李猛，李海瑜，高明

(中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站，黑龍江 哈爾濱 150081)

0 引 言

黑土是我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)最重要的土壤資源之一，在保障國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。然而，由于過(guò)度耕作，黑土已經(jīng)嚴(yán)重退化，導(dǎo)致土壤侵蝕和有機(jī)質(zhì)流失[2]。保護(hù)性耕作措施可以改善土壤結(jié)構(gòu)，保持水土，增加土壤養(yǎng)分水平，提高作物水分利用率和增加作物產(chǎn)量，是防止土壤退化的一種有效方法，通常被視為未來(lái)可持續(xù)的耕作方式。因此，采取保護(hù)性耕作制度來(lái)維持東北地區(qū)的土壤生產(chǎn)力非常必要。

土壤氮素循環(huán)影響著土壤生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和可持續(xù)性。由于氮循環(huán)過(guò)程幾乎都是依靠微生物介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)完成的，因此土壤微生物在土壤氮循環(huán)中起著非常重要的作用[3]。其中，nifH基因是編碼固氮酶的一個(gè)亞基，為研究固氮菌的分布和多樣性提供了一個(gè)有用的途徑。對(duì)土壤中nifH基因多樣性的研究揭示了多種未知固氮菌的基因序列類型[4-7]。有數(shù)據(jù)表明，這些固氮菌在許多土壤系統(tǒng)中有著重要的作用，是主要的固氮微生物[8,11]。保護(hù)性耕作增加了土壤微生物豐度以及微生物多樣性[12-14]。一些研究表明，保護(hù)性耕作增加了固氮菌群落的多樣性，耕作方式和土壤深度的交互作用改變了其組成[12-18]。例如，Hsu和Buckley[15]研究表明，免耕制度下固氮菌對(duì)氮的固定效率的影響要強(qiáng)于土壤理化性質(zhì)的改變；趙有翼等[19]認(rèn)為免耕秸稈覆蓋提高了氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌及自身固氮菌數(shù)量，且隨著土層的加深，種植小麥土壤中的氨化細(xì)菌數(shù)量比免耕不覆蓋處理增加。同時(shí)，土壤理化屬性與土壤微生物活性密切相關(guān)[20-21]。Calderoli等[13]通過(guò)測(cè)序?qū)Π⒏⒌呐伺了共菰寥姥芯拷Y(jié)果表明，土壤穩(wěn)定性和土壤有機(jī)碳對(duì)nifH固氮菌功能有一定影響。適宜的土壤pH和高含量的土壤碳為固氮菌群落提供了更為理想的生存環(huán)境[22-23]。

然而，關(guān)于保護(hù)性耕作對(duì)東北黑土區(qū)固氮菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響尚不明確。本研究利用15年免耕和傳統(tǒng)耕作試驗(yàn)，采用高通量測(cè)序方法，探討東北地區(qū)免耕和傳統(tǒng)耕作條件下0～5 cm和5～20 cm兩個(gè)土壤深度的固氮菌群落的豐度、多樣性和組成的差異，解析東北黑土保護(hù)性耕作條件下固氮菌的群落結(jié)構(gòu)特征及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，研究結(jié)果將有助于增強(qiáng)保護(hù)性耕作對(duì)黑土保育的理論體系，為未來(lái)通過(guò)調(diào)控固氮微生物、優(yōu)化保護(hù)性耕作效果提供探索的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究依托中國(guó)科學(xué)院海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)(N47°26′，E126°38′)長(zhǎng)期定位實(shí)驗(yàn)站(簡(jiǎn)稱海倫站)。海倫站始建于1978年，2005年成為國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站，地處我國(guó)東北黑土帶的中心區(qū)域，也是中國(guó)生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)(CERN)最北端的生態(tài)站，是農(nóng)業(yè)資源、環(huán)境和生態(tài)多學(xué)科的綜合研究基地。海倫站海拔240 m，處于溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，年平均氣溫1.5～2.9 ℃，年平均降雨量500～600 mm，主要集中在5～9月，年平均有效積溫(≥10 ℃)2 400～2 500 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)2 600～2 800 h，無(wú)霜期120～130 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

海倫站的保護(hù)性耕作試驗(yàn)設(shè)置于2004年，包括免耕和傳統(tǒng)耕作兩種耕作制度，每種耕作制度設(shè)有3個(gè)重復(fù)，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每個(gè)地塊的面積為8.4 m×40 m，用0.7 m的緩沖帶與其他地塊隔開(kāi)，大豆(Glycinemax)和玉米(Zeamays)輪作。免耕處理(NT)只收獲作物種子，其他所有生物量都均勻覆蓋在整個(gè)地塊表面。每年5月初，作物(玉米或大豆)用免耕播種機(jī)播種，土壤保持原樣，不使用任何耕作措施。傳統(tǒng)耕作(CT)是所有地上生物量在10月份收獲后被移除，然后采用旋耕整地，深度為20 cm，起壟高度為15 cm。下一年在5月初用傳統(tǒng)的播種機(jī)種植，中耕起壟兩次。除耕作作業(yè)外，免耕和傳統(tǒng)耕作的其他管理都一樣。玉米每年施氮(N)138 kg·hm-2，磷(P2O5)51.75 kg·hm-2，鉀(K2O)15 kg·hm-2，大豆每年施氮(N)20.25 kg·hm-2，磷(P2O5)51.75 kg·hm-2，鉀(K2O)15 kg·hm-2。

1.3 樣品的采集與分析

2018年夏季，分別從免耕和傳統(tǒng)耕作0～5 cm和5～20 cm土層深度采集土壤樣品，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，其中每一土層的樣品是由隨機(jī)選取并混合均勻的六個(gè)樣點(diǎn)組成的復(fù)合樣品。將采集后的樣品放在無(wú)菌塑料袋里，置于冰盒內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，移除可見(jiàn)的植物殘?bào)w和石子，過(guò)2.0 mm的篩子，之后將樣品平均分成3部分，一部分風(fēng)干樣品和一部分鮮樣用來(lái)測(cè)定土壤基礎(chǔ)物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，另外部分放在-80 ℃冰箱存儲(chǔ)以備進(jìn)一步提取土壤DNA。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.5 土壤DNA提取，固氮菌nifH基因的熒光定量PCR和Illumina Miseq高通量測(cè)序

基于Fast DNA?SPIN Kit(MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit)試劑盒來(lái)提取DNA。使用NanoDrop(Thermo Scientific,Wilmington,USA)測(cè)量DNA數(shù)量和質(zhì)量。從土壤中提取的DNA的置于-20 ℃冰箱用于下一步分析。

采用引物nifH-F(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)與nifH-R(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)對(duì)固氮菌nifH基因進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定[27]。具體擴(kuò)增程序和PCR反應(yīng)體系為：在95 ℃下變性10 min，40個(gè)循環(huán)，變性：95 ℃，5 s；退火：50 ℃，30 s；延伸：72 ℃，40 s。對(duì)固氮菌nifH采用上述引物進(jìn)行高通量測(cè)序，PCR反應(yīng)混合物包括：15 μL 1×SYBR預(yù)混劑Ex Taq，每種引物0.25 μL，4 μL dNTPs(2.5 mmol)和1 μL DNA模板50 ng。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

將每個(gè)樣品的擴(kuò)增子進(jìn)行組合、純化、定量，然后使用MiSeq PE300委托上海美吉生物醫(yī)藥公司(Majorbio Bio-TecCo.Ltd)進(jìn)行高通量測(cè)序。用QIIME version 1.9.1軟件處理序列質(zhì)量，通過(guò)UCHIME算法刪除修剪后的序列，用UPARSE將剩余的樣本讀數(shù)以97%的相似性對(duì)序列進(jìn)行OTU劃分。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

基于Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)描述固氮菌群落的α多樣性。不同處理的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)差異采用One-way ANOVA方法分析，nifH基因的拷貝數(shù)和多樣性的交互作用使用Two-way ANOVA方法分析，用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)完成。土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)用Bray_curtis距離矩陣的PCA分析，nifH基因的拷貝數(shù)、多樣性和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性進(jìn)行分析。Mantel test在R(Version 3.5.0)軟件的vegan數(shù)據(jù)包中完成，用來(lái)檢驗(yàn)土壤固氮菌群落與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 免耕對(duì)土壤固氮菌豐度和群落組成的影響

免耕和傳統(tǒng)耕作下，nifH基因的豐度范圍為0.73×106～1.81×106copies·g-1dry soil。耕作和土壤深度對(duì)nifH基因拷貝數(shù)沒(méi)有顯著影響(圖1)。本試驗(yàn)從所有樣品中獲得516 549條優(yōu)化序列，平均長(zhǎng)度386 bp。獲得的數(shù)據(jù)在97%相似性水平上進(jìn)行分類，檢測(cè)得到了7個(gè)門，12個(gè)綱，18個(gè)目，23個(gè)科，32個(gè)屬的4 280個(gè)OTU。土壤微生物組數(shù)據(jù)集已保存在NCBI中，登錄號(hào)為PRJNA777296。

門水平上，變形菌門和未分類k__norank_d__Bacteria細(xì)菌的相對(duì)豐度占固氮菌群落的99%。屬水平上，慢生根瘤菌屬和未分類變形菌的相對(duì)豐度占固氮菌比例最大，分別占50.6%～69.0%和13.0%～24.5%，其次是未分類細(xì)菌屬(7.4%～10.1%)和地桿菌屬(0.8%～8.8%)(圖2)。慢生根瘤菌屬在所有處理中無(wú)顯著差異(P=0.639)。

注：NT5代表免耕0～5 cm深度;NT20代表免耕5～20 cm深度;CT5代表傳統(tǒng)耕作0～5 cm深度;CT20代表傳統(tǒng)耕作5～20 cm深度。下同。Note:NT5,no tillage at soil depths of 0～5 cm;NT20,no tillage at soil depths of 5～20 cm;CT5,conventional tillage at soil depths of 0～5 cm;CT20,conventional tillage at soil depths of 5～20 cm.The same is as below.圖1 固氮菌基因豐度對(duì)耕作和土壤深度的響應(yīng)Fig.1 Soil nifH gene abundance response to tillage and soil depth

圖2 耕作和土壤深度對(duì)土壤固氮菌屬水平上相對(duì)豐度的影響Fig.2 Effects of tillage and soil depth on relative abundance of soil diazotrophic community at genus level

2.2 免耕對(duì)土壤固氮菌群落多樣性的影響

Chao 1和Shannon指數(shù)用于了解固氮菌群落的多樣性[23]。本研究中，Chao 1和Shannon在所有處理中都沒(méi)有顯著差異(圖3)。Chao 1和Shannon指數(shù)也未受到耕作、土壤深度及其交互作用的影響(圖3)。采用PCA分析了所有樣品的組成分布，PC1軸和PC2軸分別可以解釋總方差的36.91%和12.96%(圖4)。免耕和傳統(tǒng)耕作對(duì)土壤固氮菌群落組成有顯著影響(r=0.429，P<0.001)。

圖3 土壤固氮菌群落多樣性指數(shù)對(duì)耕作和土壤深度的響應(yīng)Fig.3 Soil diazotrophic community diversity indices response to tillage and soil depth

圖4 土壤固氮菌群落組成的PCA分析Fig.4 Soil diazotrophic community composition indicated by principal co-ordinates analysis

2.3 土壤固氮菌群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

本研究顯示，所有土壤理化特征與nifH基因拷貝數(shù)、Chao 1和Shannon指數(shù)都沒(méi)有顯著相關(guān)性(圖5)，這一結(jié)果與先前的研究結(jié)果即耕作和土壤深度對(duì)nifH基因豐度、Chao 1和Shannon沒(méi)有顯著影響相吻合(圖3)。土壤容重與PC1顯著相關(guān)(圖5)，同時(shí)Mantel test檢驗(yàn)也表明，固氮菌群落與土壤容重顯著相關(guān)(表1)。因此，土壤性質(zhì)可能主要影響固氮菌群落的構(gòu)成。本試驗(yàn)的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了土壤容重對(duì)免耕系統(tǒng)中固氮菌群落的重要性。

表1 土壤固氮菌群落與土壤理化屬性Mantel test分析Table 1 Mantel test analysis between soil diazotrophic community and soil properties

注：SOC代表土壤有機(jī)碳;DOC代表可溶性碳;TN代表總氮;TP代表總磷;AP代表有效磷;TK代表全鉀;AK代表速效鉀；BD代表容重；顯著相關(guān)(**代表P<0.01;*代表P<0.05)。Note:SOC indicates soil organic carbon;DOC indicates dissolved organic carbon;TN indicates total nitragen;TP indicates total phosphorus;AP indicates available phosphorus;TK indicates total potassium;AK indicates available potassium;BD indicates bulk density.Significant correlations (** indicates P<0.01;* indicates P<0.05).圖5 土壤理化屬性與固氮菌群落的相關(guān)性Fig.5 Correlation between diazotrophic community and soil properties

3 討 論

土壤氮轉(zhuǎn)化過(guò)程需要很多功能微生物的參與，這些功能微生物對(duì)土壤氮素的轉(zhuǎn)化具有一定的調(diào)控作用。固氮菌將大氣中氮?dú)廪D(zhuǎn)化為生物可利用形態(tài)氮。植被種類、火燒、土壤氮含量和秸稈還田都會(huì)影響土壤固氮菌的組成[28-30]。免耕秸稈還田可以通過(guò)對(duì)土壤水分和溫度的影響來(lái)調(diào)控氮的固定，也可以提高一些作物的固氮率[31-32]，增加土壤中的nifH基因豐度[33]，并改變固氮菌的群落結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，免耕和傳統(tǒng)耕作對(duì)土壤固氮菌群落的組成有顯著影響(圖4)。Hsu和Buckley[15]在長(zhǎng)達(dá)30多年的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)研究表明，保護(hù)性耕作和秸稈還田共同影響土壤固氮菌群落變化。同時(shí)，Calderoli等[13]的研究表明，在粉質(zhì)土壤中，保護(hù)性耕作和土壤深度共同影響土壤固氮菌群落的組成，這也證明了本試驗(yàn)的結(jié)論，這可能是由于免耕加秸稈還田改變了不同土壤深度的固氮菌生活所需的底物分布狀況導(dǎo)致的。有研究表明，nifH基因群落的豐度和多樣性主要受某些土壤理化屬性驅(qū)動(dòng)[13,28]。土壤pH對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，而較低的pH不利于土壤固氮[8,16,31]。有研究表明，土壤氮含量影響固氮菌群落的結(jié)構(gòu)[34-36]。氮的有效性既可以具有刺激作用，也可以具有抑制作用[8,37]。土壤有機(jī)碳增加了土壤固氮菌群落的豐度、多樣性和活性，不穩(wěn)定碳含量的增加通常會(huì)加速氮的固定，這可能是因?yàn)榄h(huán)境中較多的可利用碳對(duì)固氮菌的生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用[38-40]，但也有研究證明沒(méi)有效果[41-42]。然而，在本研究中，土壤碳和氮對(duì)固氮菌群落沒(méi)有顯著影響，這可能是因?yàn)闁|北黑土具有較高的碳氮含量，導(dǎo)到碳并未成為固氮菌生存的限制因子。本研究中，土壤容重與PC1具有顯著相關(guān)性(圖5)。同時(shí)Mantel test檢驗(yàn)表明固氮菌群落與土壤容重呈顯著相關(guān)關(guān)系(表1)。土壤容重可以反映土壤的結(jié)構(gòu)以及透氣性、透水性和保水能力，在一定程度上影響了土壤微生物的群落組成[43-44]。前人研究表明，土壤微生物種群與土壤容重呈負(fù)線性關(guān)系[45]，這些結(jié)果也證實(shí)了本研究的發(fā)現(xiàn)，即土壤容重與微生物種群密切相關(guān)[46]。土壤容重顯著影響固氮菌群落可能是因?yàn)閚ifH群落占據(jù)的生態(tài)位是以水分和孔隙大小的波動(dòng)為特征的[13]。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了土壤容重對(duì)免耕系統(tǒng)中固氮菌群落的重要性。本試驗(yàn)針對(duì)土壤固氮菌群落的研究只限于nifH基因，今后可用宏基因組學(xué)的方法對(duì)整個(gè)固氮基因家族進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

本研究表明免耕和傳統(tǒng)耕作下土壤固氮菌在門水平上變形菌門的相對(duì)豐度最大。屬水平上慢生根瘤菌屬的相對(duì)豐度最大，其次是未分類細(xì)菌屬和地桿菌屬。耕作處理未對(duì)慢生根瘤菌屬產(chǎn)生顯著影響。耕作、土壤深度對(duì)nifH基因拷貝數(shù)、Chao 1和Shannon指數(shù)均無(wú)顯著影響，PCA分析表明免耕和傳統(tǒng)耕作對(duì)土壤固氮菌群落的組成有顯著影響。所有土壤理化特征與nifH基因拷貝數(shù)、Chao 1和Shannon指數(shù)均未達(dá)到顯著相關(guān)性，土壤容重與PC1呈顯著相關(guān)關(guān)系。Mantel test檢驗(yàn)表明固氮菌群落與土壤容重顯著相關(guān)。本研究表明保護(hù)性耕作通過(guò)影響土壤容重改變了土壤固氮菌的群落組成。