劉 微，蔣莉萍，池玉潔，劉義飛，陳士林，劉 迪＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

藥用黃連為毛茛科毛茛屬植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連C.teetaWall.的干燥根莖，三者分別習(xí)稱“川連或味連”“云連”“雅連”[1]。黃連以根莖入藥，性寒，味極苦，可清熱燥濕，瀉火解毒，常用于治療泄瀉痢疾、消渴、癰瘡腫毒等?！侗静菥V目》中記載：“其根連珠而色黃，故名。”[2]。目前從黃連中分離出來的成分已超過100 種，可分為生物堿類與非生物堿類。現(xiàn)代研究表明，黃連體內(nèi)的主要活性物質(zhì)為芐基異喹啉類生物堿[3]。2020 年版《中國藥典》規(guī)定黃連的指標(biāo)性成分為黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀[1]。豐富的化學(xué)成分也賦予了黃連多種藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有保護心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等顯著藥理作用[4]。湖北恩施作為黃連的道地產(chǎn)區(qū)之一，所產(chǎn)黃連形如雞爪，根莖集聚成簇，黃肥堅實，品質(zhì)極佳，素有“黃連之鄉(xiāng)”的美譽[5-6]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可通過與目的基因啟動子的特異性結(jié)合從而實現(xiàn)對植物各個階段及部位生長發(fā)育和抗逆的調(diào)控作用[7]。植物在生長發(fā)育過程中會產(chǎn)生大量非生長發(fā)育所需但在生物與非生物應(yīng)答中起著重要作用的次生代謝產(chǎn)物[8]，當(dāng)植物受到外界環(huán)境作用時，轉(zhuǎn)錄因子會介導(dǎo)作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，開啟相關(guān)基因的表達(dá)，合成相關(guān)的酶，從而直接或間接地參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在生物堿類、萜類、黃酮類化合物生物合成過程中起著重要作用。長春花（Catharanthus roseus）中的CrWRKY1 通過調(diào)控TDC 和ZCTI（長春花鋅指轉(zhuǎn)錄因子1）、ZCT2 和ZCT3 從而參與其體內(nèi)的吲哚類生物堿生物合成途徑，產(chǎn)生其主要活性物質(zhì)萜類吲哚生物堿[11]。CjWRKY1 是從日本黃連（Coptis japonica）鑒定出的第一個參與小檗堿生物合成過程的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控幾乎所有小檗堿生物合成途徑基因的表達(dá)[12]。在黃花蒿（Artemisia annua）體內(nèi)鑒定出的AaWRKY1可與編碼青蒿素合成途徑第一個關(guān)鍵酶（ADS）的基因啟動子區(qū)域的W-box 特異性結(jié)合，同時激活A(yù)DSpro2 啟動子，從而參與青蒿素的生物合成過程，破壞W-box 結(jié)合位點則會抑制ADS 的表達(dá)[13]；從穿心蓮中鑒定出的4個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可正向調(diào)控其體內(nèi)萜類化合物的生物合成[14]。蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過參與其體內(nèi)的異黃酮生物合成過程，從而產(chǎn)生植物抗毒素[15]。水稻（Oryza sativa）中的OsWRKY13可通過調(diào)控CHS基因的表達(dá)產(chǎn)生植物抗毒素[16]。

1995 年，Rushton 等[17]首次對 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域進行了準(zhǔn)確描述，表明它可能包含一種新的鋅指結(jié)構(gòu)。隨后的研究也證明了WRKY 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域包括WRKY 結(jié)構(gòu)域以及鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域由65個氨基酸殘基組成，其核心序列是靠近氨基（N）末端的7 個保守氨基酸WRKYGQK[18]。保守結(jié)構(gòu)域有時會變異成WRKYGKK、WRKYGEK 或者只含有WRKYG 蛋白核心序列，這樣的變異可能會對DNA 結(jié)合活性造成影響[19]。羧基（C）末端的鋅指結(jié)構(gòu)在植物的進化中可能起到重要的作用[20]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域可以與目的基因啟動子中的W-box（TTGACC/T）結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而參與植物體內(nèi)的各類活動，而這也是WRKY 結(jié)構(gòu)域高度保守的原因之一[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，有些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子含有多個WRKY 結(jié)構(gòu)域，有些則只有一個，鋅指結(jié)構(gòu)有Cx4-5Cx22-23HxH 和 Cx7Cx23HxC 兩 類[23]。 根 據(jù) WRKY 轉(zhuǎn)錄因子中所含有的WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，將其分為3大類：第Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有兩個及以上WRKY 結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ、Ⅲ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子只含有一個WRKY 結(jié)構(gòu)域。其中第Ⅰ、Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸組成模式為C2H2（Cx4-5Cx22-23HxH，X 為任意的氨基酸），第Ⅲ類WRKY基因鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸組成模式為C2HC（Cx7Cx23HxC，X 為任意的氨基酸），基于主要的氨基酸序列差異可將第Ⅱ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進一步劃分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe5 個亞家族[24]。系統(tǒng)進化數(shù)據(jù)分析表明，在高等植物中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族可更精確地劃分為Ⅰ、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe和Ⅲ類群[25]。

本研究以黃連基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用多種生物信息學(xué)方法對黃連WRKY基因家族成員進行基因鑒定、理化性質(zhì)分析、染色體定位分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、多序列比對分析、保守基序分析、基因結(jié)構(gòu)分析及表達(dá)分析，以期為進一步研究黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在黃連生物堿生物合成途徑的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黃連WRKY 基因家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析

黃連參考基因組由本實驗室自測并已發(fā)表[26]，使用Pfam（http:// pfam.xfam. org/）在線網(wǎng)站獲取WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列（PF03106）比對文件，利用HMMER軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，在黃連的蛋白序列中檢索，同時以擬南芥WRKY 蛋白序列作為查詢序列，使用BLAST 程序在黃連基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，將所得到的序列合并去掉重復(fù)，獲得候選黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。利用NCBI 中的Batch CDD search 數(shù)據(jù)庫進一步分析候選黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是否具有WRKY 結(jié)構(gòu)域，篩除無WRKY 保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，最終得到所有的黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族。使用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站中的ProtParam 工具分析黃連WRKY 蛋白序列的分子質(zhì)量以及等電點。使用WOLF PSORT（https:// www.genscript. com/wolf-psort.html）在線工具預(yù)測黃連WRKY蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2 黃連WRKY基因家族染色體定位分析

使用TBtools 軟件[27]從黃連基因組gff 文件中提取黃連WRKY基因家族成員的染色體位置信息，并進行繪圖可視化。

1.3 黃連WRKY 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育及序列比對分析

基于黃連和擬南芥WRKY 家族的蛋白全長序列，運用MUSCLE 軟件進行多序列比對，運用IQ-Tree 軟件基于JTT+F+R6 模型采用最大似然法（ML），bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1000，對黃連和擬南芥WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族進行系統(tǒng)進化分析，從而確定黃連WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的分類。使用Clustal X 軟件對黃連WRKY保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列進行比對分析。

1.4 黃連WRKY 家族的基因結(jié)構(gòu)與編碼蛋白的保守基序分析

使 用 MEME（http://meme-suite. org/meme/tools/meme）在線工具對黃連WRKY 家族蛋白序列進行保守基序分析，參數(shù)設(shè)置為：單一基序重復(fù)次數(shù)為任何，每個基序的寬度為6-50 個氨基酸殘基，，設(shè)定目標(biāo)motif數(shù)量為15。利用TBtools 軟件從黃連基因組gff文件提取黃連WRKY基因家族成員的外顯子和內(nèi)含子等基因結(jié)構(gòu)信息，并進行可視化處理。

1.5 黃連WRKY基因家族的表達(dá)模式分析

四年生黃連須根、根莖、葉、葉柄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為本實驗室所測（NCBI 登錄號：SRX10414485-SRX10414496），各組織的生物學(xué)重復(fù)數(shù)為3。使用TBtools 軟件繪制41 個已鑒定出的黃連WRKY基因家族成員在四個不同組織中的表達(dá)模式熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連WRKY基因家族成員篩選與鑒定

使用HMMER、BLAST 程序以及TAIR、CDD、Pfam數(shù)據(jù)庫對黃連基因組中的WRKY基因家族成員進行鑒定和篩選，最終得到41 個黃連WRKY基因家族成員（表1）。41 個黃連WRKY基因中序列最長的是CcWRKY3，含有931個編碼蛋白質(zhì)的氨基酸；最短的是CcWRKY33，含有84 個編碼蛋白質(zhì)的氨基酸。41 個黃連WRKY基因的開放閱讀框長度為252-2796bp；編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量為84-931 aa，平均編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量為369aa；蛋白分子質(zhì)量在9649.32-103620.60 Da 之間，平均分子質(zhì)量為 41017.226 Da，等電點為4.96-10.17，其中酸性蛋白（PI＜7）有20個；堿性蛋白（PI＞7）有21 個。95%以上的蛋白預(yù)測亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，僅兩個蛋白（CcWRKY31、CcWRKY41）預(yù)測亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。

表1 黃連WRKY基因家族信息

2.2 黃連WRKY基因家族成員的染色體定位

染色體定位分析結(jié)果為（圖1），41 個黃連WRKY基因在9 條染色體上均有分布，且分布不均。Chr9 上分布最多，有9個黃連WRKY基因；Chr1次之，分布有6個黃連WRKY基因，Chr2、Chr3 上各分布有 5 個黃連WRKY基因；Chr7、Chr8 上各分布有 4 個黃連WRKY基因，Chr4、Chr5 上各分布有 3 個黃連WRKY基因，Chr6上分布最少，只有兩個黃連WRKY基因。CcWRKY13、CcWRKY8在 Chr2 上緊密相鄰，CcWRKY37、CcWRKY9在 Chr5 上緊密相鄰，CcWRKY20、CcWRKY35在 Chr7 上緊密相鄰，CcWRKY39、CcWRKY3在Chr9上緊密相鄰。

圖1 黃連WRKY基因的染色體定位

2.3 黃連WRKY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹及序列比對

將鑒定出來的41 個黃連WRKY 蛋白序列與擬南芥中已知的72個WRKY蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，已鑒定出的41個黃連WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為3 大類（圖2），與擬南芥WRKY 分類結(jié)果一致。屬于第Ⅰ類的黃連WRKY 蛋白有6 個（CcWRKY3、CcWRKY29、CcWRKY39、CcWRKY24、CcWRKY16、CcWRKY25）；屬于第Ⅱ類的黃連WRKY蛋白有31個，分別與擬南芥的 Group Ⅱa、Group Ⅱb、Group Ⅱc、Group Ⅱd、Group Ⅱe 5 個亞類聚于一支。其中 GroupⅡ a 有 2 個 黃 連 WRKY 蛋 白（CcWRKY27、CcWRKY30），Group Ⅱ b 有 4 個 黃 連 WRKY 蛋 白（CcWRKY14、CcWRKY22、CcWRKY36、CcWRKY34），Group Ⅱ c 有 9 個 黃 連 WRKY 蛋 白（CcWRKY7、CcWRKY15、CcWRKY19、CcWRKY11、CcWRKY31、CcWRKY12、CcWRKY23、CcWRKY17、CcWRKY10），Group Ⅱ d 有 8 個 黃 連 WRKY 蛋 白（CcWRKY5、CcWRKY8、CcWRKY13、CcWRKY40、CcWRKY37、CcWRKY1、CcWRKY18、CcWRKY33），Group Ⅱe 有 8個 黃 連 WRKY 蛋 白（CcWRKY38、CcWRKY41、CcWRKY6、 CcWRKY2、 CcWRKY28、 CcWRKY21、CcWRKY26、CcWRKY32）。 屬 于 第 Ⅲ 類 的 黃 連WRKY 蛋 白 有 4 個 （CcWRKY4、CcWRKY9、CcWRKY20、CcWRKY35）。

圖2 黃連與擬南芥WRKY蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果將篩選出的黃連WRKY蛋白與擬南芥WRKY 蛋白的核心WRKY 結(jié)構(gòu)域序列進行比對（圖3），比對結(jié)果表明，41個黃連WRKY轉(zhuǎn)錄因子中含有WRKYGQK核心序列的蛋白有35個，含有WRKYGKK 核心序列的蛋白有 1 個（CcWRKY19），含有WRKYGEK 核心序列的蛋白有2 個（CcWRKY18、CcWRKY33）。32個黃連WRKY 蛋白序列中只含有一個WRKY 結(jié)構(gòu)域，6 個黃連WRKY 序列中含有兩個及以上WRKY 結(jié)構(gòu)域，其中CcWRKY3 含有三個WRKY結(jié)構(gòu)域；10 個黃連WRKY 蛋白序列核心序列或C 端鋅指結(jié)構(gòu)缺失，其中3 個黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子核心序列缺失（CcWRKY30、CcWRKY38、CcWRKY41），7 個黃連WRKY蛋白序列鋅指結(jié)構(gòu)不全。

圖3 黃連WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域比對分析

2.4 黃連WRKY家族基因結(jié)構(gòu)與保守基序

41 個黃連WRKY 家族蛋白序列保守基序分析結(jié)果為（圖 4），除 CcWRKY31、CcWRKY30、CcWRKY8、CcWRKY38、CcWRKY41 外，其他黃連 WRKY 蛋白都有motif1（含有WRKYGXK 基序），Group I 含有不止一個motif1。motif1、motif2作為保守的基序，在每類黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子中都存在。motif3 僅存在于Group I、Group IIc 中；motif4 存在于 Group I、Group IIc、Group IIe；motif5、motif8 僅存在于 Group IId、GroupIIe；motif7僅存在于 Group IId；motif9 僅存在于 Group IIa、Group IIb；motif12 僅 存 在 于 Group IId；motif13 僅 存 在 于Group IIb和Group IIc的CcWRKY10中；motif14僅存在于Group IIe。Group I、Group Ⅱc中的黃連WRKY蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)類型為Cx4Cx22-23HxH，Group Ⅱa、Group Ⅱb、Group Ⅱd、Group Ⅱe中的黃連WRKY蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)類型為 Cx5Cx23HxH，Group ⅡI 中的黃連WRKY蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)類型為 Cx7Cx23HxC（圖 3、圖 5）。41 個CcWRKY的基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果為（圖4），除保守結(jié)構(gòu)域高度缺失的CcWRKY38、CcWRKY41的外顯子與內(nèi)含子數(shù)量較多外（CcWRKY38有11 個外顯子，10 個內(nèi)含子；CcWRKY41有 9 個外顯子，8 個內(nèi)含子），大多黃連WRKY基因的外顯子的數(shù)量從3個到7個不等，內(nèi)含子的數(shù)量從 2 到 6 不等。Group IIc 中的CcWRKY31、CcWRKY19、CcWRKY10，Group IIb 中 的CcWRKY34、CcWRKY36，Group III 中的CcWRKY20，Group IId 中的CcWRKY18、CcWRKY33、CcWRKY8，Group IIe 中 的CcWRKY2、CcWRKY38、CcWRKY41沒 有 非 編 碼 區(qū) 。Group I、GroupIIb的內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量最多。

圖4 黃連WRKY家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)

圖5 黃連WRKY家族的15個保守基序

2.5 黃連WRKY家族的表達(dá)模式

41 個黃連WRKY基因在黃連不同組織（須根、根莖、葉、葉柄）中的表達(dá)模式分析結(jié)果為（圖6），除CcWRKY38、CcWRKY41在各個組織中的表達(dá)量都較低外，其他39 個黃連WRKY基因都至少在一個組織中表達(dá)量較高，其中有26 個黃連WRKY基因在僅一個組織中表達(dá)量較高。CcWRKY2、CcWRKY29、CcWRKY21在葉中表達(dá)量較高，CcWRKY3、CcWRKY4、CcWRKY10在葉柄中的表達(dá)量較高。研究發(fā)現(xiàn)黃連生物堿主要在根 莖 與 須 根 中 積 累 ，CcWRKY18、CcWRKY25、CcWRKY30、CcWRKY33、CcWRKY32、CcWRKY34、CcWRKY23、CcWRKY12、CcWRKY36、CcWRKY28、CcWRKY37、CcWRKY26、CcWRKY1、CcWRKY6、CcWRKY11、cWRKY8、CcWRKY24、CcWRKY13、CcWRKY40在須根中表達(dá)較高，CcWRKY17在根莖中特異 性 表 達(dá) ，CcWRKY15、CcWRKY35、CcWRKY 7、CcWRKY39在根莖中表達(dá)量較高，預(yù)測這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控黃連生物堿的生物合成。

圖6 41個黃連WRKY基因在不同組織中的表達(dá)譜

3 討論

黃連屬于毛茛科植物，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，藥用歷史悠久，被譽為湖北的“黃金”。黃連的主要活性成分為黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀等芐基異喹啉類生物堿，芐基異喹啉生物堿以酪氨酸作為前體物質(zhì)，由酪氨酸衍生物與酚醛類前體聚合形成其骨架結(jié)構(gòu)，再通過多種裂合酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶的催化作用最后形成黃連體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，常在黃連的根莖中合成與積累，具有抗菌、降血糖等作用。黃連作為常用藥，不僅是臨床常用處方藥，也是許多中成藥的重要原料，其需求量非常大，然而分布在全國范圍內(nèi)的黃連屬植物多已瀕危。因而，利用合成生物學(xué)技術(shù)，挖掘參與黃連芐基異喹啉生物堿合成和調(diào)控關(guān)鍵基因或者轉(zhuǎn)錄因子，通過微生物或細(xì)胞體內(nèi)合成次級代謝產(chǎn)物，以滿足小檗堿等芐基異喹啉類生物堿的藥用需求，能夠從一定程度上解決黃連藥用資源短缺的問題[28]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過其保守結(jié)構(gòu)域與目的基因啟動子上的W-box 結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，不僅參與調(diào)控植物體內(nèi)包括細(xì)胞器的構(gòu)成、植株的開花、結(jié)果、休眠、衰老等過程[29]，還可調(diào)控編碼次生代謝產(chǎn)物生物合成過程關(guān)鍵酶的基因的表達(dá)，從而直接或間接的參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成。目前在WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對植物次生代謝的調(diào)控方面已有較多研究[30]。Ding等通過全基因組數(shù)據(jù)分析了桂花（Osmanthus fragrans）的WRKY基因家族，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組與代謝組數(shù)據(jù)，最終發(fā)現(xiàn)桂花中OfWRKY36的表達(dá)模式幾乎與其體內(nèi)所有單萜的變化呈正相關(guān)，OfWRKY7與羅勒烯及其衍生物呈負(fù)相關(guān)，OfWRKY19的表達(dá)量與β-羅勒烯和(E, Z)-2,6-二甲基-2,4,6-三烯的積累呈正相關(guān)[31]。Zhang 等人從紅豆杉（Taxus chinensis）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出了61個 WRKY 轉(zhuǎn) 錄 因 子[32]，后 期 研 究 發(fā) 現(xiàn)TcWRKY8、TcWRKY26和TcWRKY47都顯著提高了紫杉醇生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平[33]。近年來，有關(guān)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對芐基異喹啉生物堿轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究也已有了初步進展[34]。從日本黃連中鑒定出的CjWRKY1屬于IIc 類亞家族且響應(yīng)JA 信號，過表達(dá)CjWRKY1能提高日本黃連中幾乎所有黃連素生物合成基因的表達(dá)[12]，Yamada 等 研 究 發(fā) 現(xiàn)CjWRKY1在 花 菱 草（Eschscholzia californica）中的異源表達(dá)僅導(dǎo)致EcCYP719A3、EcP6H和兩個新發(fā)現(xiàn)的OMT表達(dá)量增加；這樣的結(jié)果表明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在芐基異喹啉生物堿生物合成中的調(diào)控功能的多樣化[35]。在罌粟（Papaver somniferum）中，創(chuàng)傷誘導(dǎo)的 I 類 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子PsWRKY 可通過結(jié)合W-box 序列，反式激活TYDC基因啟動子從而參與芐基異喹啉生物堿的生物合成[36]，Apuya 等研究發(fā)現(xiàn)同屬的 I類 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY1 的異源表達(dá)增強了罌粟與花菱草懸浮細(xì)胞中芐基異喹啉類生物堿的積累[37]。

本研究使用在線網(wǎng)站預(yù)測黃連WRKY基因家族的亞細(xì)胞定位，預(yù)測結(jié)果表明除CcWRKY31、CcWRKY41外，其他WRKY 蛋白定位于細(xì)胞核中。轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程正常是在細(xì)胞核內(nèi)進行的，但這并不說明這兩個蛋白不是轉(zhuǎn)錄因子。如Trofimov等[38]發(fā)現(xiàn)在煙草中bHLH039 轉(zhuǎn)錄因子定位模式的變化取決于細(xì)胞中FIT（Fer-like iron deficiency-induced transcription factor）的存在，在細(xì)胞中缺乏FIT 時，bHLH039 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)IT 的存在增強了bHLH039 的移動性，并使該蛋白轉(zhuǎn)向細(xì)胞核。Wang等[39]發(fā)現(xiàn)調(diào)控油菜素甾醇（BR）代謝的轉(zhuǎn)錄因子BZR1原本存在于細(xì)胞質(zhì)中，但在BR 通路被激活后，BZR1可以被招募到細(xì)胞核中。 因此CcWRKY31、CcWRKY41 蛋白可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到某種作用后會向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移從而行使轉(zhuǎn)錄因子的作用。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)多個WRKY基因在同一染色體上緊密相鄰，推測它們在黃連的生長發(fā)育過程中行使的功能相似。結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果表明35 個黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域高度保守，且同屬一類的黃連WRKY 蛋白序列相似性較高。3 個黃連WRKY蛋白（CcWRKY19、CcWRKY18、CcWRKY33）序列含有變異結(jié)構(gòu)域，表明黃連WRKY基因家族在進化過程中出現(xiàn)了多樣性，相似的結(jié)果在擬南芥[40]、番茄[41]等多個物種中也相繼被發(fā)現(xiàn)。在植物WRKY基因家族進化過程中，第I類轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是第II 類和第III 類的起源[42]。本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明黃連IIc 亞類與Ⅰ類的WRKY轉(zhuǎn)錄因子聚在一個分支上，從進化層面分析，這兩類黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能有共同的起源，這與枇杷的WRKY系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致[43]。

本研究對41個黃連WRKY基因在4個組織（須根、根莖、葉、葉柄）中的表達(dá)模式進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13個黃連WRKY基因普遍表達(dá)，推測這13個基因可調(diào)控黃連的整個生長發(fā)育過程。26 個黃連WRKY基因僅在一個組織中表達(dá)量較高，其中CcWRKY3、CcWRKY10以及CcWRKY4在黃連葉柄中的表達(dá)量較高，推測其參與黃連葉柄的生長發(fā)育過程；CcWRKY2、CcWRKY29、CcWRKY21在葉中表達(dá)量較高，推測其參與黃連葉的生長發(fā)育過程。研究發(fā)現(xiàn)，參與次生代謝產(chǎn)物形成的酶基因和轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)模式與植物體內(nèi)活性成分的分布顯著相關(guān)[44.45]。多年生黃連的生物堿主要在根莖中積累，須根次之[46]，本課題組前期研究[26]發(fā)現(xiàn)黃連小檗堿、黃連堿生物合成途徑的CAS、SPS基因（Cch00017825）在根莖中表達(dá)量較高，須根也有表達(dá)，CcWRKY35、CcWRKY7、CcWRKY39的表達(dá)模式與其幾乎一致，且CcWRKY39為I 類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，與PsWRKY同類型，CcWRKY7為 IIc 類 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，推測CcWRKY35、CcWRKY7、CcWRKY39參與調(diào)控黃連小檗堿、黃連堿生物合成過程。CcWRKY17、CcWRKY15在須根中幾乎沒有表達(dá)，但在根莖中表達(dá)量較高，推測其同樣參與調(diào)控黃連生物堿的生物合成。CcWRKY18、CcWRKY25等19個黃連WRKY基因在須根中表達(dá)量較高，其表達(dá)模式與Chen 等[47]從黃連基因組中篩選出的參與黃連生物堿生物合成途徑部分候選基因幾乎一致，推測其可能會參與調(diào)控黃連生物堿生物合成過程。

對黃連WRKY基因家族的全基因組和表達(dá)譜分析將有助于理解芐基異喹啉生物堿生物合成、積累和易位的調(diào)控機制。特別是，不同的黃連WRKY 蛋白可能調(diào)控芐基異喹啉生物堿生物合成相關(guān)基因的時空表達(dá)模式。為了闡明黃連中芐基異喹啉生物堿的生產(chǎn)和積累的調(diào)控機制，需要對黃連WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進行進一步的研究。這些信息將有助于開發(fā)有效生產(chǎn)有價值生物堿的代謝和運輸工程方法。