岑 鑫，陽亭亭，趙尊福，文永平，張煥容*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

沙門菌是一種無莢膜、無芽胞的革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓。迄今為止，全世界已發(fā)現(xiàn)2 600多種血清型。禽沙門菌病主要有雞傷寒、雞副傷寒、雞白痢等。沙門菌作為一種常見的食源性致病菌，可引起人和動(dòng)物急性胃腸炎、食物中毒、敗血癥等。沙門菌病的流行不僅阻礙了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對(duì)人類健康及公共衛(wèi)生安全也帶來嚴(yán)重威脅。應(yīng)用抗生素是防治沙門菌感染的主要手段之一，但抗生素的長期、廣泛和不合理使用，使沙門菌耐藥性日益增強(qiáng)，導(dǎo)致抗菌藥物的治療效果大大下降。尋找新型殺菌物質(zhì)替代抗生素，從而有效防治沙門菌病已成為研究熱點(diǎn)。

噬菌體是一種能夠特異性裂解細(xì)菌的病毒，具有嚴(yán)格的宿主特異性，能夠殺滅宿主細(xì)胞且不產(chǎn)生耐藥性，具有指數(shù)增殖、廣泛分布、研發(fā)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。沙門菌噬菌體不會(huì)對(duì)正常菌群產(chǎn)生影響，也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，屬于天然、安全的抑菌劑。近年來，噬菌體作為一種新型抗菌劑，在食源性病原菌感染防治、控制病原菌的傳播以及治療耐藥性細(xì)菌感染等方面都取得了巨大的進(jìn)展。在耐藥菌株不斷出現(xiàn)、新型抗菌制劑研發(fā)不能滿足耐藥菌控制需要的狀況下，噬菌體防治提供了一個(gè)新的方向。地球上約有10個(gè)噬菌體，豐富度極高，在一些生態(tài)系統(tǒng)中，噬菌體的數(shù)量大約超過細(xì)菌10倍。而目前分離研究的噬菌體遠(yuǎn)少于自然界存在的噬菌體，因此，噬菌體的研究仍存在許多未知領(lǐng)域。本研究分離鑒定禽源沙門菌噬菌體，并研究其生物學(xué)特性和基因組信息，以期為研制沙門菌特異性抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

20株沙門菌(2株卡斯特魯普和18株鼠傷寒沙門菌)，編號(hào)為1～20，由西南民族大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。從成都市某雞場(chǎng)采集污水樣品用于分離噬菌體。胰蛋白胨、酵母提取物、NaCL、瓊脂粉、SM緩沖液、PEG 8000、0.22 μm無菌一次性針頭式濾器、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司、透射電鏡(型號(hào)JEM-1400PLUS，日本電子JEOL)。

1.2 噬菌體的分離鑒定

1.2.1 噬菌體富集 將采集的污水1 000 mL混勻后靜置4 h，收集上層液體，加入CaCl至終濃度1 mol·L，7 000 ×離心15 min，取100 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，得到濾液。將上述100 mL濾液加入100 mL 2×LB液體培養(yǎng)基于500 mL 的滅菌錐形瓶中混合，同時(shí)加入1 mL對(duì)數(shù)生長期的宿主菌沙門菌(濃度1×10CFU·mL)，160 r·min、 37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。

培養(yǎng)液經(jīng)6 000 ×離心15 min，取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌得到濾液，分別加入100 μL處于對(duì)數(shù)生長期的20株指示菌(濃度1×10CFU·mL) 混勻，160 r·min、37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。此富集過程重復(fù)3次，得到疑含噬菌體的培養(yǎng)液。

1.2.2 雙層瓊脂平板法驗(yàn)證 取10 mL無菌EP管，吸取200 μL疑含噬菌體的培養(yǎng)液和100 μL指示菌(濃度1×10CFU·mL)，室溫孵育5 min， 加入6 mL的50 ℃左右的LB半固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1 g、酵母0.5 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂0.75 g， 以100 mL培養(yǎng)基為例)，充分混勻后迅速倒入LB固體平板中，待其凝固后形成雙層瓊脂平板，倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，觀察噬菌斑的形成情況。

1.2.3 噬菌體的純化 采用雙層瓊脂平板法純化初次分離的噬菌體。選取形狀規(guī)則、透亮、邊緣整齊的單個(gè)噬菌斑，用接種環(huán)挑取并浸泡于500 μL的SM緩沖液中，4 ℃過夜，次日取出10 μL浸出液適當(dāng)稀釋，采用雙層瓊脂平板法得到第一代純化后的噬菌體。重復(fù)以上方法進(jìn)行連續(xù)多次培養(yǎng)，待瓊脂板上的噬菌斑透亮，形態(tài)、大小一致，純化6代以上，得到純化的噬菌體。

1.3 噬菌體生物學(xué)特性研究

1.3.1 噬菌體裂解譜測(cè)定 以雙層平板噬斑法檢測(cè)噬菌體對(duì)20株不同血清型的禽源沙門菌的裂解情況。取10 mL無菌EP管，吸取200 μL噬菌體裂解液和100 μL宿主菌菌液(濃度1×10CFU·mL)，室溫孵育5 min，加入6 mL的50 ℃左右的LB半固體培養(yǎng)基，充分混勻后迅速倒入LB固體中，待其凝固后倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，觀察有無噬菌斑形成。

1.3.2 噬菌體效價(jià)測(cè)定 取純化后的噬菌體裂解液100 μL10倍連續(xù)稀釋，加入100 μL宿主菌菌液混合均勻，混合物接種雙層瓊脂平板后培養(yǎng)8 ～ 10 h，測(cè)定噬菌斑數(shù)量，根據(jù)公式計(jì)算噬菌體效價(jià)。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。噬菌體效價(jià)(PFU·mL)=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.3.3 噬菌體透射電鏡觀察 取噬菌體懸液10 μL (1×10PFU·mL)滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min， 立即用濾紙吸干，用2 %磷鎢酸溶液染色5 min， 濾紙吸去染液，待其自然干燥后，置于透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.4 噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測(cè)定 取裝有130 μL噬菌體裂解液(1×10PFU·mL)EP管分別于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中作用30和60 min，水浴結(jié)束后，立即將EP管冰浴冷卻至室溫，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，采用雙層瓊脂平板法，測(cè)定噬菌體效價(jià)，評(píng)價(jià)噬菌體對(duì)溫度的耐受性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

用鹽酸(1 mol·L)和氫氧化鈉溶液(1 mol·L) 調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，然后分別吸取100 μL 噬菌體裂解液(約10PFU·mL)加入900 μL不同pH的LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫水浴鍋中作用1 h。作用完畢，將混合液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，評(píng)價(jià)噬菌體的pH穩(wěn)定性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(約1×10CFU·mL)，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度，重復(fù)3次取其平均值。將噬菌體裂解液和菌液，按感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000的比例混合，混合液置160 r·min、37 ℃搖床培養(yǎng)6 h。用0.22 μm的濾器過濾除菌后得到噬菌體，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。以噬菌體效價(jià)最高的比例為最佳感染復(fù)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 一步生長曲線測(cè)定 按最佳MOI 0.000 1，加入500 μL的菌液和500 μL的噬菌體裂解液，混勻后，在37 ℃條件下，靜置孵育15 min，6 800 ×離心5 min，棄上清，用LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次；6 800×離心5 min，棄上清，加入5 mL 37 ℃預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，37 ℃恒溫?fù)u床160 r·min振蕩培養(yǎng)；從0～100 min每間隔5～10 min取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次取平均值。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線；計(jì)算出噬菌體的潛伏期、暴發(fā)期和裂解量，裂解量=暴發(fā)末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度。

1.4 噬菌體分離株生物信息學(xué)分析

1.4.1 噬菌體增殖培養(yǎng)、濃縮及基因組提取 按最佳MOI加入4 mL沙門菌菌液和10 mL噬菌體裂解液，于400 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)18 h。增殖培養(yǎng)后將培養(yǎng)液于4 ℃、6 800 ×的條件下離心20 min，取上清；加入 NaCl使其終濃度為1 mol·L，待其溶解后冰浴1 h，使噬菌體顆粒和細(xì)菌碎片分離；培養(yǎng)物在4 ℃、 6 800×的條件下離心20 min，將上清液移至滅菌的錐形瓶中，按10%的比例加入PEG 8000，上下顛倒使其充分溶解，注意動(dòng)作輕緩，過夜冰浴使噬菌體顆粒充分形成沉淀；次日，將培養(yǎng)物在10 000×、 4 ℃條件下離心10 min回收噬菌體顆粒，棄上清后，將離心管倒置流干多余液體，加入2 mL SM緩沖液重懸沉淀；噬菌體液經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后，按1∶1的比例加入2 mL氯仿緩慢震蕩1 min， 在蛋白質(zhì)與氯仿充分作用后在4 ℃、960 ×條件下離心15 min，此步驟重復(fù)操作2～3次，除去噬菌體裂解液中的蛋白質(zhì)，最后得到噬菌體濃縮液，用于噬菌體基因組的提取。用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體基因組，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取基因組純度，且用于測(cè)序的基因組含量≥2 μg。

1.4.2 全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析 委托賽默百合生物科技有限公司對(duì)提取的噬菌體基因組進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行拼接，得到完整的基因組序列。應(yīng)用EditSeq對(duì)全基因組組分分析；采用tRNAscan-SE 預(yù)測(cè)全基因組中的tRNA； 使用ORF finder預(yù)測(cè)噬菌體的ORF，用Smart Blast對(duì)預(yù)測(cè)的ORF進(jìn)行驗(yàn)證并注釋，進(jìn)行堿基序列相似性比對(duì)及編碼基因的注釋。最后將基因組上傳至 NCBI獲得序列號(hào)。選擇噬菌體全基因組序列中的末端大亞基酶基因序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，和其他同源性較高噬菌體的末端大亞基酶核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，選取親緣性較近的9個(gè)沙門噬菌體的內(nèi)溶素基因序列，在移除終止密碼子后，使用ClustalW進(jìn)行比對(duì)；比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Datamonkey，根據(jù)官網(wǎng)推薦選擇FEL方法，在分支選擇時(shí)選擇所有，最后計(jì)算每個(gè)密碼子的KaKs均值，檢測(cè)選擇位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性

2.1.1 噬菌體分離純化結(jié)果 采用雙層瓊脂平板法，以20株沙門菌為指示菌，從污水樣本中分離出1株噬菌體。純化6代后,在雙層瓊脂平板上形成形狀規(guī)則、邊緣整齊、大小相近的透明噬菌斑，直徑約為1.5 mm(圖1)，將分離得到的噬菌體命名為S5。

圖1 噬菌體S5噬菌斑Fig.1 Plaque of phage S5

2.1.2 噬菌體裂解譜 噬菌體S5可成功裂解20株沙門菌中的15株，包含2株卡斯特魯普和13株鼠傷寒沙門菌。表明噬菌體S5能裂解兩種不同血清型的沙門菌，裂解率達(dá)到75%(15/20)，其裂解譜較廣，屬于寬裂解譜噬菌體。

2.1.3 噬菌體效價(jià) 噬菌體S5純化6代后，將噬菌體裂解液10倍連續(xù)稀釋，通過雙層瓊脂平板法測(cè)得噬菌體S5效價(jià)為8×10PFU·mL。

2.1.4 噬菌體透射電鏡觀察結(jié)果 噬菌體負(fù)染后透射電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示，噬菌體S5頭部呈正二十面體對(duì)稱，直徑為50 nm，具有一長度為200 nm的尾部。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)分類規(guī)則，該噬菌體屬于有尾噬菌體目、長尾噬菌體科的成員。

圖2 噬菌體S5透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron micrograph of phage S5

2.1.5 噬菌體熱穩(wěn)定性 溫度對(duì)噬菌體S5的影響結(jié)果如圖3所示，在30～60 ℃，噬菌體S5活性基本保持穩(wěn)定，具有較好的耐熱性。當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，噬菌體效價(jià)隨著溫度的升高而降低，作用的時(shí)間越長則效價(jià)越低；當(dāng)作用溫度高達(dá)70和80 ℃時(shí)，噬菌體失活。

圖3 噬菌體S5的熱穩(wěn)定性測(cè)定Fig.3 Determination of thermal stability of phage S5

2.1.6 噬菌體對(duì)酸堿的耐受性 噬菌體的活性隨不同的酸堿環(huán)境發(fā)生變化。由圖4可知，噬菌體S5經(jīng)不同pH作用1 h后，在pH 4.0～11.0時(shí)酸堿度對(duì)其活性影響不大，在pH 9.0～11.0時(shí)噬菌體活性達(dá)到最高，為最適pH；當(dāng)在pH 1.0～3.0和pH 13.0時(shí)，噬菌體活性完全喪失，結(jié)果顯示噬菌體S5對(duì)酸堿耐受性較好。

圖4 噬菌體S5的pH穩(wěn)定性測(cè)定Fig.4 Determination of pH stability of phage S5

2.1.7 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù) 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.000 1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，達(dá)到2.5×10PFU·mL。當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.000 1時(shí)，噬菌體S5感染宿主菌后噬菌體效價(jià)增殖倍數(shù)為4.16×10(噬菌體增殖倍數(shù)=增殖噬菌體數(shù)÷最初噬菌體數(shù))。因此噬菌體S5的最佳感染復(fù)數(shù)為0.000 1。

2.1.8 噬菌體一步生長曲線 按照MOI為0.000 1的比例繪制的一步生長曲線,如圖5所示。噬菌體感染宿主菌后5 min內(nèi)(潛伏期)效價(jià)基本保持不變；在感染宿主菌后5～100 min內(nèi)，噬菌體大量增殖，暴發(fā)期約為95 min，平均裂解量為50 PFU·cell。

圖5 噬菌體S5的一步生長曲線測(cè)定Fig.5 One-step growth curve determination of phage S5

2.2 噬菌體生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 提取的噬菌體基因組 提取的噬菌體基因組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)片段>5 000 bp(圖6所示)。

M. DL5000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.噬菌體DNAM. DL5000 marker; 1. Phage DNA圖6 噬菌體基因組電泳鑒定結(jié)果Fig.6 ElectropHoresis identification results of phage DNA

2.2.2 噬菌體全基因組生物信息學(xué)及編碼氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 經(jīng)全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，噬菌體S5基因組序列全長為72 519 bp。堿基分布為A(29.84%)、T(30.71%)、G(19.53%)、C(19.91%)，GC 平均含量為39.45%，核酸類型為線型dsDNA。將噬菌體全基因組核酸序列提交GenBank，獲取的登錄號(hào)為OM908766。根據(jù)BLASTn比對(duì)，與沙門菌噬菌體phage FSL SP-058(72 394 bp， KC139517.1)和沙門菌噬菌體phage FSL SP-076(72 098 bp，KC139520.1)相似性較高，分別為95.88%、95.93%，覆蓋率均為93%。Blastn結(jié)果顯示，該噬菌體為有尾噬菌體目、長尾噬菌體科。用tRNAscan-SE在線軟件預(yù)測(cè)tRNA，發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組上含有9個(gè)編碼tRNA的序列，分別轉(zhuǎn)運(yùn)Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Ser(絲氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Met(蛋氨酸)、Ser(絲氨酸)、Tyr(酪氨酸)、轉(zhuǎn)運(yùn)Pro(脯氨酸)。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)如圖7所示。噬菌體基因組中的tRNA能彌補(bǔ)宿主菌中缺少的tRNA，使得噬菌體可以提高翻譯裂解酶等蛋白質(zhì)的效率。有研究表明，裂解性噬菌體比溫和性噬菌體含有更多的tRNA，tRNA越多噬菌體的裂解性越強(qiáng)。因此，噬菌體S5是一株烈性噬菌體。

A.編號(hào)1預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；B.編號(hào)2預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；C.編號(hào)3預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；D.編號(hào)4預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；E.編號(hào)5預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；F.編號(hào)6預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；G.編號(hào)7預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；H.編號(hào)8預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)；I.編號(hào)9預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)A. Predicted Id1 tRNA structure; B. Predicted Id2 tRNA structure; C. Predicted Id3 tRNA structure; D. Predicted Id4 tRNA structure; E. Predicted Id5 tRNA structure; F. Predicted Id6 tRNA structure; G. Predicted Id7 tRNA structure; H. Predicted Id8 tRNA structure; I. Predicted Id9 tRNA structure圖7 噬菌體S5基因組中預(yù)測(cè)的tRNA結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of the predicted tRNA in the phage S5 genome

2.2.3 預(yù)測(cè)的噬菌體基因組ORF及其功能注釋結(jié)果 將噬菌體S5基因組預(yù)測(cè)的ORF在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)ORF的起始位置、片段具體長度和功能(詳見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容)。根據(jù)基因組序列共預(yù)測(cè)出109個(gè)ORF，最長的ORF編碼10 788 aa，最短的ORF編碼79 aa。根據(jù)其功能注釋可將其分為5個(gè)模塊：裂解模塊、DNA包裝模塊、結(jié)構(gòu)組成模塊、假定蛋白模塊和核酸復(fù)制與調(diào)控模塊。DNA包裝模塊主要包括protease(ORF23)，噬菌體結(jié)構(gòu)組成模塊主要包括tailspike protein(ORF20、ORF21)、major coasid protein(ORF33)、domain-containing protein(ORF48)，這些蛋白組成了噬菌體的頭部、頸部和尾部，尾部纖維蛋白有助于噬菌體吸附宿主菌，尾部附著催化劑還能在細(xì)胞壁上形成空洞，把遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞內(nèi)。核酸代謝與復(fù)制模塊包括virion RNA polymerase(ORF39)、single-standed DNA binding protein(ORF46)、AAA family ATPase(ORF47)、putative flavin-dependent thymidylate synthase(ORF51)、ATP-dependent DNA helicase dda(ORF56)、Serine/threonine-protein phosphatase(ORF59)、Deoxyuridine 5′-triphosphate nucleotidohydrolase(ORF73)等。與噬菌體裂解功能相關(guān)的基因有l(wèi)ysis protein(ORF26)、endolysin(ORF27)等。其中,內(nèi)溶素(endolysin)是噬菌體編碼的一類能夠裂解細(xì)菌的細(xì)胞壁水解酶，在噬菌體感染細(xì)菌的后期發(fā)揮重要作用，它能從細(xì)菌內(nèi)部迅速裂解細(xì)菌細(xì)胞壁，幫助子代噬菌體釋放到胞外。內(nèi)溶素具有快速和獨(dú)特的作用方式、殺滅病原體的高度特異性、細(xì)菌耐藥性發(fā)展的低概率和蛋白質(zhì)性質(zhì)。其中,還有85個(gè)假定蛋白未知其功能，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)，其可視化基因組注釋圖譜如圖8所示。

圖8 噬菌體S5基因組注釋圖譜Fig.8 Genome annotation map of phage S5

2.2.4 噬菌體S5的同源性分析結(jié)果 選取噬菌體裂解蛋白的末端大亞基酶(terminase large subunit)基因序列，和其他同源性較高的噬菌體的末端大亞基酶序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，找出親緣性較近的噬菌體。結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出，噬菌體S5與phage FSL SP-076親緣關(guān)系最近，且在同一分支上，可能是因?yàn)槠渌拗骶嗤叶紝儆形彩删w目、長尾噬菌體科。

圖9 噬菌體S5進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of phage S5

2.2.5 噬菌體S5內(nèi)溶素基因的選擇壓力分析結(jié)果 利用NCBI選取與噬菌體S5親緣性較近的9株沙門菌噬菌體，將Endolysin基因序列移除終止密碼子以后，使用ClustalW進(jìn)行比對(duì)；比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Datamonkey，根據(jù)官網(wǎng)推薦選擇FEL方法，選擇所有分支，最后計(jì)算出每個(gè)密碼子的KaKs均值。

將噬菌體S5的內(nèi)溶素基因的序列經(jīng)Datamonkey檢測(cè)分析可知，沒有正向選擇位點(diǎn)和中性選擇點(diǎn)數(shù)，計(jì)算出輸入序列的240個(gè)密碼子的KaKs值，根據(jù)≤0.1過濾，得到62個(gè)氨基酸位點(diǎn)。所有位點(diǎn)都受到負(fù)選擇壓力，其結(jié)果表明，內(nèi)溶素(endolysin)是噬菌體編碼的一類能夠裂解細(xì)菌的細(xì)胞壁水解酶，在噬菌體功能基因中非常重要，在感染細(xì)菌的后期發(fā)揮著重要作用，不會(huì)發(fā)生可能影響蛋白質(zhì)功能的非同義突變。

3 討 論

本研究分離的1株效價(jià)較高的寬裂解譜沙門菌烈性噬菌體S5，其溫度及酸堿耐受能力強(qiáng)于趙影等、Ahiwale等分離的沙門菌噬菌體。若作為噬菌體制劑，基本不會(huì)受胃酸的影響，也可以抵抗較高的環(huán)境溫度。噬菌體S5的最佳MOI為0.000 1，表明該噬菌體在較低濃度下就能起到高效的殺菌作用。MOI是研究噬菌體投入與產(chǎn)出量效關(guān)系的重要指標(biāo),較低的感染復(fù)數(shù)會(huì)降低應(yīng)用成本，利于噬菌體產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。噬菌體S5潛伏期約為5 min，表明噬菌體的復(fù)制效率高，裂解細(xì)菌的速度快。其暴發(fā)期約為95 min，平均裂解量為50 PFU·cell。與楊心怡等和王杰等分離出的噬菌體相比，S5潛伏期短，暴發(fā)期更長，裂解量大，能夠在較短時(shí)間內(nèi)殺死大量沙門菌，對(duì)沙門菌噬菌體的應(yīng)用有積極意義。

用于生物防治的烈性噬菌體必須遺傳背景清楚、殺菌能力強(qiáng)且不攜帶有害基因，否則可能造成有害基因在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)沙門菌噬菌體S5進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到109個(gè)ORF，其中ORF27為編碼內(nèi)溶素(endolysin)的基因，內(nèi)溶素是裂解酶的一種，噬菌體感染初期利用裂解酶降解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖從內(nèi)部裂解宿主菌。本研究分離鑒定的噬菌體S5基因組上含有9個(gè)編碼tRNA的序列，是一種強(qiáng)裂解性噬菌體。有研究表明，擁有tRNA基因的噬菌體，其宿主范圍較廣，而不是簡(jiǎn)單地感染一個(gè)特定的宿主，噬菌體S5能裂解卡斯特魯普和鼠傷寒兩種不同血清型的沙門菌也證實(shí)了這一結(jié)論。噬菌體S5未發(fā)現(xiàn)攜帶任何已知的溶源性相關(guān)基因，如編碼整合酶(integrase)或阻遏蛋白(repressors)等的基因，利用ResFinder預(yù)測(cè)噬菌體S5基因組中無抗生素抗性基因，利用ViruG lenceFinder預(yù)測(cè)噬菌體S5基因組中不存在毒力基因，該結(jié)果從遺傳背景上證實(shí)噬菌體S5應(yīng)用于菌體治療應(yīng)該是安全的。

4 結(jié) 論

分離鑒定了1株寬譜高效價(jià)的沙門菌烈性噬菌體，具有較寬的溫度以及酸堿耐受范圍、繁殖活性強(qiáng)的特性。全基因組序列測(cè)定結(jié)果表明，該噬菌體攜帶9個(gè)編碼tRNA的基因序列，且未發(fā)現(xiàn)攜帶任何編碼抗生素耐藥因子、細(xì)菌毒力因子等有害產(chǎn)物的基因，具有較高的應(yīng)用安全性，為進(jìn)一步開發(fā)沙門菌噬菌體制劑提供了科學(xué)依據(jù)。