng)，所購黑斑蛙跳躍能力強(qiáng)，外表無傷痕，體重(25±2)g。健康的黑斑蛙置于水桶中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用水不超過蛙脖子，無異常后用于感染試驗(yàn)。

試驗(yàn)試劑：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片和細(xì)菌生化微量鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物合成與測(cè)序均由該公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疾病流行病學(xué)調(diào)查

對(duì)發(fā)病蛙養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境、水源情況進(jìn)行調(diào)查，了解發(fā)病時(shí)氣溫、水溫與水質(zhì)條件，并調(diào)查蛙類養(yǎng)殖發(fā)病史和用藥史。對(duì)瀕死并具有典型癥狀的病蛙進(jìn)行體表檢查與解剖觀察，總結(jié)病害基本特征。另取具有典型癥狀的蛙帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究。

1.2.2 病原分離純化

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)具有典型癥狀的蛙腦和內(nèi)臟器官進(jìn)行壓片觀察，檢查有無寄生蟲、真菌寄生。在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行細(xì)菌分離。將待解剖瀕死已麻醉的蛙置于冰上，蛙解剖前全身用75%乙醇消毒。用接種環(huán)分別蘸取每只蛙的腦和內(nèi)臟組織后劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上，在28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取優(yōu)勢(shì)菌株再進(jìn)行劃線純化，在純化菌株中加入15%甘油混勻凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。分批多次進(jìn)行上述操作。

1.2.3 細(xì)菌16S rRNA鑒定

將分離株接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫28 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落于10 μL無菌水中，并吹打均勻，即可作為菌液PCR的模板。

16S rRNA的通用引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，反向1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 50 μL、ddHO 47 μL、正反向引物各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為目的片段大小后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

用NCBI中的BLAST對(duì)分離株QW08的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取伊麗莎白菌屬()和水產(chǎn)重要病原菌的16S rRNA序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過MEGA6.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，10 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。同時(shí)基于16S rRNA序列對(duì)所分離的40株菌進(jìn)行聚類分析。

1.2.4 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察與生化鑒定

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇典型分離株QW08進(jìn)行進(jìn)一步生化鑒定，將分離株QW08接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，采用細(xì)菌微量生化鑒定管參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和文獻(xiàn)[7-9]的方法測(cè)定分離株的理化指標(biāo)。

1.2.5 人工感染

將分離株QW08接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)18 h，然后使用無菌NaCl溶液洗下菌苔，利用麥?zhǔn)媳葷嵴{(diào)整細(xì)菌懸浮液濃度大約1×10、1×10和1×10CFU·mL。將120只健康黑斑蛙隨機(jī)分為A、B、C、D共4個(gè)組，每組30只，其中，A、B、C為實(shí)驗(yàn)組，D組為對(duì)照組。A、B、C組的每只蛙腹腔注射0.1 mL菌懸液，菌懸液的濃度分別為1×10、1×10、1×10CFU·mL，即每只注射劑量分別為1×10、1×10、1×10CFU，對(duì)照D組的蛙則在相同部位注射等劑量PBS緩沖液。試驗(yàn)期間正常投喂飼料，溶氧保持在7.5～8.5，氣溫控制在24～26 ℃，使用充分曝氣的自來水進(jìn)行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖用水不超過蛙脖子，每個(gè)水桶加蓋灰色蓋子，防止蛙逃跑，并每天進(jìn)行換水操作。觀察實(shí)驗(yàn)蛙狀態(tài)直到最后停止死亡。每天記錄實(shí)驗(yàn)蛙情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，同時(shí)采集瀕死蛙內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離純化，并再次通過16S rRNA測(cè)序鑒定所純化的細(xì)菌。

1.2.6 組織病理學(xué)觀察

取帶有典型發(fā)病癥狀的黑斑蛙的腦、腎、肝、脾、腸道，用10%的中性福爾馬林固定液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂膠封片后，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 藥敏特性研究

參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離株藥敏特性進(jìn)行分析。將分離株QW08接種于營養(yǎng)肉湯中，28 ℃恒溫振蕩(200 r·min)培養(yǎng)24 h，用PBS緩沖液稀釋成濃度為1×10CFU·mL的菌懸液，取100 μL菌液涂布于MH瓊脂上，在平板上貼上選擇好的藥敏紙片，將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 疾病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖北、福建等多地蛙養(yǎng)殖場(chǎng)均有此類疾病暴發(fā)，發(fā)病率高，有的養(yǎng)殖池甚至達(dá)到90%，但死亡率不高，發(fā)病規(guī)格10～1 000 g均可發(fā)生，無明顯的個(gè)體差異。氣溫高低與發(fā)病率呈正相關(guān)，溫度高、水質(zhì)差則發(fā)病率高。蛙此次病害的外觀表現(xiàn)為破頭、歪頭與白眼等(圖1)。雖死亡率不高，但賣相不佳，影響出售，加上發(fā)病導(dǎo)致養(yǎng)殖成本上升，因此，該病害給養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

實(shí)驗(yàn)室經(jīng)光學(xué)顯微鏡壓片鏡檢，未在蛙體內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生蟲和真菌感染。經(jīng)細(xì)菌學(xué)研究，分離純化得到40株菌落顏色、形態(tài)與大小基本一致的細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌分離與鑒定

利用通用引物對(duì)40株分離細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到16S rRNA片段大小約1 500 bp，與預(yù)期片段大小一致。將經(jīng)測(cè)序得到的分離株16S rRNA基因序列(GenBank登錄號(hào)見表1)采用NCBI-BLAST程序進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果顯示，分離菌株均與伊麗莎白菌屬的同源性最高。選取分離株QW08、數(shù)株伊麗莎白菌屬種類和水產(chǎn)重要病原菌種類的16S rRNA基因序列，構(gòu)建了基于16S rRNA基因序列的發(fā)育樹，結(jié)果(圖2)顯示，分離株QW08跟米爾伊麗莎白菌聚為一個(gè)分支。利用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)分離株QW08進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果表明，分離株的生化指標(biāo)也與米爾伊麗莎白菌一致(表2)。結(jié)合分離株的理化特性與基因分析結(jié)果，綜合判定40株分離株均為米爾伊麗莎白菌。用40株分離菌株的16S rRNA構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，雖然分離株均為伊麗莎白菌屬，但不同來源的菌株也存在一定的遺傳差異。

圖1 蛙臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of frogs

表1 分離的40株細(xì)菌的16S rRNA序列GenBank登錄號(hào)

續(xù)表1 Continued Table 1

2.3 人工感染

在致病性研究中，實(shí)驗(yàn)組的黑斑蛙均出現(xiàn)不同程度死亡(圖4)。其中A、B、C組死亡率分別達(dá)到90%、50%、16.67%，并出現(xiàn)與自然發(fā)病類似癥狀，如歪頭、破頭與白眼，而對(duì)照組未見患病或者死亡。從瀕死的蛙體內(nèi)再次分離到米爾伊麗莎白菌。感染實(shí)驗(yàn)符合科赫氏法則，表明米爾伊麗莎白菌是此次蛙類病害的病原菌。

2.4 組織病理學(xué)觀察

患病蛙腸道黏膜層結(jié)締組織增生，膠原纖維增生，可見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，如黑色箭頭所示；血管擴(kuò)張淤血，如紅色箭頭所示；淋巴細(xì)胞灶性浸潤，如黃色箭頭所示(圖5-A)。患病蛙部分肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈透明空泡狀，如黑色箭頭所示；部分細(xì)胞內(nèi)未見細(xì)胞核，如紅色箭頭所示；肝竇內(nèi)可見大量的炎癥細(xì)胞，如黃色箭頭所示；多處肝竇內(nèi)可見棕黑色色素沉積，如綠色箭頭所示(圖5-B)?；疾⊥艽罅可窠?jīng)細(xì)胞胞質(zhì)呈空泡狀，如黑色箭頭所示；并可見淋巴細(xì)胞灶性浸潤，如紅色箭頭所示(圖5-C)。患病蛙腦膜處可見幾層排列較整齊的紅細(xì)胞，如黑色箭頭所示；并伴有少量淋巴細(xì)胞，如紅色箭頭所示(圖5-D)。患病蛙脾紅細(xì)胞大量減少，脾淋巴細(xì)胞增多，如黑色箭頭所示(圖5-E)。近曲小管腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色滴狀物，如黑色箭頭所示；間質(zhì)中有大量炎癥細(xì)胞，如紅色箭頭所示；部分腎小管壞死鈣化，如黃色箭頭所示；腎小球囊腔擴(kuò)張，囊腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞，如綠色箭頭所示(圖5-F)。

圖2 基于16S rRNA構(gòu)建的QW08與其他水產(chǎn)病原菌的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree for 16S rRNA sequence of QW08 and other aquatic pathogens

表2 菌株QW08的生化特性

2.5 藥敏特性

測(cè)定了分離株QW08對(duì)20種抗生素的敏感性，結(jié)果(表3)表明，分離株QW08僅對(duì)氟苯尼考高度敏感，對(duì)其他藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥。

圖3 基于16S rRNA構(gòu)建的40株分離細(xì)菌的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 40 isolated bacterias based on 16S rRNA sequence

A、B、C組每只注射齊量分別為1×107、1×105、1×103 CFU。D組每只注射0.1 mL PBS緩沖液。Each frog in group A, B and C was injected 1×107, 1×105 and 1×103 CFU, respectively.Each frog in group D was injected 0.1 mL PBS buffer.圖4 菌株QW08的人工感染試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Artificial infection results of QW08 strain

3 討論

伊麗莎白菌是自然界廣泛存在的一類條件致病菌，自然水體、土壤和醫(yī)院環(huán)境等均發(fā)現(xiàn)了其蹤跡。公共衛(wèi)生安全方面，伊麗莎白菌感染人類的機(jī)率比較低，但一旦感染，死亡率比較高。引起人類疾病的種類主要包括腦膜炎、敗血癥、肺部和軟組織感染等。另外，伊麗莎白菌也是寵物和多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要病原菌。目前在羅非魚()、胡子鯰()、中華鱘()等多種水生動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了伊麗莎白菌的感染，造成較大經(jīng)濟(jì)損失，特別是影響中華鱘的種族延續(xù)，值得重點(diǎn)關(guān)注。在養(yǎng)殖的兩棲類動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了伊麗莎白菌的感染，如虎紋蛙()、非洲爪蟾()、牛蛙、黑斑蛙、棘胸蛙等。感染伊麗莎白菌的養(yǎng)殖蛙類會(huì)表現(xiàn)出明顯的歪頭、破頭與白眼等典型癥狀。該病原自1993年被鑒定以來，隨著細(xì)菌分類學(xué)的不斷發(fā)展，病原命名一直在變化，目前認(rèn)可度較高的是米爾伊麗莎白菌。本研究病例癥狀與以上研究基本一致。通過回歸感染，進(jìn)一步確定了蛙類此疾病病原為米爾伊麗莎白菌。經(jīng)對(duì)40株分離菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)部分不同病例來源的分離菌株親緣關(guān)系有明顯差異，其中宿主與區(qū)域是影響親緣關(guān)系的重要因素，分離株具體親緣遠(yuǎn)近與病原特性關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，感染蛙的腦部神經(jīng)細(xì)胞受傷，并有炎性浸潤，很可能是米爾伊麗莎白菌透過血腦屏障進(jìn)入腦部，從而對(duì)蛙腦部產(chǎn)生嚴(yán)重危害，使得蛙在臨床上表現(xiàn)為歪頭、破頭與白眼等癥狀。但對(duì)于米爾伊麗莎白菌如何突破血腦屏障，其分子機(jī)制如何尚待進(jìn)一步研究。

據(jù)文獻(xiàn)顯示，米爾伊麗莎白菌可產(chǎn)生多種-內(nèi)酰胺酶，從而具有多重耐藥性，如對(duì)碳青霉烯類和頭孢類高度耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，本次分離到的米爾伊麗莎白菌僅對(duì)氟苯尼考高度敏感，在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，雖然使用氟苯尼考阻止了病情的進(jìn)一步蔓延，但病情在養(yǎng)殖周期內(nèi)反復(fù)暴發(fā)。藥敏試驗(yàn)與雷雪平等的研究結(jié)果一致，但與以往的研究存在很大不同。究其原因可能是不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同用藥水平或不同時(shí)空導(dǎo)致的。另外，由于米爾伊麗莎白菌致病的特殊性，從病理學(xué)與臨床表現(xiàn)上可以看出其主要是蛙類腦組織產(chǎn)生損害，因此，米爾伊麗莎白菌可以穿過血腦屏障，在病原分離過程中我們也在蛙腦中檢測(cè)到病原菌。目前國家標(biāo)準(zhǔn)漁藥中僅磺胺類藥物具備一定的穿過血腦屏障能力，因此，在蛙類生產(chǎn)實(shí)踐上使用較多，導(dǎo)致伊麗莎白菌普遍耐藥。實(shí)際上很多藥物是不能穿過血腦屏障的，如水產(chǎn)中常用的氟苯尼考、恩諾沙星等，這些抗生素只能殺滅血液中的病原菌，而無法清除腦中的病原菌，因此在臨床發(fā)現(xiàn)，盡管體外氟苯尼考等對(duì)伊麗莎白菌抑菌效果很好，但并不能有效治愈已經(jīng)產(chǎn)生明顯癥狀的蛙類。病原菌一旦突破血腦屏障，盡管血液中細(xì)菌被清除，一段時(shí)間后細(xì)菌又可快速重新感染，導(dǎo)致疾病反復(fù)暴發(fā)。因此，生產(chǎn)上常常產(chǎn)生誤區(qū)，認(rèn)為可能是用藥量不夠等造成的，養(yǎng)殖戶常常采取加大藥量與用藥頻次，這樣可能誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，并且蛙類的重要器官如腎也會(huì)受損，導(dǎo)致病情加重，使得疾病防控更加困難。建議該病的防控以免疫預(yù)防為主，加強(qiáng)疫苗、免疫增強(qiáng)劑和中草藥制劑等的開發(fā)，減少抗生素的使用；同時(shí)采取合理控制養(yǎng)殖密度、減少應(yīng)激等措施以降低病害發(fā)生的概率。

A，腸；B，肝；C，腦；D，腦；E，脾；F，腎。A， Intestines； B， Liver； C， Brain； D， Brain； E， Spleen； F， Kidney.圖5 自然發(fā)病蛙的不同組織病理學(xué)變化Fig.5 Pathological changes in different tissues of naturally diseased frog

表3 菌株QW08對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果