李碧筠，黃思藝，王鈺錕，王 磊，何莉娜，唐 雪，徐德軍，趙中權

(西南大學動物科學技術學院，重慶 400715)

卵泡的生長發(fā)育離不開顆粒細胞的增殖和分化，而顆粒細胞的凋亡往往導致卵泡的閉鎖。轉化生長因子β(transforming growth factors-β，TGF-β)是一種多功能的多肽類生長因子，能夠調節(jié)細胞的增殖分化、凋亡、侵襲、遷移等過程，并參與了機體發(fā)育、免疫等生物學過程。SMAD蛋白位于TGF-β信號通路下游，在該通路傳導和轉錄調控的過程中發(fā)揮著重要作用，絕大多數(shù)的TGF-β家族成員均需要通過SMAD信號通路才能參與細胞內(nèi)的各種生理過程。SMAD7作為TGF-β和BMP信號通路的傳導拮抗因子，對TGF-β/SMAD信號通路具有抑制作用。最近的研究表明，SMAD7可能是卵泡發(fā)育的負反饋調節(jié)因子。Gao等確定了SMAD7在小鼠的顆粒細胞中表達，并在體外試驗中證明了SMAD7受到了來自細胞外的TGF家族成員TGF-β1、BMP4和GDF9的調控，并通過siRNA 干擾試驗證明了SMAD7是TGF-β1的負調控因子。孫玉英等在滋陰補陽的中西醫(yī)結合療法對鼠卵巢儲備功能下降的無排卵不孕大鼠模型試驗中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較正常組大鼠卵巢中的發(fā)育卵泡、成熟卵泡和黃體減少，閉鎖卵泡明顯增加，同時伴隨著SMAD2、SMAD3蛋白水平的降低和SMAD7蛋白水平的上升。

SMAD蛋白家族的其他成員也對細胞的增殖、凋亡、激素分泌存在著調控作用，各個SMAD蛋白介導不同TGF-β家族成員的信號傳導。有研究表明，2、3調節(jié)卵泡的發(fā)育進程。例如，Li等發(fā)現(xiàn)，敲除2、3基因會導致雌鼠的卵泡發(fā)育受阻并最終導致卵泡閉鎖，其生殖能力顯著下降。常迪等發(fā)現(xiàn)，2在綿羊的卵巢顆粒細胞中持續(xù)表達，并在成熟卵泡時期的表達水平最高。Nomura等發(fā)現(xiàn)，激活素可以通過2信號通路刺激顆粒細胞中19A1的表達，而抑制2下調19A1的表達，表明2可以通過調控19A1的表達影響雌激素分泌。此外，徐瑛蕾還發(fā)現(xiàn),3對小鼠顆粒細胞中191的表達有促進作用。這些證據(jù)都表明，SMAD信號通路可能參與了卵泡的發(fā)育和閉鎖過程。

在卵泡發(fā)育過程中，下丘腦、垂體分泌的促性腺激素、性腺類固醇激素和來自其他腺體以及卵巢內(nèi)部產(chǎn)生的其他激素和細胞因子都參與了卵泡的發(fā)育過程。卵巢中的類固醇激素主要包括雄激素、雌激素、孕酮，它們主要由顆粒細胞分泌。研究表明，敲除雌激素合成的關鍵酶基因19A1，小鼠卵泡發(fā)育會停止在早期小腔卵泡階段，而經(jīng)過外源性雌激素治療后，能夠恢復卵泡的正常發(fā)育。在排卵前卵泡中的孕酮一直維持在一個較低的水平，直到功能黃體生成后顆粒細胞才開始大量合成孕酮以維持外周血中的孕酮濃度，進而維持雌性哺乳動物的妊娠狀態(tài)。此外，高水平的孕酮會抑制原始卵泡的募集，抑制顆粒細胞生成雌二醇，進而影響卵泡的后續(xù)發(fā)育過程。盡管以往的證據(jù)表明，7的表達水平與卵泡發(fā)育、閉鎖有關，但其具體的作用機制仍不清楚，有待進一步的研究。本試驗探究7對顆粒細胞增殖、凋亡、類固醇激素分泌及SMAD信號通路的影響，為揭示卵泡發(fā)育、閉鎖調控機制提供試驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DME/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰酶、CCK-8 試劑盒、蛋白預染marker、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE蛋白制膠試劑盒購自重慶葆光生物技術有限公司，細胞裂解液購自Solarbio公司，LipoHigh脂質體高效轉染試劑、RNAiso、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenPremix Ex TaqII購自TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自生工生物工程股份有限公司， SMAD7 Rabbit pAb、SMAD2 Rabbit pAb、SMAD3 Rabbit pAb、SMAD4 Rabbit pAb、P-SMAD2 Rabbit pAb、P-SMAD3 Rabbit pAb、BAX Rabbit pAb、2 Rabbit pAb、PCNA Rabbit pAb購自重慶卡爾波生物技術有限公司。

1.2 試驗動物和細胞培養(yǎng)

試驗動物選用西南大學動物科學技術學院試驗羊場3～4月齡健康大足黑山羊，所有試驗均得到西南大學動物實驗倫理委員會批準。待山羊屠宰后，將卵巢取出用75%的酒精噴洗，再用無菌的PBS緩沖液沖洗3遍，放入37 ℃無菌生理鹽水中，迅速帶回試驗室進行后續(xù)試驗操作。山羊卵泡顆粒細胞的培養(yǎng)參照Zhao等的報道。

1.3 質粒載體擴增與siRNA合成

SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質粒載體(圖1)構建委托南京金斯瑞公司合成，對照組為空白載體。7的干擾RNA委托重慶銳博生物有限公司和上海生工合成，干擾RNA的序列(表1)。利用qRT-PCR檢測siRNA干擾效率，選擇siRNA-SMAD7作為后續(xù)試驗材料。按照制造商說明向感受態(tài)大腸桿菌中加入 SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質粒載體，將已轉化的感受態(tài)大腸桿菌滴加在含有相應抗生素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，放入37 ℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)的轉化大腸桿菌的單菌落數(shù)，置于離心管中后放入搖床搖菌。取100 mL培養(yǎng)好的菌液吸凈上清液，向菌體沉淀中分別加入Buffer MP1、Buffer MP2、Buffer MP3然后離心。將上清液多次純化，加入異丙醇后離心留沉淀。用70%的乙醇清洗質粒DNA，離心后室溫干燥質粒DNA。用適量的ddHO溶解質粒DNA，然后在儀器上測定其OD值是否符合標準。

圖1 SMAD7過表達載體結構Fig.1 The structure of overexpression vector of SMAD7

表1 siRNA序列

1.4 質粒與siRNA轉染

利用LipoHigh脂質體高效轉染試劑分別將NC質粒、Smad7過表達質粒、siRNA-SMAD7及siRNA-control轉染至山羊卵泡顆粒細胞，每組3個重復。按轉染試劑操作說明，取兩個1.5 mL離心管，分別加入125 μL DME/F-12培養(yǎng)液，然后于其中一管加入100 pmol siRNA或4 μg質粒吹打混勻；另一管加入10 μL高效轉染試劑吹打混勻，室溫靜置5 min后，將含有siRNA或質粒的培養(yǎng)液加入含高效轉染試劑的培養(yǎng)液中吹打混勻，室溫靜置20 min。 將制備好的轉染溶液加至六孔板，并用純DME/F-12加至每孔2 mL，于37 ℃，5% CO中培養(yǎng)，6 h后更換為含胎牛血清的培養(yǎng)液。轉染24～48 h后觀察結果或收取細胞進行后續(xù)試驗。

1.5 CCK8及流式細胞術

將細胞接種于96孔板并轉染，向每孔加入10 μL CCK8溶液。將96孔板置于培養(yǎng)箱孵育24、36、48、72 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD值)。用胰酶消化收集轉染后的山羊卵巢顆粒細胞，將用PBS重懸的細胞液離心并再次重懸，加入5 mL預冷的70%乙醇于4 ℃固定過夜。再次離心重懸后加入5 μL RNaseA(10 mg·mL)37 ℃消化1 h，加入50 mg·mL碘化丙啶37 ℃避光染色1 h，在流式細胞儀上進行分析。

1.6 實時熒光定量PCR

根據(jù)制造商的說明，使用RNAiso試劑(TaKaRa，中國)從顆粒細胞中提取總RNA。使用Nanodrop1000分光光度計(中國)測定RNA濃度和純度。研究中僅考慮吸光度比A/A為1.8～2.0的樣品。根據(jù)PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書的要求首先去除基因組DNA，之后進行反轉錄反應。所有基因序列均源自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，引物委托生工生物工程股份有限公司(上海)合成，合成引物及序列見表2。TB GreenPremix Ex TaqII熒光定量PCR的反應體系為10 μL：TB GreenPremix Ex TaqII 5 μL、Forward primer(10 μmol·L)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol·L)0.4 μL、cDNA0.5 μL、RNase Free HO 3.7 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)39次；63.5 ℃檢測信號，熔解曲線溫度根據(jù)引物不同設置為65～95 ℃，每0.5 ℃讀取一次Ct 值。

1.7 總蛋白提取和Western blot檢測

按照動物全蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech，上海)說明書提取顆粒細胞的總蛋白，提取的總蛋白按需求分裝后-80 ℃冷凍保存。采用BCA法測量蛋白的濃度，具體步驟參考改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒(Sangon Biotech，上海)說明書。將蛋白樣加入4 × SDS蛋白上樣緩沖液后，沸水浴10 min，迅速將蛋白樣放入冰盒或-80 ℃。經(jīng)過電泳、轉膜等操作，將PVDF膜放入裝有封閉液的培養(yǎng)皿中封閉2 h；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，過夜孵育對應的一抗；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h；TBST緩沖液洗3次，每次10 min，利用顯影液在照膠儀下觀察蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析

本試驗使用prism軟件進行統(tǒng)計分析，用獨立檢驗對兩組數(shù)據(jù)間的比較進行分析。每個選擇鑒定的基因、蛋白均進行3次生物學重復以及3次技術重復。數(shù)據(jù)結果采用“平均值±標準誤”表示，<0.05表示差異顯著，<001表示差異極顯著，>0.05表示差異不顯著。

表2 用于實時定量PCR的引物序列

2 結 果

2.1 siRNA干擾效率與SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP轉染結果

通過高效脂質體轉染試劑將7的siRNA轉染進顆粒細胞中，利用qRT-PCR對7的表達量進行測定，發(fā)現(xiàn)3條siRNA對7的干擾效率均低于70%(圖2A)。因此重新設計了3條7的siRNA進行試驗，發(fā)現(xiàn)新設計的siRNA1的干擾效率最高，且干擾效率大于70%，故選用siRNA1作為后續(xù)試驗所用的干擾RNA，將其命名為siRNA-SMAD7作為后續(xù)試驗材料(圖2B)。

通過高效脂質體將SMAD7-pcDNA3.1(+)-N-eGFP質粒載體轉染顆粒細胞，24～36 h后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞能發(fā)出綠色熒光，說明質粒載體成功轉染進了顆粒細胞(圖2C-E)，可以對其進行后續(xù)相關試驗。

A.3條不同的siRNA對山羊顆粒細胞中SMAD7的干擾效率；B.新設計的3條不同的siRNA對山羊顆粒細胞中SMAD7的干擾效率；C.明場圖像；D.熒光圖像；E.融合圖像A.The interference efficiency of 3 different siRNAs on SMAD7 in gGCs; B.The interference efficiency of 3 different siRNAs newly designed on SMAD7 in gGCs; C.The image of cells in the bright field; D. The fluorescent diagram of cells; E. Merge圖2 轉染結果圖Fig.2 Transfection result graph

2.2 SMAD7抑制山羊卵泡顆粒細胞增殖

利用CCK8法測定細胞增殖活力，結果顯示7過表達在24、36、48、72 h均顯著下調細胞增殖活力(<0.05, 圖3A)。通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示，7過表達顯著下調PCNA的相對表達量(<0.01,圖3B&C)。與對照組相比siRNA-SMAD7組細胞的增殖活力在24、36、48、72 h均顯著上升(<0.05,圖3D)。如圖2E&F所示，干擾7顯著促進了的mRNA和蛋白水平(<0.05)。這些結果表明7抑制卵巢顆粒細胞的增殖能力。

A.SMAD7過表達對山羊顆粒細胞增殖活力的影響；B&C.SMAD7過表達對增殖相關基因PCNA的影響；D.SMAD7干擾對山羊顆粒細胞增殖活力的影響；E&F.SMAD7干擾對增殖相關基因PCNA的影響A.The effect of SMAD7 overexpression on the proliferation of gGCs; B&C.The effect of SMAD7 overexpression on the proliferation-related gene PCNA; D.The effect of SMAD7 interference on the proliferation of gGCs; E&F. The effect of SMAD7 interference on the proliferation-related gene PCNA圖3 SMAD7對山羊顆粒細胞增殖的影響Fig.3 The effect of SMAD7 on the proliferation of gGCs

2.3 SMAD7促進山羊卵泡顆粒細胞凋亡

利用流式細胞術檢測7對顆粒細胞凋亡的影響，結果顯示7過表達顯著促進細胞凋亡(<0.01,圖4A&B)。通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示，7過表達顯著下調BCL2/BAX的比值(<0.01,圖4C&D)。與對照組相比siRNA-SMAD7對細胞凋亡水平?jīng)]有顯著的影響(>0.05,圖4E&F)。如圖4G&H所示， 干擾7顯著上調BCL2/BAX mRNA和蛋白質表達量比值(<0.05)。這些結果表明，7是顆粒細胞的促凋亡因子。

A&B.利用流式細胞儀檢測細胞凋亡在NC組和SMAD7過表達組間的差異；C&D.SMAD7過表達對細胞凋亡相關基因BCL2/BAX的在mRNA和蛋白水平相對表達量的影響；E&F.利用流式細胞術檢測細胞凋亡在siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間的差異；G&H.SMAD7干擾對細胞凋亡相關基因BCL2/BAX在mRNA和蛋白水平相對表達量的影響A&B. The difference of apoptosis detected by flow cytometry between NC group and SMAD7 overexpression group; C&D. The effect of SMAD7 overexpression on the relative expression of apoptosis-related genes BCL2/BAX at the mRNA and protein levels; E&F. The difference of apoptosis detected by flow cytometry between the siRNA-control group and the siRNA-SMAD7 group; G&H. The effect of SMAD7 interference overexpression on the relative expression of apoptosis-related genes BCL2/BAX at the mRNA and protein levels圖4 SMAD7對顆粒細胞凋亡及BCL2/BAX比值的影響Fig.4 Effects of SMAD7 on granulosa cell apoptosis and BCL2/BAX ratio

2.4 SMAD7對山羊卵泡顆粒細胞類固醇激素分泌的影響

利用ELLSA試劑盒測定顆粒細胞培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中類固醇激素水平。結果表明，7過表達極顯著上調孕酮(P4)的分泌水平，同時極顯著下調雌二醇(E2)的分泌水平(<0.01,圖5A)。而干擾7極顯著下調P4分泌，同時極顯著上調E2分泌(<0.01,圖5B)。這些結果說明7抑制顆粒細胞分泌E2，促進P4的分泌。

A.SMAD7過表達對P4/E2的影響；B.SMAD7干擾對P4/E2的影響A. The effect of SMAD7 overexpression on P4/E2; B. The effect of SMAD7 interference on P4/E2圖5 SMAD7對山羊顆粒細胞分泌類固醇激素的影響Fig.5 The effect of SMAD7 on the secretion of steroid hormones in gGCs

2.5 SMAD7對SMAD2、SMAD3和SMAD4表達的影響

qRT-PCR和Western blot檢測顯示，7過表達顯著上調7的表達量(<0.05)，顯著下調2、3的表達量(<0.05)，而4的表達量無明顯變化(>0.05,圖6A&B)。如圖6C&D所示，干擾7顯著上調2、3的表達量(<0.05)，4的表達量則無明顯變化(>0.05)。以上結果表明，7抑制2、3蛋白的表達而不影響4的表達。

3 討 論

盡管人類醫(yī)學的研究表明，7在調控細胞命運方面具有重要作用，但其在卵泡中的具體功能尚未闡明。本試驗探討了7對山羊卵泡顆粒細胞增殖凋亡的作用。結果發(fā)現(xiàn)，過表達7抑制卵泡顆粒細胞增殖、促進其凋亡，干擾7則會促進顆粒細胞增殖、抑制其凋亡。進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，7抑制細胞增殖相關基因的表達，促進凋亡基因的表達、抑制抗凋亡基因2的表達。這些發(fā)現(xiàn)與前人的報道類似，例如，Tang等發(fā)現(xiàn)，7抑制肺癌細胞增殖。Sobral等發(fā)現(xiàn)，過表達7通過27抑制環(huán)孢素(cyclosporine A, CsA)誘導成纖維細胞增殖。Lallemand等發(fā)現(xiàn)，7促進Mv1Lu細胞中TGF-β介導的細胞凋亡以及Mv1Lu與MDCK細胞中失巢凋亡和血清戒斷誘導的細胞凋亡。Yao等發(fā)現(xiàn)，過表達7通過抑制1表達中斷了TGF-β信號通路從而促進了豬卵泡顆粒細胞凋亡。這些證據(jù)表明，7通過控制卵泡顆粒細胞來影響卵泡閉鎖進程。

A.NC組和SMAD7過表達組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對表達量在mRNA水平的差異；B.NC組和SMAD7過表達組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對表達量在蛋白水平的差異；C.siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對表達量在mRNA水平的差異；D.siRNA-control組和siRNA-SMAD7組間SMAD2、SMAD3和SMAD4相對表達量在蛋白水平的差異A. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the mRNA level between the NC group and SMAD7 overexpression group; B. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the protein level between the NC group and SMAD7 overexpression group; C. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the mRNA level between the siRNA-control group and siRNA-SMAD7 group; D. The difference in the relative expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 at the protein level between the siRNA-control group and siRNA-SMAD7 group圖6 SMAD7對SMAD2、SMAD3和SMAD4表達的影響Fig.6 Effect of SMAD7 on SMAD2, SMAD3 and SMAD4 expression

本試驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著顆粒細胞的增殖和凋亡，TGFβ/SMAD信號通路中的關鍵傳導因子也發(fā)生變化，即7過表達后2、3的表達量降低，而4的表達量沒有明顯變化。利用siRNA干擾7后2、3的表達量上升，4的表達量亦是沒有明顯變化。這些結果與Kaczorowski等報道的2、3受到抑制時細胞凋亡率會上升，進而導致卵泡發(fā)育受阻和閉鎖的結果一致。這些結果提示，7可能是通過調控TGFβ/SMAD信號通路中2、3的表達來影響顆粒細胞的凋亡，這與其他研究者的研究報道相似。例如，Di等發(fā)現(xiàn)，通過抑制2、3途徑可以抑制真皮乳頭細胞的增殖；Nan等發(fā)現(xiàn),ALK-SMAD2/3途徑可以誘導牛乳腺上細胞的凋亡。哺乳動物的卵泡發(fā)育，由原始卵泡向優(yōu)勢卵泡轉化過程中，顆粒細胞分泌的E2水平會迅速上升、P4水平則會急速下降，這一現(xiàn)象在人、牛和豬上都有相似的表現(xiàn)。本試驗發(fā)現(xiàn)，7過表達促進P4分泌，抑制E2分泌。干擾7促進E2分泌并抑制P4分泌。這可能是因為7抑制了2、3的表達，進而影響下游類固醇合成相關基因的表達。Nagyova等發(fā)現(xiàn)，在卵丘細胞中通過抑制劑抑制2、3信號通路可導致FSH刺激的孕酮生成增加；Fang等發(fā)現(xiàn)，8可以通過AKL5-SMAD3軸調控孕酮的合成。前人的發(fā)現(xiàn)與本試驗的結果一致，這些證據(jù)表明，SMAD7可能是類固醇激素合成的調節(jié)因子，但是7是如何影響雌二醇和孕酮分泌的下游調控機制還有待進一步的研究。綜上所述，7通過抑制2、3的表達來抑制TGFβ/SMAD信號通路的傳導，從而影響顆粒細胞的功能。

4 結 論

7抑制山羊卵巢顆粒細胞的增殖，促進凋亡，并且調節(jié)類固醇激素的分泌，同時抑制SMAD2、SMAD3的蛋白表達，從而調控山羊卵泡的發(fā)育。