肖 克，陳 婷，趙其平，朱順海，董 輝，劉曼玉，于 鈺，黃 兵，韓紅玉

(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室，上海 200241)

雞球蟲病是由幾種艾美耳球蟲寄生雞腸道引起的一種全球寄生蟲病，該病每年都會給世界各地的養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。雞感染球蟲后會呈現(xiàn)精神萎靡、被毛蓬亂、食欲不振、糞便帶血等癥狀，嚴重時會死亡。在幾種艾美耳球蟲中，柔嫩艾美耳球蟲()是最具致病性的蟲株之一。

目前，對球蟲病的控制主要依賴于藥物防治和使用強毒或減毒活卵囊疫苗進行免疫預防。長期以來，大規(guī)模使用抗球蟲藥物一直是一種高效的控制方法，然而，由于長期及不合理地使用抗球蟲藥物，球蟲幾乎對所使用過的抗球蟲藥物都產(chǎn)生了耐藥性，且對新藥產(chǎn)生耐藥性的時間縮短，耐藥性的程度日趨嚴重，并由單一的抗性變?yōu)閷Χ喾N藥物的交叉耐藥性。在美國等市場，隨著大眾對“永遠不使用抗生素”的食品需求的增長，離子載體類抗球蟲藥物使用進一步減少，這促使40%以上的生產(chǎn)者每年將疫苗接種納入一個或多個生產(chǎn)周期。球蟲活疫苗主要有強毒疫苗和弱毒疫苗兩種，強毒疫苗感染毒力較強，使用不當易導致雞群感染球蟲，嚴重時可能導致球蟲病的暴發(fā)，與強毒疫苗相比，弱毒疫苗由于采用一定方法使球蟲毒力顯著降低，提高了疫苗的安全性，但弱毒疫苗的研發(fā)需要花費更多的資金，同時弱毒疫苗的穩(wěn)定性和毒力返強也是需要解決的問題。球蟲活疫苗在蛋雞和種雞中應用較為廣泛，肉雞由于飼養(yǎng)周期較短，接種疫苗產(chǎn)生免疫力需要一定時間，且疫苗接種后短期內可能出現(xiàn)接種副反應對雞群生產(chǎn)性能產(chǎn)生較大影響，因此在肉雞生產(chǎn)中主要還是使用抗球蟲藥對該病進行防治?；谶@些原因研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的機制變得尤為重要，雖然各國學者對球蟲耐藥性產(chǎn)生原因進行了探索，但是耐藥性形成的分子機制至今不明。

對雞球蟲及其他頂復門原蟲的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)部分基因在耐藥株中的表達與敏感株相比存在明顯的差異。如Mok等對惡性瘧原蟲進行轉錄組分析， 發(fā)現(xiàn)與對青蒿素敏感的瘧原蟲相比，抗青蒿素瘧原蟲體內參與未折疊蛋白反應通路的兩個主要伴侶復合物——活性氧化應激復合體和T-復合蛋白1環(huán)復合體表達增加。在瘧原蟲受到青蒿素作用后，主要通過這些伴侶復合物的上調表達，以加速去除細胞質和內質網(wǎng)中毒性蛋白的積累或者恢復這些蛋白的正確折疊，從而減輕青蒿素對蟲體的損害，但其分子機制目前還不清楚。青蒿素抗雞的作用與微線蛋白 (microneme, MIC)有關。Doliwa等采用差異凝膠電泳(DIGE)結合質譜的方法來鑒定在弓形蟲磺胺嘧啶耐藥菌株中差異表達的蛋白，獲得68個差異表達蛋白，耐藥株中過表達蛋白為44%，敏感株中過表達蛋白為56%。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn),與敏感株相比，對磺胺嘧啶耐藥的弓形蟲體內棒狀體激酶家族蛋白(ROP2A)上調表達，烯醇化酶2(enolase 2)和膜骨架蛋白(IMC1)下調表達。Bhandari等通過對10株耐銻和4株敏感利什曼原蟲臨床分離株中的表面抗原-2(PSA-2)基因的表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)在臨床分離的耐藥株中，PSA-2基因表達顯著升高(1.5倍)。Chen等利用 cDNA 微陣列技術對柔嫩艾美耳球蟲莫能菌素耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株與敏感株的基因表達進行比較分析，發(fā)現(xiàn)莫能菌素耐藥株與敏感株相比有 318 個基因上調表達，57 個基因下調表達；馬杜拉霉素耐藥株有 133 個基因上調表達，408 個基因下調表達。

為深入研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的機制，本實驗室前期利用柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感株(DS)成功誘導出柔嫩艾美耳球蟲地克珠利耐藥株(DZR)和馬杜拉霉素耐藥株(MRR)，隨后對誘導的耐藥株和敏感株進行了轉錄組測序分析，結果發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白(HD domain-containing protein,HDCP)在耐藥株(DZR、MRR)中的mRNA轉錄水平顯著高于DS。HD結構域是一種保守結構域，該結構域包含一對組氨酸和天冬氨酸(HD)的保守殘基，它們的活性位點與金屬離子結合，主要執(zhí)行磷酸水解酶的活性。迄今為止，已經(jīng)鑒定出幾種HD結構域蛋白，包括環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(cNMPPDEs)、脫氧鳥苷三磷酸水解酶(dGTPase)、tRNA核苷酸轉移酶、dNTP三磷酸水解酶(dNTPase)、大腸桿菌 5′-脫氧核糖核苷酸酶YfbR和嚴緊反應四磷酸鳥苷(ppGpp)水解酶/合成酶(SpoT/RelA)；在真核生物和細菌古生菌中，研究發(fā)現(xiàn)一些含HD結構域的蛋白質可能參與了信號轉導、核苷酸代謝等。為了分析柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白的功能特性以及與藥物的關系，本研究克隆了柔嫩艾美耳球蟲HDCP、表達并純化了重組蛋白rHDCP，通過熒光定量PCR(qPCR)、Western blot、間接免疫熒光定位和體外抑制試驗對該基因的分子特性和功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞和質粒

1日齡三黃雞購自上海奉賢區(qū)某養(yǎng)殖場，嚴格控制飼養(yǎng)環(huán)境確保無球蟲存在。8周齡新西蘭大白兔購自上海甲干生物科技有限公司，6周齡BALB/c小鼠購自上海靈暢生物科技有限公司。雞胚成纖維細胞(DF-1)和原核表達載體pGEX-4T-2均由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病創(chuàng)新團隊保存提供。

1.2 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感蟲株為本實驗室保存的DS，該蟲株于20世紀80年代分離自上海市某雞場。DZR和MRR均由DS通過藥物誘導獲得，利用10日齡無球蟲雛雞對蟲株進行大量繁殖、收集孢子化卵囊于2.5%的重鉻酸鉀中保存。

在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)1日齡三黃雞1周，經(jīng)檢查確定雛雞未被球蟲感染后，口服接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×10個·羽，7 d后從盲腸中收集未孢子化卵囊(unsporulated oocysts，UO)并進行純化，孢子化卵囊(sporulated oocysts，SO)可通過UO體外氧化獲得。純化后的SO利用玻璃珠通過渦旋振蕩進行體外脫囊，用膽汁和胰蛋白酶配制消化液消化孢子囊使子孢子(sporozoites，SZ)逸出，隨后對SZ進行純化和收集。第二代裂殖子(second generation merozoites，SM)在雞接種SO后112 h可從其盲腸黏膜中收集純化獲得。

1.3 試劑

RNase-free DNase I、Trizol、2×Taq PCR Master Mix、SYBR green Ⅰ熒光染料(TaKaRa)；DNA膠回收試劑盒、DL2000(DNA Marker)、質粒小提試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(天根)；RNA Easy Mini Kit、QIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN)；pGEM-T-Easy Vector、T4 DNA連接酶(Promega)；M-MLV反轉錄試劑盒(Invitrogen)；限制性核酸內切酶：HⅠ和Ⅰ(美國NEB)；VybrantTM CFDA SE Cell Tracer Kit(Invitrogen)。

1.4 cDNA模板的制備和基因克隆

取適量實驗室保存的柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊，根據(jù)Trizol說明書上的步驟提取卵囊總RNA，隨后對總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。經(jīng)檢測符合要求后，將提取的總RNA按照M-MLV Reverse Transcriptase說明書步驟反轉錄為單鏈cDNA第一鏈。根據(jù)HDCP基因(GenBank登錄號：XM_013378851.1)的編碼區(qū)(462 bp)序列，用Primer5.0引物設計軟件進行特異性引物的設計，其中，上游引物：5′-GCATGAGCGGAGAAGAAAG-3(HⅠ)，下游引物：5′-GCTTAAAAACTTGAAAATTTGAA-3′(Ⅰ)。以cDNA為模板，用上述所設計的引物對其進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物膠回收后與pGEM-T-easy載體進行連接，并轉化至大腸桿菌()TOP10感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，于37 ℃培養(yǎng)13 h后挑取白色單菌落進行PCR鑒定，并送上海生工生物科技有限公司測序。

1.5 生物信息學分析

將測序結果與HDCP全長序列進行BLAST相似性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，使用ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具預測HDCP的相對分子質量和理論等電點。采用SignalP4.0(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TMHMM服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析HDCP基因編碼的蛋白有無信號肽和跨膜結構。隨后利用Motifscan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)對氨基酸序列含有的功能結構域進行分析。

1.6 重組蛋白的表達、純化和多克隆抗體的制備

從測序正確的菌液中提取重組質粒pGEM-HDCP，將pGEM-HDCP和原核表達載體pGEX-4T-2雙酶切后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，隨后回收目的片段進行連接。連接成功的重組表達質粒重命名為pGEX-4T-HDCP，經(jīng)PCR鑒定結合測序結果將確定正確的重組質粒后轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中。將含重組質粒pGEX-4T-HDCP的大腸桿菌菌液用1.0 mmol·LIPTG在37 ℃條件下于180 r·min的搖床中培養(yǎng)8 h進行蛋白的誘導表達，在加入IPTG后立即搖勻菌液并取出1 mL于4 ℃冰箱暫存作為0 h的對照。菌液培養(yǎng)結束取出1 mL誘導了8 h的菌液，用于分析蛋白的表達情況，剩下的菌液離心后用滅菌PBS重懸并在冰浴的條件下進行超聲(超聲功率設置為300 W，以“啟動5 s，停止3 s”的方式超聲30 min)，隨后通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達形式。在發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式表達后對其進行切膠純化，并通過SDS-PAGE鑒定其純度，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后置于-80 ℃條件下儲存?zhèn)溆?。將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑乳化后，首次免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠。并用純化后的重組蛋白和弗氏不完全佐劑對上述動物進行4次加強免疫。每只新西蘭大白兔每次免疫的蛋白劑量為200 μg，每只BALB/c小鼠每次免疫的蛋白劑量為50 μg。免疫結束后一周收集試驗所需的動物血清。

1.7 重組EtHDCP(rEtHDCP)蛋白的反應原性分析

取適量純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE并轉印至PVDF膜上，隨后置于5%脫脂奶粉中于4 ℃條件下過夜封閉。封閉結束后用PBS洗膜3次，隨后分別用兔抗子孢子全蛋白血清(1∶100稀釋)、抗GST標簽單克隆抗體(1∶5 000稀釋)以及健康兔血清(1∶100稀釋)作為一抗于37 ℃孵育2 h，用PBS洗膜3次，然后用HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)或HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse(1∶10 000稀釋)作為二抗在室溫條件下于脫色搖床上緩慢輕搖孵育45 min，用PBS洗膜3次后再用顯影液孵育2 min,于ChemiDocTouch Imaging System 成像系統(tǒng)中進行成像。兔抗子孢子全蛋白血清以及健康兔血清均由實驗室保存、提供。

1.8 利用實時熒光定量PCR檢測EtHDCP在DS四個不同發(fā)育階段中的轉錄水平

為研究基因HDCP在DS 4個不同發(fā)育階段的轉錄水平差異，分別提取處于4個不同階段(UO、SO、SZ、SM)的總RNA，然后去除基因組DNA，將蟲體總RNA反轉錄成cDNA后用DNA純化試劑盒對其進行純化，將得到的終產(chǎn)物作為qPCR的模板。上游引物：5′-GATCATTCTTTCGGAGTTGCATTTC-3′，下游引物：5′-CGTTCGTATTCTTCCCAGAGTTCGC-3′，擴增片段長度269 bp；用18S RNA作為內參，其上游引物：5′-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3′，下游引物：5′-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3′, 擴增片段長度207 bp。利用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒通過ABI 7500定量PCR儀對HDCP在蟲體四個不同發(fā)育階段的轉錄水平進行分析，每個反應重復3次，最終的試驗數(shù)據(jù)用2-ΔΔ的統(tǒng)計學方法進行計算以獲得相對mRNA的轉錄水平。

1.9 利用Western blot分析EtHDCP在DS 4個不同發(fā)育階段和不同蟲株的翻譯水平

取適量純化后的敏感株4個階段的蟲體(UO、SO、SZ、SM)于離心管中，加入RIPA強裂解液對蟲體進行裂解，同時加入少許蛋白酶抑制劑抑制裂解蟲體過程中釋放出來的蛋白酶，防止提取的蛋白被其降解，隨后加入與蟲體等體積的玻璃珠將離心管于渦旋振蕩器進行振蕩，按照振蕩2 min，冰浴30 s的方法間或振蕩60 min。之后于離心機中4 ℃條件下12 000 r·min離心10 min。上清即為提取的可溶全蛋白，取少量進行SDS-PAGE分析，檢測蛋白的質量，并用BCA試劑盒檢測濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣，使4個階段蟲體蛋白的含量一致，隨后進行轉膜、封閉，用兔抗HDCP多克隆抗體作為一抗進行孵育，并用鼠抗α-Tubulin作為內參，然后用相應抗性的二抗進行孵育。照膜后，用Image J軟件對條帶進行灰度分析。利用同樣方法處理不同耐藥株和敏感株孢子化卵囊，分析HDCP在敏感株和不同耐藥株SO階段的蛋白翻譯水平。

1.10 EtHDCP的間接免疫熒光定位

提前將細胞飛片置于6孔板中，并于每孔中接種1.8×10個DF-1細胞，隨后放入37 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日收集純化子孢子并以3∶1的比例接入細胞于41 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中進行孵育，在子孢子入侵DF-1細胞2、12、24、48、60、72和84 h后各取出一個細胞板，用4%細胞固定液室溫固定30 min，并用PBS洗滌數(shù)次。之后用1% Triton X-100 在室溫條件下進行通透30 min，PBS洗滌數(shù)次后，用2%胎牛血清白蛋白(BSA)4 ℃封閉過夜。兔抗rHDCP多克隆血清(1∶100稀釋)作為一抗37 ℃孵育2 h，隨后洗去一抗，加入FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶500稀釋)避光孵育1 h， 洗滌數(shù)次后用10 μg·mLDAPI室溫標記10 min， 洗滌數(shù)次后，用抗熒光淬滅劑封閉細胞飛片，并用熒光顯微鏡進行觀察。用相同的方式處理沒有入侵DF-1細胞的子孢子和裂殖子。

1.11 兔抗rEtHDCP多克隆抗體對子孢子入侵DF-1細胞的影響

試驗前1 d，24孔板的每孔中接種2.0×10個DF-1細胞，置于37 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。提取新鮮的子孢子用標記液(CFDASE細胞增殖與示蹤檢測試劑)進行標記15 min(CFDA SE是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，無毒性，不影響細胞活性)，隨后將其懸浮于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,用50、100、200、300、400 μg·mL的兔抗rHDCP多克隆抗體IgG37 ℃孵育2 h，用同樣濃度的健康兔IgG作為陰性對照，預留不用任何IgG孵育的標記蟲體入侵DF-1細胞作為空白對照(通過流式細胞儀可獲得未經(jīng)抗體作用的子孢子入侵率，抗體作用的子孢子入侵抑制率需要利用該數(shù)據(jù)進行計算)。孵育后的子孢子用含5%胎牛血清和3%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸并加入到細胞中于41 ℃、5%CO細胞培養(yǎng)箱中入侵8 h。最后使用流式細胞儀進行檢測并計算子孢子的入侵率[入侵抑制率=(1-抗體作用的子孢子入侵率/未經(jīng)抗體作用的子孢子入侵率)×100%]。

2 結 果

2.1 EtHDCP基因的克隆和生物信息學分析

以DS蟲株的cDNA第一鏈為模板，設計特異性引物對其進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳獲得與目標序列(462 bp)大小一致的擴增條帶。隨后將回收的目的條帶與克隆載體pGEM-T-easy進行連接構建重組質粒pGEM-T-HDCP，將其轉化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞并經(jīng)藍白斑篩選后送公司測序。序列經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)該序列編碼的氨基酸與已知柔嫩艾美耳球蟲HD結構域蛋白(HD-domain containing protein，GenBank：XM_013378851.1)的相似性為100%，與卡耶塔環(huán)孢子蟲()、布氏艾美耳球蟲()的HD結構域蛋白的相似性分別為61%和71%，據(jù)此推測該蛋白屬于HDc超家族。由上述比對結果可知該基因成功克隆，并將其命名為HDCP。對其進行生物信息學分析，結果顯示，該基因編碼153個氨基酸，分子量為17.3 ku，預測等電點為5.8，其編碼的蛋白無信號肽和跨膜結構域。蛋白質結構預測結果顯示該基因編碼的蛋白含有1個-糖基化位點，6個酪蛋白激酶II磷酸化位點，1個-肉豆蔻?；稽c，2個蛋白激酶C磷酸化位點，1個細胞附著序列和1個雙核定位信號(圖1)。

星號. 終止密碼子；單橫線. N-糖基化位點；綠色字體. 酪蛋白激酶II磷酸化位點；灰色陰影. N-肉豆蔻酰化位點；雙橫線. 蛋白激酶C磷酸化位點；紅色字體. 細胞附著序列；波浪線. 雙核定位信號Sterisk. Stop codon; Transverse line. N-glycosylation site; Green. Casein kinase II phosphorylation site; Gray. N-myristoylation site; Double-line. Protein kinase C phosphorylation site; Red. Cell attachment sequence; Wavy line. Bipartite nuclear localization signal圖1 EtHDCP基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatic analysis of EtHDCP cDNA and deduced amino acids

2.2 重組蛋白的表達和多克隆抗體的制備

將鑒定正確的重組表達質粒pGEX-4T-HDCP轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用IPTG進行誘導表達，通過SDS-PAGE對重組蛋白的表達情況進行分析，結果顯示成功誘導表達了重組蛋白rHDCP，并且該蛋白以包涵體的形式進行表達(圖2A、B)。隨后利用切膠的方式純化rHDCP，通過SDS-PAGE對純化后的蛋白進行檢測，結果表明通過該方式可獲得較純的rHDCP融合蛋白(圖2C)。

用純化后的rHDCP免疫動物并收集血清，隨后利用Protein A+G Agarose從兔抗血清中純化出多克隆抗體。并用SDS-PAGE對純化效果進行檢測(圖2D)，結果顯示純化出的多克隆抗體有大、小兩條主要條帶(分別為55和25 ku)，即為IgG的重鏈和輕鏈，說明IgG純化成功。

A. 重組蛋白的成功表達；B. 重組蛋白表達形式分析；C. 重組蛋白的純化；D. 多克隆抗體的制備; M. 蛋白質相對分子質量標準; 1. 純化后的 EtHDCP 重組蛋白; 2. 純化后的多克隆抗體A. Successful expression of recombinant protein; B. Analysis of expression forms of recombinant protein; C. The purification of recombinant protein; D. The preparation of polyclonal antibodies; M. Protein marker;1. Purified EtHDCP; 2. Purified polyclonal antibody圖2 EtHDCP重組蛋白的表達、純化以及多克隆抗體的制備Fig.2 The expression and purification of EtHDCP recombinant protein and preparation of polyclonal antibody

2.3 重組蛋白的反應原性分析

以健康兔血清、兔抗子孢子全蛋白血清以及GST標簽單克隆抗體為一抗對純化的rHDCP蛋白進行鑒定，結果顯示，以健康兔血清孵育的重組蛋白沒有條帶出現(xiàn)，而用兔抗子孢子全蛋白血清和GST標簽單克隆抗體孵育的重組蛋白在43 ku處均出現(xiàn)了條帶(圖3)，說明rHDCP反應原性良好。

M. 蛋白質相對分子質量標準；A. EtHDCP；1. 以陰性兔血清為一抗孵育；2. 以GST標簽單抗為一抗孵育；3. 以兔抗子孢子血清為一抗孵育M. Protein marker; A. EtHDCP; lane 1. Rabbit IgG as first antibody; lane 2. GST-tag monoclonal antibody as first antibody; lane 3. Anti-sporozoite polyclonal sera as first antibody圖3 重組蛋白抗體的反應原性分析Fig.3 Reactionogenicity of recombinant protein

2.4 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個不同發(fā)育階段的mRNA轉錄水平和翻譯水平

利用實時熒光定量PCR技術以基因18S rRNA為內參，對HDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株不同發(fā)育階段(UO、SO、SZ、SM)的轉錄水平進行分析。結果顯示該基因在SM階段的轉錄水平最高，而其他三個階段的轉錄水平都極低(圖4A)。

A. EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個發(fā)育階段的轉錄水平；B、C. EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個發(fā)育階段的翻譯水平[Western blot(M.蛋白質相對分子質量標準)及其灰度分析]。柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)A. Transcription levels of EtHDCP in four developmental stages of E.tenella； B, C. Translation levels of EtHDCP in four developmental stages of E. tenella， Western blot (M. Protein marker) and its gray scale analysis. Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05)圖4 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個發(fā)育階段的轉錄水平和翻譯水平Fig.4 Transcription and translation levels of EtHDCP in 4 developmental stages of E.tenella

通過Western blot對天然HDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個不同發(fā)育階段的蟲體全蛋白進行檢測，以鼠抗α-Tubulin作為試驗所用內參。天然HDCP蛋白大小在17 ku左右，結果顯示HDCP蛋白在SM階段的翻譯水平最高，而其在另外3個階段的表達量都很低(圖4B、C，其中,圖4C為圖4B的灰度值分析結果)，與qPCR結果一致。

2.5 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株和不同耐藥株中的翻譯水平

提取DS、DZR、MRR孢子化卵囊全蛋白進行SDS-PAGE電泳，隨后將其轉印至PVDF膜并用鼠抗rHDCP多克隆抗體血清(1∶100稀釋)作為一抗進行孵育，以稀釋后的IRDye 680RDanti-IgG作為二抗(1∶5 000稀釋)進行孵育，并用鼠抗α-Tubulin作為試驗所用內參。通過Image J軟件對Western blot結果進行灰度分析，發(fā)現(xiàn)HDCP蛋白與DS相比，在DZR、MRR中均為上調表達(圖5)。

*.P<0.05圖5 敏感株和耐藥株EtHDCP基因的蛋白翻譯水平 (Western blot及其灰度分析)Fig.5 Protein translation levels of EtHDCP gene in sensitive strain and drug-resistant strains (Western blot and its gray scale analysis)

2.6 EtHDCP蛋白在蟲體上的定位分析

依次用兔抗rHDCP多克隆抗體血清(1∶100稀釋)、FITC標記的山羊抗兔熒光二抗(1∶500稀釋)孵育封閉固定好的細胞爬片，并用DAPI核染色液(1∶500稀釋)進行標記，隨后用熒光顯微鏡觀察處理好的細胞爬片，分析HDCP蛋白在柔嫩艾美耳球蟲SZ、SM以及SZ體外入侵DF-1細胞后不同發(fā)育階段的定位情況(用健康兔血清作為陰性對照)。結果如圖6所示：該蛋白廣泛分布于SZ表面以及SM的表面和細胞質；當SZ入侵DF-1細胞2 h 后，蛋白也主要位于蟲體表面，隨著蟲體在細胞內進一步發(fā)育為滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、成熟裂殖體和第一代裂殖子(24、48、60、72和84 h)，熒光強度增強。表明蟲體入侵細胞后在細胞內生長發(fā)育的過程中HDCP的表達量升高。

A. 重懸于PBS的子孢子；B. 重懸于PBS的裂殖子；C. 子孢子入侵DF-1細胞2 h；D. 子孢子入侵DF-1細胞24 h發(fā)育為滋養(yǎng)體；E. 子孢子入侵DF-1細胞48 h發(fā)育為未成熟裂殖體；F. 子孢子入侵DF-1細胞60 h發(fā)育為未成熟裂殖體；G. 子孢子入侵DF-1細胞72 h發(fā)育為成熟裂殖體；H. 子孢子入侵DF-1細胞84 h發(fā)育為第一代裂殖子；I. 健康兔IgG孵育的子孢子A. Sporozoites (SZ) in PBS; B. Second generation merozoites (SM) in PBS; C. At 2 hpi, intracellular sporozoites (iSZ); D. At 24 hpi, trophozoites; E. At 48 hpi, immature Schizonts； F. At 60 hpi, immature schizonts; G. At 72 hpi, mature schizonts; H. At 84 hpi, first generation Merozoites；I. SZ incubated with healthy rabbit IgG圖6 間接免疫熒光試驗檢測EtHDCP在不同發(fā)育階段的分布Fig.6 Indirect immunofluorescence assay for detection of distribution of EtHDCP at different stages of development

2.7 抗rEtHDCP多克隆抗體對柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細胞的體外抑制試驗

結果顯示，隨著抗體濃度的增加，兔IgG對子孢子入侵DF-1細胞無明顯作用，其抑制率在0左右。而抗rHDCP多克隆抗體對子孢子入侵DF-1細胞有明顯的抑制作用，其抑制率隨著抗體濃度的增加而增加，在抗體濃度為400 μg·mL時可達到40%(圖7)。

*.P<0.05圖7 抗rEtHDCP多克隆抗體對子孢子侵入細胞的抑制試驗Fig.7 Inhibition of sporozoite invasion in vitro by anti-rEtHDCP

3 討 論

為了做好球蟲耐藥性的檢測和球蟲病的防治工作，使得深入了解球蟲耐藥性產(chǎn)生的機制變得尤為重要。為此，實驗室前期對DS、DZR、MRR進行了轉錄組測序分析，結果顯示，與DS相比，HDCP在耐藥株中上調表達[logRatio(DZR/DS)為5.98，logRatio(MRR/DS)為5.64]，該基因在耐藥株中的差異表達可能與其對抗球蟲藥產(chǎn)生耐藥有關。細胞抑制劑脫氧胞苷類似物阿糖胞苷(Ara-C)是一種可有效治療急性髓系白血病(AML)的化學療法抗癌藥物，Schneider等指出含有相同HD結構域的新型腫瘤抑制因子無菌α基序和含HD結構域的蛋白1(SAMHD1)能去除阿糖胞苷活性形式的磷酸鹽殘留物，從而將其逆轉成失活狀態(tài)；此外研究人員還發(fā)現(xiàn)，抑制SAMHD1能有效地增加阿糖胞苷抗性AML細胞對阿糖胞苷化療的敏感性。這提示HDCP可能與SAMHD1具有類似的功能，該基因在耐藥株中的高表達可能是藥物作用的結果。

本研究成功克隆了HDCP基因，通過對其生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，HDCP含有1個-糖基化位點，6個酪蛋白激酶II磷酸化位點，1個-肉豆蔻?；稽c，2個蛋白激酶C磷酸化位點，1個細胞附著序列和1個雙核定位信號。細胞膜表面蛋白的-糖基化參與調控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及免疫逃逸等功能。酪蛋白激酶Ⅱ(CKII)是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在體內通過對底物的磷酸化在細胞增殖分化和凋亡、信號的轉導等過程中發(fā)揮著重要作用。-肉豆蔻?；D移酶(NMT)是一種細胞溶質單體酶, 主要參與二級信號轉導、囊泡轉運、病毒成熟和腫瘤形成等一些重要的生物學過程。蛋白激酶C(PKC)是一種重要的信號轉導酶，起著將細胞表面配體-受體相互作用產(chǎn)生的信號傳遞到細胞核的作用；PKC 的激活將觸發(fā)其下游不同信號級聯(lián)反應，調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、轉化等功能。HDCP蛋白存在的糖基化位點、?；稽c以及磷酸化位點，提示著該蛋白通過翻譯后修飾發(fā)揮重要功能，可能在蟲體的增殖、對宿主細胞的入侵以及逃逸宿主的免疫等過程中發(fā)揮著重要的作用。

Western blot分析發(fā)現(xiàn)HDCP在兩個耐藥株中的蛋白翻譯水平均高于DS，與轉錄組測序的結果一致，這可能是HDCP參與球蟲抵抗外界的藥物壓力所造成的。據(jù)報道釀酒酵母中含有多個HD結構域蛋白，包括30,50-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶2(PDE2)、DNA損傷誘導氰化酰胺水合酶DDI2和DDI3，PDE2通過控制酵母細胞胞外cAMP的水平來保護細胞，DDI2或DDI3參與解毒和/或利用環(huán)境中有毒的腈化合物氰酰胺。有研究發(fā)現(xiàn)，在AML異種移植小鼠模型中，與缺乏SAMHD1功能的小鼠相比，Ara-C對SAMHD1功能良好的小鼠治療效果更好。此外，使用以SAMHD1為靶點的慢病毒蛋白X(Vpx)在原發(fā)性AML細胞中耗盡SAMHD1，增加了Ara-C的敏感性。結合本試驗結果，推測可能是由于蟲體內HDCP的高表達影響了相關水解反應的發(fā)生，加速了細胞內藥物的水解，從而提高球蟲對藥物的耐受力。

q-PCR和Western blot分析顯示，HDCP在第二代裂殖子階段高表達，而在其他發(fā)育階段表達量相對較低，熒光定位也顯示蟲體在細胞內的裂殖生殖發(fā)育階段熒光強度增強。裂殖生殖是在雞腸上皮細胞內完成發(fā)育的，裂殖子從裂殖體中釋放的過程會對腸上皮細胞造成損傷，釋放出來的裂殖子會進入新的腸上皮細胞再次進行裂殖生殖，如此周而復始可以進行多次裂殖生殖，導致腸上皮細胞受到嚴重破壞。因此作者推測HDCP在裂殖子階段的大量表達可能與其進行裂殖生殖和逃逸宿主免疫有關。有研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細胞中CKII存在轉錄和翻譯水平的增高，以及激酶活性的增加，與已報道的CKII促進細胞生長和抑制細胞凋亡的作用一致。由于HDCP蛋白含有CKII磷酸化位點，推測裂殖子可能通過CKII對高表達的HDCP蛋白進行底物磷酸化促進了其在宿主體內完成裂殖生殖過程。除此之外，HDCP蛋白中的-糖基化位點，蛋白激酶C磷酸化位點都與細胞增殖有關，它們可能通過蛋白的翻譯后修飾作用也參與了蟲體的裂殖生殖過程。有研究表明，-糖基化結構可以與凝集素結合，影響T細胞的激活、信號傳導和存活，如半乳糖凝集素能夠結合相關的-糖基化受體，通過影響T細胞的激活、信號傳導和存活從而實現(xiàn)腫瘤細胞的免疫逃逸。有學者發(fā)現(xiàn)程序性死亡配體1(PD-L1)在N35、N192、N200和N219位點發(fā)生-糖基化，這一代謝過程能夠通過拮抗糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)與PD-L1的結合，阻止PD-L1降解來提高自身穩(wěn)定性。由于HDCP蛋白中含有-糖基化位點，作者推測該蛋白可能通過-糖基化作用完成對宿主的免疫逃逸。

間接免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞質內，而且隨著蟲體在細胞內進一步發(fā)育為滋養(yǎng)體和裂殖體，熒光強度增強，表明蟲體入侵細胞后在細胞內生長發(fā)育的過程中HDCP的表達量升高，與q-PCR和Western blot試驗結果一致。經(jīng)Signal P和TMEMM預測發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽和跨膜區(qū)。Kopeckova等通過對致病細菌中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的多樣性定位和蛋白質結合能力進行研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH可在細菌表面或細菌細胞外檢測到，并與宿主蛋白相互作用，而GAPDH序列缺乏任何已知的胞外溶解轉運識別基序(如N端信號序列、六肽排序基序或C端疏水尾)，推測該蛋白定位于除細胞質外的其他部位是通過翻譯后修飾完成的。作者推測缺乏信號肽和跨膜區(qū)的HDCP可能也是通過翻譯后修飾的方式實現(xiàn)其在蟲體表面的定位。除此之外，Péroval等通過研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲熱休克蛋白90在子孢子表面、納蟲空泡以及蛋白復合物中均有檢測到，而該蛋白也沒有信號肽和跨膜區(qū)，該蛋白最初與宿主細胞相互作用產(chǎn)生了一連串的事件，從而幫助蟲體入侵宿主細胞，Hsp90可能在信號傳遞的級聯(lián)過程中發(fā)揮作用，允許其與頂端分泌蛋白結合并以異復合物的形式維持分泌。因此，作者推測HDCP也可能和Hsp90具有類似的機制，通過與其他分泌蛋白結合在入侵過程中完成自身的釋放，體外抑制試驗也證實HDCP參與了子孢子入侵宿主細胞的過程。然而HDCP的具體分泌機制尚不清楚，需要進一步研究。

通過體外抑制試驗發(fā)現(xiàn)抗rHDCP多克隆抗體可明顯抑制球蟲子孢子對DF-1細胞的入侵。姜連連等首次報道了柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1(AMA1)，熒光定位發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在子孢子的頂端和表面，體外抑制試驗顯示抗AMA1多克隆抗體處理過的子孢子對DF-1細胞的入侵率下降了70%，表明AMA1對球蟲入侵宿主細胞起重要的作用。于鈺等研究發(fā)現(xiàn)當子孢子入侵DF-1細胞后，柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(STP)位于子孢子的表面和帶蟲空泡膜(PV)上，且在耐藥株高表達，抗rSTP多克隆抗體能顯著降低子孢子入侵DF-1細胞。劉桂玲等通過對柔嫩艾美球蟲表面抗原10(SAG10)進行研究，發(fā)現(xiàn)兔抗rSAG10對子孢子入侵DF-1細胞的抑制率隨著抗體濃度的增加而增加，在抗體濃度為400 μg·mL時入侵抑制率可達60%。相比之下，兔IgG對入侵沒有明顯的抑制作用。因此作者推測抗rHDCP多克隆抗體可能與定位在蟲體表面的HDCP蛋白發(fā)生反應，破壞了該蛋白對蟲體的保護作用，從而抑制了其對宿主細胞的入侵。

4 結 論

克隆柔嫩艾美耳球蟲HDCP基因，表達獲得重組蛋白rHDCP并對其分子特性和基本功能進行了探究。HDCP定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞質內，并且在裂殖子階段高表達，其在耐藥株(DZR和MRR)中的表達水平顯著高于敏感株。此外，體外抑制試驗顯示抗rHDCP多克隆抗體可明顯抑制子孢子對宿主細胞的入侵。這些結果表明HDCP可能在蟲體的發(fā)育、耐藥性的產(chǎn)生以及其對宿主細胞的入侵過程中發(fā)揮了重要的作用。