莫業(yè)南 ，李 茵 ，揭西娜 ，王立新 ，吉春蘭 ，盧釗宇 ＊＊，劉旭生 ＊＊

（1. 南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院 廣州 510515；2. 廣東省中醫(yī)院 廣州 510120；3. 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 廣州 510006）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）是指存在三個月或者更長時間的腎臟損害或腎功能下降，最終發(fā)展至終末期腎臟病而需要透析或腎臟移植。在2017年，CKD的全球患病率為9.1%，較1990年增長了29.3%，已成為全球重大公共衛(wèi)生健康問題之一[1]，由此可見，當前我們迫切需要延緩CKD 進展的有效方法。在西醫(yī)治療中晚期CKD 方面，ACEI/ARB 因可能引起急性腎功能減退、高鉀血癥等不良反應而無法使用，而其他對癥治療如控制血壓、糾正貧血、改善營養(yǎng)不良等措施對延緩CKD 進展療效有限。近年來，越來越多的證據(jù)表明中藥對CKD 患者[2-4]和CKD 動物[1-3]有益。廣東省中醫(yī)院腎內科劉旭生教授梳理了全國30家中醫(yī)腎病重點?？品桨?，結合?？贫嗄昱R床實踐以及全國名老中醫(yī)的經(jīng)驗傳承，提出CKD 的核心病機為脾腎氣虛為本，水濕瘀阻為標，脾腎氣虛貫穿CKD 始終，確定了補脾益腎法，形成具有嶺南特色的補脾益腎方（Bupi Yishen Formula, BYF）[4-5]。方中黃芪、菟絲子為君，補脾氣、溫脾陽；臣藥有黨參、白術、茯苓、山藥、首烏，助黃芪健脾益氣、協(xié)菟絲子固精益腎；佐以丹參活血通絡，祛瘀水之結；薏苡仁補脾以化濕、化濕以健脾；整方呈現(xiàn)補脾益腎、活血利濕之效。隨后在全國23 家三甲醫(yī)院腎病?？崎_展多中心隨機對照研究以評估補脾益腎方治療CKD4期的療效，結果表明，補脾益腎方延緩慢性腎臟病4期進展療效優(yōu)于陽性藥氯沙坦且在不良反應方面無明顯差異[6-7]，提示補脾益腎方治療CKD4期療效確切、安全可控。但是，補脾益腎方改善腎功能，延緩CKD 進展的分子作用機制尚不清晰，阻礙了補脾益腎方在臨床上的進一步應用。

近年隨著腸道菌群和全身疾病關系研究的深入，尤其從2011 年腸腎軸被提出以來[8]，研究腸道微生態(tài)和慢性腎臟病之間的關系也逐漸成為焦點。腸道功能障礙是CKD 常見的并發(fā)癥之一，臨床上常表現(xiàn)為厭食、嘔吐、便秘、腸道粘膜出血糜爛等；并引起腸道菌群失調，導致腸道屏障受損[9]，內毒素和細菌代謝物易位至循環(huán)系統(tǒng)，引起尿毒癥毒素積蓄、炎癥、CKD 進展和心血管疾病[10]。腸道功能障礙的特點是腸道通透性異常增加，這是腸道屏障受損的指標[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)5/6 腎切除小鼠模型中，CKD 進程伴隨著血液中硫酸吲哚酚的積累，硫酸吲哚酚可抑制上皮細胞的跨膜電阻和緊密連接相關基因的表達[12]。由此可見，基于“腸腎軸”理論探索補脾益腎方延緩CKD 進展的機制，具有良好的理論和實踐基礎?！堆a脾益腎顆粒通過調整腸道微生態(tài)影響芳烴受體AHR 通路治療慢性腎臟病的機制研究》為劉旭生教授在2018年獲得國家自然科學基金面上項目資助，探索腸道菌群的調整以及腸道屏障的變化是其中的關鍵部分。

因此，本研究以腸道菌群和腸道屏障為切入點，以5/6 腎切除大鼠構建CKD 動物模型，觀察補脾益腎方對CKD 大鼠腸道菌群的調節(jié)作用以及對腸道粘膜屏障功能的影響，進一步探討補脾益腎方延緩5/6 腎切除大鼠腎功能減退的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級雄性 Sprague Dawley 大鼠，8 周齡，體質量范圍在180-220 g，從南方醫(yī)科大學動物實驗中心購入。質量合格證號：440021000019963，在廣東省中醫(yī)藥科學院動物實驗中心進行飼養(yǎng)，12 h 明/12 h 暗周期，環(huán)境溫度為20±2℃，相對濕度為50±5%，大鼠可自由攝食飲水。適應性喂養(yǎng)時間為1周，隨后開始實驗。廣東省中醫(yī)院動物實驗倫理委員會已通過本實驗的倫理審核（動物倫理批號：2019026）。

1.2 藥物與試劑

補脾益腎方由黃芪、黨參、菟絲子、白術、茯苓、山藥、薏苡仁、何首烏、丹參等組成，購自康美藥業(yè)。中藥浸膏按以下方法進行制備：每次取上述飲片共1550 g 生藥混合后，加入純水（1:8（w/v））浸泡30 min，煮沸后煎煮1 h，共煎煮3 次；濾去藥渣，將濾液合并后置于旋轉蒸發(fā)儀中進行濃縮至500 mL 為補脾益腎方高劑量藥液（含生藥濃度為3.1 g·mL-1），冷卻后密封冷藏保存?zhèn)溆?。待使用時在補脾益腎方高劑量藥液中加入等量純水攪拌稀釋為補脾益腎方低劑量溶液（含生藥濃度為1.55 g·mL-1）。

1.3 動物分組、模型構建及藥物干預

利用Excel 軟件產生隨機數(shù)字表，隨機從40 只大鼠中抽取10 只作為假手術組（Sham 組），余30 只大鼠則行5/6 腎切除手術以構建CKD 模型：先采用腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）對大鼠進行麻醉，備皮、消毒，于脊柱旁開1.5 cm、左肋骨下緣處做一縱向切口，使左側腎臟充分暴露，剝離腎包膜及腎上腺，動脈夾夾閉左側腎蒂，切除左腎上、下極2/3 腎實質，創(chuàng)面止血并確認無出血后，將殘余腎組織還納入腹腔，逐層縫合。一周后行右腎切除術，麻醉及手術過程與前相同，由此構建5/6腎切除CKD大鼠模型。4周后通過眼眶采血進行檢測血肌酐和尿素氮，來評估是否造模成功。根據(jù)血肌酐水平將成功造模的5/6 腎切除大鼠隨機分成3 組：補脾益腎方高劑量組（H-BYF 組）、補脾益腎方低劑量組（L-BYF 組）和模型對照組（5/6Nx 組），每組各 10 只。H-BYF 組和 L-BYF 組大鼠分別給予補脾益腎方高劑量藥液和低劑量藥液灌胃；假手術組和5/6 腎切除模型組分別予蒸餾水灌胃；一次灌胃量為1 mL/100 g體重，每天1次，連續(xù)4周。

1.4 標本采集

干預過程中，每周稱重以及記錄大鼠的一般情況。干預結束前收集大鼠24 h 尿液和糞便；干預結束后行腹主動脈采血，血液標本經(jīng)離心機3000 rpm，15 min 離心后留取血清標本，以上尿液、糞便及血清標本儲存在-80℃冰箱中備檢；腎臟及結腸組織分為兩部分標本，一部分置入4%甲醛溶液固定以作病理組織切片，另一部分放入凍存管后置入液氮中，再轉移在-80℃冰箱中以行western-blot。

1.5 生化檢測與酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測

使用羅氏Cobas C702 全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）、血白蛋白（ALB）。尿蛋白通過使用BCA（Bicinchoninic acid）蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Fisher Scientific）檢測。根據(jù)大鼠硫酸吲哚酚 ELISA 試劑盒（Creative Diagnostics）說明書檢測血清硫酸吲哚酚水平。根據(jù)大鼠二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）ELISA 試劑盒（華美）說明書測量血清DAO水平。

1.6 腎臟及腸道病理損傷的檢測

腎臟及腸道組織標本在4%甲醛溶液浸泡固定24 h后修剪規(guī)整，隨后進行脫水、包埋、切片，切片厚度為3um。切片先進行65℃烘烤2 h，再將切片依次進行脫蠟、復水、染色，腎臟行PAS/Masson 染色（南京建成）觀察腎小管間質纖維化情況；結腸組織行HE 染色（博士德）觀察結腸粘膜上皮層結構，最后行透明、封片等步驟。

1.7 Western-blot評估腸道屏障功能

將蛋白酶抑制劑（碧云天）、磷酸酶抑制劑（碧云天）和蛋白酶抑制劑（碧云天）加入到RIPA 裂解液（Thermo Fisher Scientific），取結腸組織放入上述混合液中進行裂解后離心，通過BCA 蛋白試劑盒（Thermo Fisher Scientific）檢測上清液的蛋白濃度。取50g 蛋白質樣品與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（CST）混合變性后再電泳，并通過Bio-Rad快速轉印系統(tǒng)轉印到PVDF膜（Millipore）上。膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，后予ZO-抗體（1:1000，abcam），Occludin（1:1000，abcam），Claudin-1（1:500，abcam），IL-22（1:1000，abcam）或βactin（1:2000,CST）在4℃過夜，次日復溫后予TBST 洗滌3 次后在室溫下使用辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG 抗體（1:3000,CST）孵育1.5h。繼續(xù)予TBST 洗滌3次，加入ECL 化學發(fā)光液（Millipore），利用Bio-Rad 凝膠成像儀對信號進行捕獲和分析。

1.8 腸道菌群分析

由華大基因公司對糞便標本進行處理，大鼠糞便DNA 的提取通過使用QIAGEN 糞便基因組DNA 提取試劑盒來完成，并進行DNA擴增和鑒定。DNA文庫構建完成后，通過Illumina HiSeq/MiSeq 16S rDNA測序平臺使用二代測序法進行測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行質量控制、組裝、濾除低質量序列，得到高質量有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。為了探索糞便樣品的物種組成多樣性，對所有有效數(shù)據(jù)進行歸類操作分析，將相似度在97%以上的序列聚類為操作分類單元（Operational Taxonomic Units, OTUs）。得到OUT 序列后，通過BLCA 軟件比對注釋數(shù)據(jù)庫NCBI 對OTUs 的代表序列進行物種注釋，得到相對應的物種信息及其豐度分布情況。基于門的水平分析差異菌群的相對豐度，以物種豐度柱狀圖呈現(xiàn)；行α-多樣性分析以評估物種多樣性；行β-多樣性以評估物種豐富度。根據(jù)OTUs的物種注釋結果，采用Lefse方法進行組間比較，分析微生物的組間差異，利用條形圖顯示LDA score＞2的物種為顯著差異物種。

1.9 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析工具為SPSS19.0 軟件。計量資料采用均數(shù)±標準誤表示。分析時首先進行正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)分布者采用單因素方差分析比較均值，單因素方差有統(tǒng)計學意義時則進行均值兩兩比較；不滿足正態(tài)分布則應用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補脾益腎方有助于改善CKD相關指標

5/6Nx 組的血肌酐、尿素氮和24 h 蛋白尿及血清硫酸吲哚酚水平顯著高于Sham 組，H-BYF 組大鼠的上述指標均明顯下降（表1）。蛋白尿方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx 組大鼠的24 h 蛋白尿有明顯升高（151.3±14.0 vs 448.8±50.4，P=0.003）；與 5/6Nx 組 比較，H-BYF 組的24h 蛋白尿定量明顯下降（448.8±50.4 vs 239.7±22.2，P=0.028）。血肌酐方面，與 Sham 組大鼠相比，5/6Nx組大鼠的血肌酐水平有明顯升高（31.1±0.7 vs 66.8±5.6，P＜0.001）；與5/6Nx 組比較，H-BYF 組的血肌酐水平明顯下降（66.8±5.6 vs 51.3±1.5，P=0.007）。血尿素氮方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx組大鼠的尿素氮水平有明顯升高（5.3±0.2 vs 10.1±0.6，P＜0.001）。與 5/6Nx 組比較，H-BYF 組的尿素氮水平明顯下降（10.1±0.6 vs 7.5±0.3，P=0.002）。硫酸吲哚酚方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx 組大鼠的硫酸吲哚酚水平有明顯升高（5.8±0.6 vs 18.8±0.9，P＜0.001）。與5/6Nx 組比較，H-BYF 組的硫酸吲哚酚水平明顯下降（18.8±0.9 vs 9.0±1.0，P＜0.001）

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量的比較

與大鼠血肌酐和尿素氮的變化相一致，低劑量和高劑量補脾益腎方可改善CKD 大鼠的腎臟病組織病理損傷（圖1）。根據(jù)Masson染色所顯示腎臟纖維化結果，假手術組未見纖維沉積；5/6 腎切除模型組可見膠原纖維大量沉積于腎間質中，而低劑量組和高劑量組大鼠腎臟組織中膠原纖維沉積減少，其中高劑量組的減少尤為明顯。PAS 染色顯示，假手術組未見明顯病理改變，符合正常腎臟的病理切片表現(xiàn)；模型組大鼠出現(xiàn)腎小管腔增大、間質纖維化、腎小管萎縮、系膜細胞及基質增生，伴有大量單核淋巴細胞浸潤；腎切除大鼠接受低劑量和高劑量補脾益腎方治療后，腎臟病理損傷減輕，其中以高劑量補脾益腎方治療后腎損傷緩解最為明顯。

圖1 各組大鼠腎臟病理Masson（A）和PAS（B）染色結果（X200）

2.2 補脾益腎方可修復腸道屏障功能

假手術組大鼠的結腸黏膜組織緊密、未見明顯炎癥細胞浸潤；CKD 模型組大鼠的固有層組織疏松、結腸黏膜層水腫、炎癥細胞浸潤嚴重。與5/6 腎切除大鼠模型組相比，補脾益腎方治療組大鼠粘膜層和固有層的水腫均得到明顯改善，炎性細胞的浸潤明顯減少（圖2A）。

圖2 各組大鼠結腸病理HE染色結果(X200，A)及血清DAO水平（B）

如圖 2B 所示，與 Sham 組相比，5/6Nx 組血清 DAO水平顯著升高（6.0±0.8 vs 18.7±4.1，P=0.016），而經(jīng)高劑量補脾益腎方治療后血清DAO 水平顯著降低（18.7±4.1 vs 7.3±1.4，P=0.034）。

與Sham 組大鼠比較，5/6Nx 組大鼠的結腸組織緊密連接蛋白（ZO-1 和Claudin-1）以及IL-22 表達水平明顯下降，具有顯著性差異；與5/6Nx 組比較，H-BYF組則均有升高，具有顯著性差異。腸道組織緊密連接蛋白Occludin 的表達水平在各組間均無顯著性差異，但是與假手術組比較，5/6Nx 組大鼠的腸組織緊密連接蛋白Occludin的表達水平具有升高的趨勢，與5/6Nx組比較，L-BYF 組與H-BYF 組的結腸Occludin表達水平具有下降趨勢（圖3）。

圖3 各組大鼠結腸緊密連接蛋白和IL-22的表達水平

上述結果共同表明CKD 大鼠的腸道屏障功能損傷，補脾益腎方可以保護腸道屏障，修復腸道屏障功能，維護腸道屏障的完整性。

2.3 補脾益腎方可調整CKD大鼠的腸道菌群

2.3.1 測序結果質量分析

物種累積曲線是用于衡量和預測群落物種組成和豐富度的有效工具，被廣泛用于判斷抽樣量的充分性以及估計物種的豐富度。在本研究中，物種累計曲線圖的曲線末端上升趨勢趨于平緩，提示采樣率足夠，可進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析（圖4A）。

2.3.2 腸道菌群的多樣性分析

（1） α-多樣性分析 基于OUT 水平的分析，在Shannon指數(shù)上，Sham組和H-BYF組較5/6Nx模型組低；在Simpson 指數(shù)上，Sham 組和 H-BYF 組較 5/6Nx 模型組高。根據(jù)Wilcoxon Rank-Sum 檢驗結果，提示模型組和高劑量組之間Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)存在顯著統(tǒng)計學差異（P=0.0011和0.0006）（圖4B）。

（2） β-多樣性分析 基于非加權的距離的主坐標分析，5/6 腎切除模型組大鼠與高劑量組大鼠的物種明顯分開，各聚成一簇，而低劑量組大鼠則處于模型組和高劑量組二者之間，由此可知CKD 大鼠經(jīng)高劑量補脾益腎方治療后腸道微生物多樣性發(fā)生改變（圖4C）。

圖4 補脾益腎方調整CKD大鼠的腸道菌群

2.3.3 物種組成分析

為分析各組間物種的變化情況，通過與注釋數(shù)據(jù)庫NCBI 比對，對OUT 進行物種分類，并通過物種豐度柱狀圖直觀展示在門的水平上各組物種組成及比例。在門的水平上，各組大鼠腸道相對豐度最高的菌群均為擬桿菌門和厚壁菌門，其相對豐度分別為假手術組36.7%和58.2%，5/6Nx 模型組31.6%和62.2%，低劑量組27.5%和66.2%，高劑量組41.1%和47.9%（圖4D）。與正常組相比，5/6Nx 模型組的擬桿菌門和厚壁菌門數(shù)值比值（Bacteroidetes/Firmicutes, B/F）降低；與模型組相比，高劑量組的B/F值升高。

高劑量組和5/6Nx 模型組大鼠之間的腸道菌群多樣性存在差異，進一步使用Lefse分析以篩選組間差異物種，結果顯示：與5/6Nx 組比較，高劑量組大鼠糞便Prevotella（普氏菌屬）、Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamona（巨單胞菌屬）的相對豐度顯著升高，Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（鹽扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假單胞菌科）和Ruminococcus（瘤胃球菌）的相對豐度顯著降低（圖4E）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)補脾益腎方可有效降低5/6 腎切除CKD 大鼠的血肌酐、尿素氮和硫酸吲哚酚水平，降低24 h 蛋白尿定量水平，改善腎臟病理損傷；同時，經(jīng)過補脾益腎方治療后，腸道菌群中益生菌增加，致病菌減少，腸道組織IL-22 及緊密連接蛋白的表達增加，腸道屏障功能修復。因而，我們認為，補脾益腎方可能是通過調整腸道菌群，保護腸道屏障功能，減少尿毒癥毒素入血，發(fā)揮延緩CKD 進展的腎保護作用。

5/6 腎切除大鼠模型制作較簡單、重復性好，是研究腎纖維化發(fā)生發(fā)展機制及相關治療方法的理想模型，其典型病理改變是腎小球硬化和腎間質纖維化，與人類腎臟纖維化病理過程相一致。在我們的研究中，與假手術組相比，5/6 腎切除模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的系膜細胞及基質增生、腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化、炎性細胞浸潤等病理改變。與5/6 腎切除模型組相比，低劑量和高劑量補脾益腎方組的腎臟病理損傷均能得到緩解。

腸道不僅是消化食物和吸收營養(yǎng)的重要器官，所形成的屏障還能防止內毒素、尿毒癥毒素等腸腔內有害物質穿過腸道粘膜進入體內循環(huán)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)補脾益腎方可有效改善CKD 大鼠的腸道屏障功能。按照結構和功能的不同，腸道屏障包括四個部分：腸道生物屏障、腸道機械屏障、腸道免疫屏障和腸道化學屏障，共同維持著腸道乃至整個機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。腸道組織緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin 和Claudin-1等表達減少提示著腸道黏膜結構受損，可能引起腸上皮通透性增加，導致細菌易位，并伴隨血清DAO 水平升高[13]。DAO 在血液中的含量通常較低，主要表達在腸黏膜中，并與腸道屏障的通透性呈正相關[14]。而IL-22 可促進上皮細胞的再生和抗菌肽的產生，已被證明在粘膜防御中起關鍵作用[15]。我們的研究表明，補脾益腎方有助于改善腸道機械屏障和免疫屏障，前者是通過調節(jié)粘膜結構和上調緊密連接蛋白的表達來改善，從而降低從結腸到血清的DAO 水平；后者則是通過促進IL-22的產生來改善腸道免疫屏障功能。

與此同時，補脾益腎方還對腸道菌群的結構和代謝產生影響。生物屏障是由寄生于腸腔表面的大量細菌、病毒等構成的。在本研究中，CKD 大鼠經(jīng)補脾益腎方治療后，腸道菌群獲得一定的調整。首先體現(xiàn)在菌群多樣性的改變，與假手術組比較，CKD 模型組的 α 多樣性指數(shù)如 Shannon 升高，Simpson 下降，提示CKD 大鼠腸道菌群多樣性增加，這可能由于CKD 的疾病狀態(tài)下，與尿毒癥毒素代謝有關的致病菌過度生長[16]，而補脾益腎方的治療可有效調整腸道菌群。我們發(fā)現(xiàn)，在門的水平上在各組中相對豐度最高的細菌均為擬桿菌門和厚壁菌門，二者在調節(jié)宿主炎癥及免疫平衡中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和厚壁菌門的比值（F/B）與腸道通透性關系密切，二者呈正相關[17]。在本研究中，模型組的F/B 比值比假手術組高，高劑量組的F/B 比值較模型組下降，此變化趨勢與高血壓患者和糖尿病動物的腸道菌群F/B 值相一致[18-19]。

在科的水平上，補脾益腎方干預組降低了Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（鹽扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假單胞菌科）的相對豐度。已有研究發(fā)現(xiàn)，上述四種菌科可促進脲酶和尿酸酶等產尿毒癥毒素特定酶的產生[20]。在屬的水平上，補脾益腎方有助于提高了CKD 大鼠的Prevotella（普氏菌屬）、Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamonas（巨單胞菌屬）的相對豐度，降低了Ruminococcus（瘤胃球菌）的相對豐度。在輕度腎功能受損的成人中，Ruminococcus的豐度與硫酸吲哚酚水平呈正相關，與腎功能呈負相關[21]。在本研究中，與5/6 腎切除組大鼠相比，低劑量和高劑量補脾益腎方組的血肌酐、尿素氮以及硫酸吲哚酚均明顯下降，并呈劑量依賴性，考慮與補脾益腎方減少產尿毒癥毒素特定酶的菌屬相關。

已有研究證明腸道菌群失調，致病菌增多促進尿毒癥毒素的產生，破壞腸道粘膜屏障功能，使毒素進入全身循環(huán)系統(tǒng)，加速CKD 發(fā)展[12]。補脾益腎方降低產尿毒癥毒素特定酶的腸道菌群，包括Clostridiaceae（ 梭 菌 科 ）、Haloplasmataceae（ 鹽 扁 菌 科 ）、Micrococcaceae（微球菌科）和Pseudomonadaceae（假單胞菌科）的相對豐度，因而我們可檢測出補脾益腎方組的大鼠血清硫酸吲哚酚明顯減少。一些腸道微生物來源的尿毒癥毒素，包括苯乙酰谷氨酰胺、硫酸吲哚酚、硫酸對甲酚和氧化三甲胺，在CKD 和終末期腎臟病患者血清中升高，并與CKD 的發(fā)展、心血管事件、死亡等臨床終點呈正相關。已有實驗證明硫酸吲哚酚、硫酸對甲酚等尿毒癥毒素能促進CKD 大鼠腎間質纖維化。上述研究發(fā)現(xiàn)支持了腸源性尿毒癥毒素的增加可促進腎臟疾病進展。終末期腎臟病患者的腸道屏障功能受損，促進尿毒癥毒素進入全身循環(huán)系統(tǒng)，是尿毒癥患者普遍存在的全身炎癥的潛在原因。尿毒癥患者即使接受規(guī)律血液透析治療，硫酸吲哚酚等腸道微生物來源的尿毒癥毒素不能被有效清除，毒素蓄積引起的尿毒癥綜合癥，嚴重降低了患者的生活質量和縮短了預期壽命。因此，我們認為，補脾益腎方調節(jié)腸道菌群可以緩解尿毒癥的毒素蓄積癥狀，提高生活質量，延緩CKD 進展，或可推遲進入腎臟替代治療的時機。

雖然在本研究中未能以數(shù)據(jù)明確說明短鏈脂肪酸在各組間的差異，但是Prevotella（普氏菌屬），Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamonas（巨單胞菌屬）可促進腸道中短鏈脂肪酸的產生，為產短鏈脂肪酸菌[22-24]。當前已有研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸作為腸道上皮特殊營養(yǎng)和能量組分，發(fā)揮著保護腸道黏膜屏障、降低人體炎癥水平和促進胃腸道運動機能等作用，對維持人體健康至關重要。腸道菌群代謝產生的短鏈脂肪酸可通過抑制組蛋白去乙?；?，激活GPR41以促進缺氧誘導因子1α及芳香烴受體的表達，從而促進CD4+ T 細胞及固有免疫細胞中白介素-22（IL-22）的表達，以維持腸道免疫屏障穩(wěn)態(tài)[15]。IL-22是IL-10 家族成員，通過促進上皮屏障功能和誘導抗菌肽來保護宿主以免受到腸道炎癥的損傷[25]。IL-22敲除的基因小鼠，腸道屏障功能受損、抗菌肽減少，致病菌增加、益生菌減少、菌群失調，導致血液中菌群產物脂多糖和氧化三甲胺增多，活化巨噬細胞和單核細胞，啟動動脈粥樣硬化的發(fā)生，而補充IL-22可抑制小鼠促動脈粥樣硬化的菌群增殖，從而對動脈粥樣硬化起抑制作用[26]。另一方面，短鏈脂肪酸本身具有一定的腎保護作用，譬如補充短鏈脂肪可有效抑制高糖條件下腎小管上皮細胞和足細胞的炎癥，降低小鼠糖尿病腎病的發(fā)生[22]。對于終末期腎病患者而言，腸源性尿毒癥毒素可加劇全身炎癥和氧化應激，可促進并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展和提高患者死亡風險。根據(jù)一項初步臨床研究結果可知，維持性血液透析患者補充丙酸鈉可降低維持性血液透析患者的炎癥參數(shù)，抑制氧化應激[27]。在本研究中，經(jīng)補脾益腎方治療后的CKD 大鼠腸道病理改善、腸道組織緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin-1 增多，可能是補脾益腎方治療通過增加產短鏈脂肪酸的菌群，促進IL-22的表達，增加短鏈脂肪酸的產生，保護腸道屏障，維持腸道穩(wěn)態(tài)。

《金匱要略》有“四季脾旺不受邪”之說；中醫(yī)學認為脾居中焦，為氣血生化之源；脾的這種抗邪能力和運化水谷與腸道菌群的機體免疫功能和營養(yǎng)物質代謝具有類比之處。當腸道菌群失調時,可出現(xiàn)脾虛癥狀如腹脹、納呆、腹脹、乏力、便溏等,腸道菌群失調或許是中醫(yī)脾虛證的重要生物學機制之一[28]。在補脾益腎方中，黃芪、黨參、山藥、白術、薏苡仁、茯苓均具健脾功效，生物活性成分有黃酮類、多糖類、生物堿等，具有促進益生菌生長、抑制致病菌生長、抑制炎癥因子、保護腸黏膜、調節(jié)機體免疫力等作用[29]。腎為先天之本，脾為后天之本，水谷精微的培育和充養(yǎng)，才能使腎的精氣得到不斷充盈和成熟。因此，我們考慮：腸道菌群保持相對穩(wěn)態(tài)—脾胃化生水谷精微功能正?！院筇祓B(yǎng)先天，腎的精氣得到充盈；腸道菌群紊亂—脾失健運,產生濕、毒、瘀等邪實——腎的精氣受損。

綜上，補脾益腎方在減少致病菌生長的同時增加益生菌的相對豐度，調節(jié)腸道菌群，減少尿毒癥毒素的產生，促進腸道緊密連接蛋白和免疫因子IL-22 的產生，修復腸道粘膜屏障功能，減少毒素入血進入全身循環(huán)，從而延緩CKD 的進展。本研究的創(chuàng)新之處在于基于腸腎軸理論模型，從腸道菌群與腸道屏障相關的新角度，證實補脾益腎方可能通過調整腸道菌群，保護腸道屏障，延緩慢性腎臟病，構成補脾益腎方-腸道菌群-腸道屏障-尿毒組毒素-CKD 的潛在作用機制。本研究的不足之處在于探討補脾益腎方與腸道菌群和腎臟病的相關關系同時，未能對其因果關系進行確認，亦未能排除中藥對腎功能的直接作用，待日后進一步研究。