孟 慧 ，于明薇 ，陳宇晗 ，馬云飛 ，王笑民

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010）

1 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約70%呈激素受體陽(yáng)性表現(xiàn)，其中60%以上為65 歲及以上患者[1]。內(nèi)分泌治療是激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的一線治療，絕經(jīng)后乳腺癌患者接受內(nèi)分泌治療能夠顯著降低疾病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，然而體內(nèi)雌激素水平明顯下降，出現(xiàn)骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變[2-3]，導(dǎo)致骨脆性增加，骨質(zhì)破壞，臨床可表現(xiàn)為骨痛、關(guān)節(jié)痛，嚴(yán)重者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，甚至骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，降低治療依從性，影響乳腺癌的預(yù)后。目前針對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松尚無統(tǒng)一治療方案，臨床多以雙膦酸鹽、鈣劑等為主要治療方法[4-5]，但療效尚不確切。

在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松屬于“骨痿”“骨枯”的范疇，肝腎虧虛，經(jīng)絡(luò)瘀阻是其主要病機(jī)，故多從腎肝論治。益腎健骨方是王笑民教授從肝腎論治絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松癥的常用方劑，取得了良好的療效，臨床研究證實(shí)，益腎健骨方可以減輕絕經(jīng)后乳腺癌患者的骨關(guān)節(jié)痛，提高患者的骨鈣素水平，增加骨轉(zhuǎn)換，改善骨質(zhì)疏松[6-7]。由于益腎健骨方藥物組成多，成分復(fù)雜，治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松的機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[8]是通過生物網(wǎng)絡(luò)平衡的辦法構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)中藥治療作用靶點(diǎn)[9]，探索藥物作用機(jī)制。

據(jù)此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法探討益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，以期為后期研究提供理論基礎(chǔ)支持。

2 研究思路與方法

本文通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選益腎健骨方中藥物活性成分及靶點(diǎn)，TTD、Drugbank、DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得疾病靶點(diǎn)，取交集后獲得益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質(zhì)疏松癥的靶點(diǎn)，通過Cytoscape 構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖和蛋白相互作用圖，并對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集，根據(jù)富集分析的結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究流程圖如圖1所示。

圖1 研究流程圖

3 材料與方法

3.1 益腎健骨方的中藥成分與靶點(diǎn)的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）[10]檢索熟地黃、山茱萸、菟絲子、川牛膝、香附、當(dāng)歸、茯苓、白芍、川芎、延胡索、絡(luò)石藤、透骨草十二味中藥并獲取成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，得到益腎健骨方活性成分集合。通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲得藥物活性成分的靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)基因即得到益腎健骨方活性成分的靶點(diǎn)。

3.2 骨質(zhì)疏松疾病基因獲取

以“breast cancer”“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，從藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），藥 物 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（DrugBank，https://go. drugbank.com/），疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGenet，https://www.disgenet.org/）中獲得絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)171個(gè)。

3.3 核心靶點(diǎn)篩選和中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用Venn diagram 在線繪圖工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）將益腎健骨方活性成分靶點(diǎn)與絕經(jīng)后乳腺癌骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)繪制Venny 圖，交集靶點(diǎn)即為益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的核心靶點(diǎn)。利用Cystoscape 3.7.2構(gòu)建益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質(zhì)疏松中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

3.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將藥物治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的交集靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入SRTING 數(shù)據(jù)庫(kù)，研究生物選擇“Homo sapiens”，隱藏孤立蛋白，導(dǎo)出tsv 文件，運(yùn)用Cytoscape3.7.2 繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得核心蛋白。

3.5 GO生物過程富集分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape 在線作圖進(jìn)行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析。選取P值前20 條繪圖。利用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建靶點(diǎn)-通路圖，直觀闡釋益腎健骨方治療芳香化酶抑制劑相關(guān)骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

3.6 分子對(duì)接

將疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)浞治鼋Y(jié)果按照Degree 值排序，取排名前5 的化合物進(jìn)行分子對(duì)接。排名前5 位靶點(diǎn)蛋白與PPI 網(wǎng)絡(luò)中Degree 排名前5 的靶點(diǎn)蛋白取交集，得到2 個(gè)核心靶點(diǎn)。通過KEGG 通路富集結(jié)果，得到通路關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank）獲得核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分3D 結(jié)構(gòu)，通過DockThor數(shù)據(jù)庫(kù)（https://dockthor.lncc.br/v2/）進(jìn)行分子對(duì)接。

3.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.7.1 藥物及試劑

益腎健骨方（含生藥熟地黃20 g，酒萸肉15 g，菟絲子10 g，川牛膝15 g，香附10 g，當(dāng)歸10 g，茯苓15 g，白芍15 g，川芎10 g，延胡索15 g，透骨草15 g，絡(luò)石藤20 g）購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院顆粒藥房，由專業(yè)人員質(zhì)檢確保藥品質(zhì)量。阿那曲唑片（阿斯利康，批號(hào)：J20150021）、阿侖膦酸鈉片（默沙東，批號(hào)：J20130085）由本院藥房提供。多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：1605162），pi3k 一抗（批號(hào)CST4263），akt 一抗（批號(hào) CST9272），β-actin 兔抗（CST3700）。

3.7.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9月齡SD雌性大鼠15只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組3只。

3.7.3 造模及給藥

大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，其中12只做雙側(cè)卵巢摘除，正常組僅摘除卵巢周圍等質(zhì)量的脂肪組織。術(shù)后一周灌胃給藥，中藥組以阿那曲唑片和益腎健骨方灌胃，給藥劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進(jìn)行換算，低劑量組為2 g/kg/天，高劑量組為8 g/kg/天，阿那曲唑片0.1 mg/kg/天，阿侖膦酸鈉片1 mg/kg/天。連續(xù)給藥12 周后處死大鼠，取股骨做HE 染色，Masson 染色觀察骨微結(jié)構(gòu)并比較各組膠原容積比，Western blot法檢測(cè)大鼠骨組織pi3k蛋白相對(duì)表達(dá)。

3.7.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4 結(jié)果

4.1 益腎健骨方中藥物活性成分與靶點(diǎn)的篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索益腎健骨方中12 味中藥，共得到141種藥代動(dòng)力學(xué)特征較好的活性成分，其中白芍10種，川牛膝4種，川芎6種，當(dāng)歸2種，茯苓15種，絡(luò)石藤9 種，山茱萸19 種，熟地黃2 種，透骨草4種，菟絲子11種，香附16種，延胡索43種，去除重復(fù)活性成分，共113 種，部分有效成分見表1。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分化合物的SMILE 結(jié)構(gòu)，提交Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲得對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的Gene Symbol。所有活性成分共得到靶點(diǎn)基因1186 個(gè)。通過TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)171 個(gè)，與中藥復(fù)方靶點(diǎn)取交集即得到益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在靶點(diǎn)，共43個(gè)（圖2）。

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)基因圖

表1 益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物活性成分信息

4.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建，結(jié)果見圖3。綠色菱形代表靶點(diǎn)，藍(lán)色方形代表中藥，六邊形為益腎健骨方的不同活性成分，其中黃色六邊形為12味中藥共有的9 種活性成分。節(jié)點(diǎn)的大小根據(jù)自由度確定，其中Degree 值排名前5 個(gè)的靶點(diǎn)是CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1，其Degree 值分別為91、71、68、67、65?；钚猿煞謱?duì)照信息見表2。

表2 益腎健骨方活性成分對(duì)照表

圖3 疾病-中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4.3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系

將篩選出的益腎健骨方治療芳香化酶抑制劑相關(guān)骨質(zhì)疏松的43個(gè)靶點(diǎn)利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape3.7.2 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，隱藏孤立靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)圖中包含38 個(gè)節(jié)點(diǎn)，200 條邊，節(jié)點(diǎn)代表不同的基因蛋白，邊代表其相連接的蛋白有相互作用的關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色按照Degree 值大小確定。按照Degree 值，排名前5 位的基因蛋白為別為ESR、ALB、IL6、SRC、CTNNB1（圖4）。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

4.4 GO和KEGG富集分析結(jié)果

GO 富集分析共得到GO 條目（P＜0.05）1048 個(gè)，其中生物學(xué)過程（Biological process）923 個(gè)，分子功能（Molecular function）78 個(gè) ，細(xì) 胞 成 分（Molecular function）47 個(gè)。通過KEGG 通路分析，得到KEGG（P＜0.05）條目84 個(gè)，涉及腫瘤通路、人乳頭瘤病毒感染等相關(guān)通路（圖5-圖6）。

圖5 GO富集分析結(jié)果

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果

4.5 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)益腎健骨方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將益腎健骨方可能作用到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的前20 條KEGG 信號(hào)通路及作用靶基因進(jìn)行分析，通過Cytoscape3.7.2 得到KEGG 網(wǎng)絡(luò)圖（圖7），中間黃色節(jié)點(diǎn)代表靶蛋白，周圍紅色節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，根據(jù)Degree 值大小調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和透明度。如圖所示，益腎健骨方可能通過多個(gè)通路、多靶點(diǎn)共同起效治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質(zhì)疏松。

圖7 KEGG通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

4.6 分子對(duì)接結(jié)果

根據(jù)疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，Degree 值排名前五的化合物為β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚，排名前五的靶點(diǎn)分別為CYP19A1、ESR2、SRC、AR、ESR1，將疾病-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中Degree 排名前 5 的靶點(diǎn)與 PPI 網(wǎng)絡(luò)中Degree 排名前5 的靶點(diǎn)取交集，得到核心靶點(diǎn)2 個(gè)，分別為ESR1、SRC。通過KEGG 通路富集，COX2與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)系緊密，在此與核心靶點(diǎn)一起通過分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證（表3）。

表3 Degree前5的化合物與核心靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)的分子對(duì)接信息

通過DockThor數(shù)據(jù)庫(kù)（https://dockthor.lncc.br/v2/）進(jìn)行分子對(duì)接，并計(jì)算靶點(diǎn)與化合物對(duì)接后的結(jié)合能。一般認(rèn)為，配體與受體之間的結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定，其發(fā)生作用的可能性就越大，分子對(duì)接結(jié)果見表2。核心靶點(diǎn)SRC、ESR，潛在靶點(diǎn)COX2 與β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、槲皮苷、山柰酚均能較好結(jié)合，對(duì)接示意圖見圖8～圖10。

圖8 從上至下依次為SRC與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對(duì)接

圖9 從上至下依次為ESR與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對(duì)接

圖10 從上至下依次為COX2與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對(duì)接

可以看出核心靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)與槲皮苷的結(jié)合能最低，表明槲皮苷與核心靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)的結(jié)合穩(wěn)定。圖 9 中槲皮苷通過 Gln198、Glu54、Lys44、Asp194形成氫鍵相互作用，結(jié)合在SRC的活性口袋。圖10中槲皮苷通過殘基 Glu75、Glu111、Tyr231、Asp232 形成氫鍵相互作用，結(jié)合在ESR的活性口袋。圖11中槲皮苷通過殘基His2、Asn7、Gln296 形成氫鍵，與潛在靶點(diǎn)COX2結(jié)合。

4.7 骨組織H&E染色及Masson染色結(jié)果

大鼠股骨下段H&E染色，正常大鼠股骨骨小梁排列緊密規(guī)則，模型組可見骨小梁稀疏且排列不規(guī)則；中藥高劑量組和中藥低劑量組骨小梁排列致密，可見少量新生骨組織（圖11）。

圖11 術(shù)后12周各組大鼠股骨組織切片H&E染色（10×）

對(duì)SD 大鼠股骨下段矢狀面進(jìn)行Masson 染色，骨小梁藍(lán)染，骨髓腔呈紅色。光鏡下觀察，正常組骨小梁排列規(guī)則，層次清晰；模型組骨小梁稀疏且排列不規(guī)則；與模型組相比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，膠原層次清晰（圖12-圖13）。

圖12 術(shù)后12周各組大鼠股骨組織Masson染色（10×）

圖13 各組大鼠股骨下段膠原容積比

4.8 各組大鼠骨組織pi3k蛋白相對(duì)表達(dá)

采用Western blot 法檢測(cè)各組大鼠股骨組織pi3k蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，中藥低劑量組pi3k 表達(dá)量較模型組顯著降低（P＜0.05），中藥低劑量組p-pi3k 的表達(dá)水平顯著低于正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、中藥高劑量組（P＜0.05）（圖14、表4）。

表4 各組大鼠骨組織中pi3k和p-pi3k蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠骨組織中pi3k和p-pi3k蛋白表達(dá)比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，ΔP＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P＜0.05，與中藥高劑量組比較，**P＜0.05。

images/BZ_345_196_396_1196_738.png

圖14 各組大鼠骨組織pi3k和p-pi3k蛋白表達(dá)

4 討論

絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者服用芳香化酶抑制劑后常見的臨床疾病。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素主要通過芳香化酶從雄激素轉(zhuǎn)化而來，芳香化酶抑制劑可以選擇性阻斷芳香化酶的作用，降低循環(huán)雌激素水平。雌激素有利于骨細(xì)胞的生成，雌激素水平下降，破骨細(xì)胞及其前體產(chǎn)生增多，骨吸收增加，骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)改變[11]，患者可以有骨痛、關(guān)節(jié)痛等表現(xiàn)，雙能X 線吸收測(cè)定（DXA）可表現(xiàn)骨密度下降。益腎健骨方以補(bǔ)腎健脾、調(diào)肝理氣為法，全方共12 味藥，熟地黃、山茱萸、菟絲子、川牛膝補(bǔ)腎健骨，香附、當(dāng)歸、白芍調(diào)肝理氣，川芎、延胡索、透骨草、絡(luò)石藤通絡(luò)止痛，茯苓補(bǔ)中有瀉，兼益心脾。

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)益腎健骨方進(jìn)行成分-靶點(diǎn)的篩選，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，得到113 種藥代動(dòng)力學(xué)較好的活性成分，藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示，延胡索的活性成分最多，其次為山茱萸、茯苓、香附。益腎健骨方中活性成分較好的化合物β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山奈酚等可能 通 過 Pathways in cancer、Human papillomavirus infection、Pi3k-Aktsignaling pathway、Focal adhesion 等通路作用于 ESR1、SRC、ALB、IL-6、PTGS2、CTNNB1等靶點(diǎn)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇是常見的植物甾醇類成分，植物甾醇具有抗炎[12]、抗腫瘤[13]及免疫調(diào)節(jié)[14-15]等功能。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可以改善骨骼脆性[16]，通過刺激OPG mRNA 的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，抑制骨吸收[17]。槲皮苷、山柰酚為黃酮類化合物，具有抗氧化[18-19]、抗腫瘤[20-21]的作用，其中槲皮苷是山茱萸、菟絲子、川牛膝、香附、延胡索、透骨草的共有成分。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮苷可能通過抑制NFATc1、TRAP 的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞活性及骨吸收[22]，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。山柰酚是菟絲子、香附、透骨草、白芍的共有成分，體外研究報(bào)道，山柰酚可能通過下調(diào)RANKL、c-Fos 及TRAF6 的表達(dá)減少破骨細(xì)胞的生成[23-24]治療骨質(zhì)疏松。

由蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，ESR、IL-6、SRC 等可能是益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)。ESR 可以通過多種方式參與骨代謝過程，雌激素與ESR 結(jié)合參與成骨細(xì)胞的生成與礦化[25]，破骨細(xì)胞的增殖與凋亡[26]，雌激素存在條件下，ESR 可以激活 PI3K/AKT/GSK 通路[27]，通過 RANKL/RANK/OPG 途徑調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成和活性[28]，影響骨代謝。IL-6為骨吸收誘導(dǎo)劑，主要作用于破骨細(xì)胞，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性。有研究報(bào)道，去勢(shì)大鼠血清中IL-6水平明顯升高[29]，骨密度與 IL-6 呈明顯負(fù)相關(guān)[30]。SRC 家族成員有調(diào)節(jié)雌激素依賴的雌激素受體靶基因表達(dá)的作用[31]，同時(shí)也是調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和雌激素受體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)因子[32]，有研究發(fā)現(xiàn)，SRC 可以通過調(diào)控ERα 的活性促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖分化[33]，促進(jìn)骨形成過程。

通過 GO 富集分析及 KEGG 通路分析，GO-BP 富集集中在細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)，移行的正向調(diào)節(jié)，血管形態(tài)的發(fā)生，而GO-MF 富集分析結(jié)果主要集中在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等方面，GO-CC 富集分析顯示黏著斑、細(xì)胞基質(zhì)黏著連接、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物等與絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質(zhì)疏松相關(guān)。益腎健骨方通過癌癥通過癌癥通路、人乳頭瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路等。其中Pi3k-Akt 信號(hào)通路通過多種方式參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病相關(guān)[34-35]，強(qiáng)勝林等[36]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抑制Pi3k-Akt 信號(hào)通路的激活可以減少破骨細(xì)胞的分化，從而改善骨質(zhì)疏松。在癌癥通路和人乳頭瘤病毒感染通路圖中，益腎健骨方還可對(duì)Wnt信號(hào)通路、COX2等進(jìn)行調(diào)節(jié)以治療骨質(zhì)疏松。

5 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接方法展示了益腎健骨方通過β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山柰酚等多種成分作用于 CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1 等靶點(diǎn)，從而影響癌癥通路、人乳頭瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路干預(yù)絕經(jīng)后乳腺癌骨質(zhì)疏松癥。為驗(yàn)證以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，益腎健骨方可以增加大鼠骨小梁密度及骨組織膠原溶劑，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。Pi3k-AKt 信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)中益腎健骨方下調(diào)大鼠骨組織中Pi3k蛋白表達(dá)，改善大鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)。

參照《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[37]，本文中疾病、藥物成分靶點(diǎn)來源于目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)；所用的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及分析方法為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究廣泛使用。通過動(dòng)物體內(nèi)研究對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，結(jié)果具有可重復(fù)性。但本研究仍有一定局限性：本文中中藥成分眾多，組成復(fù)雜，結(jié)合臨床實(shí)際，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證針對(duì)中藥可能作用的信號(hào)通路進(jìn)行，但未涉及處方中篩選到的主要活性成分，未來可開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。