張 彌，涂聞君，張 奇，江 莎,2*

(1. 西南大學動物醫(yī)學院 動物健康與動物性食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，重慶400715；2.西南大學 醫(yī)學研究院免疫學研究中心，重慶402460)

雞FLHS是雞肝和腹腔內異位脂肪沉積過多，伴隨肝組織質脆和出血為特征的營養(yǎng)代謝性疾病，病雞在臨床上表現(xiàn)為突然發(fā)病、肝破裂、出血和突然死亡等特征。剖檢發(fā)現(xiàn)，約40%蛋雞死亡由FLHS造成，而在籠養(yǎng)蛋雞中，這個數(shù)據(jù)更高達74%，且97%FLHS病雞有大量脂肪堆積。因此，該病是籠養(yǎng)雞非感染性死亡的主要原因之一，給禽蛋業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。雞的肝組織在脂肪合成和代謝中起主要作用，肝組織中脂肪合成量遠大于脂肪組織，經(jīng)選育的商品雞飼料轉化率高，更易發(fā)生代謝紊亂。雞FLHS的發(fā)生原因、機理、病理癥狀與哺乳動物非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)類似，因此也常作為NAFLD研究的動物模型。本文從遺傳、營養(yǎng)、激素、環(huán)境、腸道微生物等方面闡述可能引起雞FLHS發(fā)生的原因，列舉和對比研究人員通過不同方法等構建的FLHS模型。盡管雞FLHS的病理機制尚不完全清楚，但可與NAFLD類似，如胰島素抵抗、肝氧化應激和炎癥反應等，被學者廣泛接受的NAFLD發(fā)病機制“多重打擊”學說可為解釋FLHS提供一定的參考，本文從FLHS的脂肪變性、胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應激、炎癥、纖維化、脂肪因子分泌異常和自噬抑制等多重方面綜述FLHS可能的發(fā)病機制，為進一步深入研究雞FLHS提供參考。

1 影響雞FLHS發(fā)生的因素

1.1 遺傳與表觀遺傳

不同品系的雞患FLHS的敏感程度存在差異。在蛋雞中，Abplanalp和Napolitano報道白來航蛋雞品系由于其肝組織中酶活性高，相比于同齡其他品系蛋雞，容易發(fā)生肝功能障礙而誘發(fā)FLHS；肉雞中，Zhang等報道京興黃雞比北京油雞更易形成脂肪肝，且脂肪肝可從父系遺傳給后代：第一代(F0)高脂飲食誘導FLHS，后代飼喂正常日糧，從F1代到F3代，表現(xiàn)出肝糖脂代謝關鍵基因上調，F(xiàn)LHS發(fā)病率是對照組的兩倍。

另一方面，表觀遺傳變化與遺傳風險因素相互作用決定疾病的易感性，肝特定DNA異常甲基化、miRNA和lncRNA都與脂質代謝和脂肪肝密切相關，為單純性脂肪變性到NAFLD過程中的重要決定因素之一，但很少有關于其在FLHS進程中的報道。FLHS雞的肝低甲基化特征已被確定，Liu等報道乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)啟動子的甲基化水平降低，可增加脂肪從頭合成(lipogenesis，DNL)，增加肝脂肪含量；微粒體三酰甘油轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTTP)啟動子的甲基化水平降低，促進MTTP表達而增加肝細胞的甘油三酯(triglyceride，TG)輸出。Li等發(fā)現(xiàn)，代謝相關的lncRNA(lncLTR)由雌激素調節(jié)且與母雞的血漿TG顯著相關。Tan等研究顯示，在高能日糧誘導FLHS雞的肝組織中，檢測觀察的83種與脂代謝和糖代謝相關的基因中有72%上調，而檢測觀察的150種免疫相關基因中有81%下調，并發(fā)現(xiàn)23個靶基因(如1、3和)是甲基化和lncRNAs調控的中心基因。同樣，Zhu等報道高能低蛋白日糧影響327(一種啟動子的表觀遺傳標記)的組蛋白修飾和染色質結構，導致雞肝脂質代謝、免疫應答和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)信號通路基因失調，使肝組織脂肪過度積累并誘發(fā)FLHS。然而還尚未有研究報道與肝纖維化的存在和程度相關的表觀修飾變化。這些結果強調了表觀遺傳修飾對基因表達的調控，并在FLHS發(fā)揮核心調節(jié)作用。因此，鑒定關鍵基因和表觀遺傳標記可擴大對FLHS分子機制的研究。

1.2 營養(yǎng)

FLHS病因與營養(yǎng)密切相關，日糧中能量過高，飽和脂肪酸過多，缺乏氨基酸、礦物質和維生素等是誘發(fā)FLHS常見因素。

能量過高是導致FLHS 發(fā)生的重要原因之一，因商品雞快速生長或高產(chǎn)蛋量需求，往往配比高能飼料；雞淋巴系統(tǒng)不夠完善，從腸道吸收的脂肪酸通過肝門靜脈系統(tǒng)直接轉運至肝，并且雞肝組織中脂肪合成速度遠勝于哺乳動物，超過90%的脂肪在肝內合成，因此，日糧中能量過高常誘導雞發(fā)生FLHS。為提高雞飼料的適口性和能量密度，飼料中的脂肪來源往往不同，而這也會影響FLHS的發(fā)生，不同脂肪酸對雞FLHS發(fā)生具有不同的影響。脂肪酸主要包括飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)。黃油、豬油等動物油是典型的SFA；油酸屬于MUFA，橄欖油、牛油果油和茶油中含有大量的油酸。PUFA分為n-3 PUFA和n-6 PUFA，α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)屬于n-3 PUFA，亞麻籽油中含有豐富的ALA，魚油中含有豐富的DHA；亞油酸(LA)屬于n-6 PUFA，大豆油、玉米油、葵花籽油、菜籽油等植物油含有豐富的亞油酸。飼料中添加MUFA和PUFA可減少氧化應激和炎癥表達、降低低密度脂蛋白膽固醇的濃度、提高胰島素敏感性，而添加SFA可增加肝脂肪含量，誘導胰島素抵抗。在代謝中n-6和n-3 PUFA互相競爭輔酶，飲食中大量n-6 PUFA代謝產(chǎn)生的花生四烯酸為炎癥介質，相反，n-3 PUFA 中的EPA和DHA則促進免疫細胞產(chǎn)生特異性促炎癥消退介質進而減少炎癥，并提高肉雞NK細胞活力和促進淋巴細胞增殖，n-6/n-3 PUFA比例的增加與肥胖和NAFLD有關，在蛋雞日糧中添加n-3 PUFA則可豐富腸道微生物群和促進脂質代謝。FLHS進程中，三種不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、棕櫚油酸)含量降低，其顯著減少導致過氧化和氧化應激的增強，而過氧化和氧化應激增強可導致載脂蛋白B(apolipoprotein B，Apo B)的水解，進而損害極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的分泌，導致脂肪肝并減少卵黃中脂質營養(yǎng)物的沉積，阻礙卵黃的發(fā)育和排卵。進一步研究表明，亞油酸缺乏會引起生殖障礙疾病和脂質代謝紊亂，F(xiàn)u等報道母體補充共軛亞油酸可減少雞胚肝中甾醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)的蛋白表達，通過激活腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)和PPARα信號通路降低雞胚肝的脂質合成。因此，F(xiàn)LHS雞的肝脂肪沉積和產(chǎn)蛋率下降可能與血清不飽和脂肪酸缺乏有關。

肝DNL背后的酶促反應和載脂蛋白的形成需要維生素和輔助因子的參與，如脂溶性維生素、膽堿、甲硫氨酸、磷脂、硒等。維生素E和膳食抗氧化混合劑可適度改善高氧化劑(3%氧化油、3%PUFA)日糧肉雞肝功能損傷和炎癥。膽堿、磷脂甜菜堿和葉酸作為甲基供體，飲食中缺乏這些物質可影響表觀遺傳修飾的穩(wěn)定性，增加雞FLHS的易感性；而日糧中補充膽堿則減少蛋雞肝總脂質和TG含量，提高抗氧化能力；母體補充甜菜堿使雄性幼雞免受皮質醇誘導的肝TG積累。甲硫氨酸和膽堿為磷脂酰膽堿的重要前體，磷脂酰膽堿是構成VLDL顆粒外殼的主要磷脂，甲硫氨酸/膽堿缺乏(methionine-choline deficiency，MCD)使VLDL合成受損、導致TG在肝細胞積累；因此，MCD也常用于誘導雞FLHS模型。磷脂是組成生物膜的主要成分，其不同營養(yǎng)制品廣泛應用于雞飼料，飲食中添加3%大豆磷脂能有效改善FLHS病雞相關肝和血液指標的異常變化。硒是禽類必需的微量元素，為谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的重要成分，缺乏可導致雞肝腫大、質脆和營養(yǎng)不良，Ren等研究表明，硒可提高GSH-Px活性，緩解砷誘導的肉雞肝脂肪變性和肝損傷。

氨基酸通過三羧酸循環(huán)提供能量，并形成脂類轉運所需的蛋白質，如Apo A和Apo B等載脂蛋白的形成需要多種氨基酸，與雞FLHS密切相關；Guo等研究發(fā)現(xiàn)，雞FLHS表現(xiàn)為血清絲氨酸含量增加和異亮氨酸、蘇氨酸含量減少的氨基酸代謝紊亂，Zhuang等報道FLHS雞肝組織丙氨酸、谷氨酰胺和苯丙酮酸等非必需氨基酸增加，而纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸等必需氨基酸減少，表明機體可能通過吸收氨基酸促進脂類轉運，而缺乏相關氨基酸導致雞FLHS。

日糧中鈣、磷和維生素D不足，可導致采食量增加、機體能量蓄積，并通過下丘腦抑制促性腺激素分泌，降低產(chǎn)蛋量，同時進一步導致肝脂肪的積累；及時補充鈣、磷或使用營養(yǎng)補充劑提高鈣、磷利用率等方法可緩解相關負面影響，并且補充維生素D還可增強雞抗氧化活性和抗炎作用。

1.3 環(huán)境

籠養(yǎng)限制了雞的活動，有數(shù)據(jù)顯示，在籠養(yǎng)蛋雞中，高達74%死亡雞因FLHS引起，而自由放養(yǎng)模式中僅5%左右。春、夏季有更高的FLHS發(fā)病率，可能與環(huán)境溫度有關。熱應激通過抑制電子傳遞鏈活性，增加電子泄露使肝中活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，進而誘導氧化應激破壞肝脂質代謝。Lu等報道慢性熱應激會增加肉雞肝TG和總膽固醇(total cholesterol，TC)含量，上調脂肪酸合成相關基因如、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，)、碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein，)和基因表達，激活肝核受體α(liver X receptor alpha，LXRα)途徑使肝脂肪合成增加。

1.4 激素

17β-雌二醇(E)是主要的循環(huán)雌激素，在蛋雞受光刺激后1～2 d增加，并在產(chǎn)蛋過程中保持較高濃度。E可促進肝合成大量游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)、TG和膽固醇酯，組裝成VLDL和卵黃原蛋白顆粒，通過血液循環(huán)輸送到卵巢產(chǎn)生蛋黃前體。添加外源E可顯著增加雞肝中TG、TC含量，同時上調脂肪酸和膽固醇合成相關基因，肌肉注射E可誘導雞FLHS模型。

慢性應激或長期暴露于高糖皮質激素(glucocorticoid，GC)可導致雞脂肪肝，日糧中添加皮質醇(cortisol，CORT)使肉雞血清葡萄糖、TG、TC和肝的相對重量、糖原含量增加，皮下注射CORT則通過激活脂肪合成、抑制線粒體脂肪酸β氧化導致雞脂肪肝，并且長期CORT暴露可進一步引發(fā)雞肝組織炎癥和纖維化；同樣，口服地塞米松(dexamethasone，DEX)抑制肉雞三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化、促進脂肪酸從頭合成導致糖脂代謝紊亂；注射DEX影響肉雞肝組織AMPK和膽汁酸合成信號通路。

骨鈣素(osteocalcin，OCN)由成骨細胞分泌，以非羧化形式(ucOCN)進入血液調節(jié)能量代謝。OCN可通過多條途徑影響肝的脂質代謝，即促進脂聯(lián)素和胰島素分泌、提高胰島素敏感性、激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)途徑、抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)或核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑。Xia等研究顯示，人類血清ucOCN水平與肝脂肪變性、炎癥和纖維化分級呈負相關，外源性補充ucOCN則能夠改善飼喂西方飲食小鼠的肝脂肪變性、降低SREBP-1及其下游的蛋白表達，表明OCN水平與NAFLD負相關；并且Zhang等近期證實，ucOCN通過GPRC6A受體保護小鼠免受高脂飲食誘導的NAFLD。然而，OCN對雞肝組織的影響研究甚少，僅Wu等報道了注射ucOCN可減輕蛋雞FLHS的胰島素抵抗、肝組織炎癥并可能激活肝組織自噬。另外，Jiang等研究顯示，高能飲食可誘導蛋雞脂肪肝、龍骨OCN濃度顯著降低、骨轉換上調導致骨骼損傷；因此，較低的OCN濃度也可能是骨質疏松和脂肪肝的聯(lián)系因素之一。

1.5 有毒有害物質

飼料添加劑使用不當或飼料加工、生產(chǎn)、運輸及存儲環(huán)節(jié)產(chǎn)生有毒有害物質，如致病菌、黃曲霉菌、農藥殘留、重金屬污染以及抗生素等易對肝造成損傷。致病菌如多殺性巴氏桿菌導致雞肝細胞炎癥等損害；肝為解毒器官，殘留的農藥使肝超負荷工作分解毒素，易引起肝纖維化等損害；同樣，抗生素等藥物不僅對腸道微生物群有影響，藥物中成分也會對肝產(chǎn)生一定的毒性作用，進而造成損傷。肝損傷導致肝功能下降，從而可能使雞易感FLHS。日糧中添加黃曲霉素B1導致肉雞肝脂肪變性，引起PPAR信號通路失調導致蛋雞肝脂肪沉積，并通過損傷線粒體結構和呼吸功能導致氧化應激、抑制抗氧化系統(tǒng)和細胞自噬、激活凋亡途徑并通過miRNA影響細胞周期和生長、上調NF-κB炎癥通路和炎癥小體組裝加劇肝毒性。環(huán)境中廣泛存在的重金屬鎘等為不可生物降解的污染物，Go等報道稱，低劑量鎘暴露引起脂肪酸代謝失調導致小鼠出現(xiàn)脂肪肝，并刺激JNK磷酸化；氯化鎘誘導增加了大鼠脂肪合成(SREBP1、SREBP2、FAS)基因和蛋白的表達，并提高血清和肝TG、TC水平導致肝脂質積累；同樣，低劑量鎘暴露上調蛋雞肝脂質合成()和脂蛋白合成()基因表達，高劑量鎘暴露產(chǎn)生ROS誘導氧化應激并引發(fā)肝損傷。

1.6 腸道微生物群：腸-肝軸

腸道屏障功能障礙、腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物的變化影響NAFLD發(fā)生和進展。高脂飲食導致菌群失調，腸道屏障破壞，進而促使細菌或其產(chǎn)物通過門靜脈轉移至肝，腸道微生物對肝脂質代謝的影響如下：1)微生物失調導致腸道乙醇產(chǎn)量增加，乙醇可通過破壞緊密連接破壞腸道通透性，并誘導TG在肝內蓄積及肝氧化應激；2)腸源性病原體相關分子模式如LPS可特異性地與肝Toll樣受體結合激活肝促炎癥途徑；3)腸道微生物增加膽堿的水解，進而導致膽堿缺乏，阻止VLDL分泌，導致TG在肝蓄積；4)過量的短鏈脂肪酸是肝糖異生和脂肪合成的底物，通過抑制AMPK活性促進肝FFA的積累。Li等報道，與未發(fā)生肝脂肪變性的蛋雞相比，脂肪肝蛋雞腸道中的條件致病菌和有害菌增多，有益菌減少，肝脂肪變性與細菌相對豐度有關。Hamid等用蛋雞做模型研究自然發(fā)病NAFLD(FLHS)時發(fā)現(xiàn)，腸道中厚壁菌門的豐度與肝纖維化程度相反，而擬桿菌門豐度則與肝纖維化正相關，表明盲腸菌群失調與纖維化和NAFLD(FLHS)嚴重程度有關。在飼養(yǎng)過程中，給雞添加益生菌可調節(jié)盲腸菌群，減少肝中的脂肪含量。Zhang等給肉雞飼喂含有雙歧桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、丁酸梭菌、瓜爾膠的復合益生菌發(fā)現(xiàn)，該膳食補充劑改變了盲腸微生物群的多樣性，改變了短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的含量，抑制了脂肪生成；體外試驗顯示，SCFAs(包括醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽)通過MAPK途徑上調腸上皮細胞上胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)的表達，而GLP-1通過AMPK/ACC信號傳導抑制原代肝細胞中的脂質積累。這些研究表明，與哺乳動物類似，雞也具有腸-肝軸，F(xiàn)LHS疾病發(fā)展與腸道微生物密切相關。

2 FLHS模型的建立

雞FLHS在籠養(yǎng)蛋雞中尤為高發(fā)，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展，建立動物模型有利于對發(fā)病機制進行深入的研究，為防治該病奠定理論基礎。且國內外研究表明，雞FLHS與哺乳動物NAFLD相似，雞FLHS常作為NAFLD的動物模型。飼料中能量含量過高是FLHS發(fā)生的主要原因之一，研究早期使用高能(high-energy，HE)日糧與強制喂食相結合可構建FLHS模型，為了更加符合養(yǎng)殖生產(chǎn)條件下的發(fā)病情況，后多為隨意進食模型。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，高能低蛋白(high-energy low-protein，HELP)可能是雞FLHS自然發(fā)生的原因之一，飼喂SFA來源的HELP非強制性進食模型成為建造雞FLHS的經(jīng)典方法。針對不同影響因素引起的雞FLHS，臨床上也使用甲硫氨酸/膽堿缺乏(MCD)日糧、肌肉注射雌二醇等方法誘導雞FLHS模型(表1)。

2.1 高能(HE)日糧

能量過剩的蛋雞有患FLHS風險，能量來源無論是碳水化合物還是脂肪均可誘發(fā)FLHS。1)碳水來源：飼喂高能玉米糧比低能大麥糧產(chǎn)生更高的FLHS發(fā)病率；2)脂肪來源：多項研究表明與碳水化合物相比，以脂肪為能量來源的平均出血評分較高，且以添加含SFA的動物油(豬油、牛油、羊脂)或提高n-6 PUFA比例(大豆油、菜籽油)更為明顯。

2.2 高能低蛋白(HELP)日糧

Rozenboim等提出，HELP可能是誘導雞FLHS的自然病理方式，商業(yè)養(yǎng)殖傾向于在雞生長后期增加飼料能量并降低蛋白質含量，飲食中蛋白質含量不足以提供載脂蛋白合成所需的氨基酸，就會發(fā)生自然的FLHS。HELP日糧引起雞高脂血癥、肝空泡化、IL-1和TNF-α升高，導致肝胰島素抵抗、脂肪變性和炎癥，并且HELP日糧誘導比HE出血評分更高。

2.3 膽堿缺乏日糧

飼喂含有高能量、低亞油酸和低膽堿日糧的母雞具有較高的肝重量和出血評分。MCD日糧導致50%雞形成FLHS，但不同品系雞均表現(xiàn)為HE比MCD日糧有著更高的發(fā)病率。最新研究顯示，高膽固醇低膽堿(CLC)日糧和低蛋白高脂高膽固醇低膽堿(LPHFCLC)日糧促進雞肝脂肪生成并導致脂肪性肝炎，7周齡雌雞誘導4周可導致FLHS，該模式可用來快速生成研究脂肪變性和脂肪性肝炎的模型。

2.4 肌肉注射E2

Shini等使用30周齡蛋雞肌肉注射E，以5 mg·kg劑量每4 d注射1次，誘導20 d可導致雞的肝臟指數(shù)、肝脂肪含量、TG、TC顯著增加，肝組織炎性細胞浸潤并出血破裂，誘發(fā)FLHS。且該實驗室進一步研究發(fā)現(xiàn)，E與LPS結合會增加FLHS的發(fā)病率和嚴重程度。然而，在另一項類似的研究中，E誘導了老年蛋雞的FLHS，但不引起36周齡蛋雞的FLHS。因此，該方法有待進一步確定功能性。

3 雞FLHS的發(fā)生機制

FLHS的發(fā)生原因、機理和病理癥狀與哺乳動物NAFLD類似，但NAFLD發(fā)病機制極其復雜，目前尚未被完全揭示。早期學者普遍認可NAFLD和FLHS的發(fā)病機制是以胰島素抵抗為第一次打擊核心、氧化應激為第二次打擊核心的“二次打擊”學說，但隨著深入研究，NAFLD的發(fā)病機制已從經(jīng)典“二次打擊”學說演化為“多重打擊”?！岸嘀卮驌簟睂ρ芯侩uFLHS的發(fā)病機制也具有重要參考意義。雞由于其自身生理特性和外部高脂飲食易形成高血糖、高血脂癥，產(chǎn)生胰島素抵抗。胰島素抵抗和高脂飲食共同使脂質代謝異常，脂肪以甘油三酯的形式在肝中積累誘發(fā)單純性脂肪變性；與此同時，脂質代謝異常產(chǎn)生的高水平FFA、游離膽固醇和脂質中間體導致脂肪毒性增強，并進一步促進胰島素抵抗。因此，胰島素抵抗是引發(fā)雞FLHS的第一因素。脂肪毒性使內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙機制被激活，由此產(chǎn)生過量ROS導致氧化應激，而胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應激和胰島素抵抗引起的脂肪因子分泌異常等同時或級聯(lián)地進一步激活肝組織炎癥、損傷和纖維化、自噬抑制，而以上的“多重打擊”最終導致雞FLHS。

表1 近5年雞FLHS誘導模型及相關指標變化

3.1 肝游離脂肪酸增多

雞肝脂肪合成速度遠勝于哺乳動物，且肝外組織合成脂肪能力有限，超過90%的脂肪在肝內合成。雞的淋巴系統(tǒng)不夠完善，從腸道吸收的脂肪酸通過肝門靜脈系統(tǒng)直接轉運至肝，肝合成的脂肪和蛋白結合形成肝脂蛋白，大部分以VLDL的形式轉運到其他組織中儲存或利用，如發(fā)育的卵母細胞以形成蛋黃。當肝DNL和通過腸道吸收的脂肪酸高于脂肪酸β氧化和VLDL分泌能力時，過量FFA和TG在肝中積累，造成單純性脂肪變性。

3.1.1 肝脂肪從頭合成增強 轉錄因子如SREBP-1、ChREBP和PPARγ的激活可增強肝DNL過程。ACC和FAS是DNL過程中脂肪酸生成的關鍵酶，臨床上肝靶向ACC抑制劑減少非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)患者肝脂肪含量，F(xiàn)AS抑制劑降低代謝異常男性的DNL。LXRα為調節(jié)肝脂質代謝的轉錄因子，在NAFLD中被激活促進SREBP-1c轉錄，提高ACC和FAS活性，阻斷LXRα磷酸化延緩高脂高膽固醇飲食小鼠的NAFLD進展。因此，肝DNL異常增強是NAFLD發(fā)展的重要途徑。同樣在雞中，不同日糧誘導的FLHS均表現(xiàn)為肝中SREBP-1c、PPARγ、ACC和FAS顯著上調，DNL增強，TG和FFA含量增多。

3.1.2 肝脂肪酸β氧化減少 肉堿棕櫚酰轉移酶(carnitine palmitoyl transterase，CPT)是線粒體脂肪酸β氧化的關鍵酶，丙二酰CoA作為DNL合成早期的中間體，可抑制CPT活性。PPARα和能量傳感器AMPK信號通路為脂肪酸氧化的積極調節(jié)因子，PPARα和AMPK信號通路失調導致脂肪酸β氧化能力的降低，影響FLHS的發(fā)生。PPARα可上調CPT-1表達，增強線粒體和過氧化物酶體的脂肪酸氧化能力，也可通過增強細胞色素P450表達促進微粒體ω氧化，并且PPARα還可抑制炎癥和急性期反應；雞FLHS表現(xiàn)為肝組織中PPAR信號通路失調，使用PPARα激動劑則降低肉雞基因和蛋白水平表達，進一步抑制SREBPs轉錄、降低TG和TC含量。Gao等報道FLHS蛋雞1基因表達水平顯著下調；Zhang等使用AMPK激動劑則顯著上調蛋雞肝細胞、-1基因水平，下調、基因水平，表明AMPK可減少脂質合成，促進脂肪酸氧化。3-羥基丁酸為脂肪酸β氧化的特定代謝物，Guo等研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞FLHS血清3-羥基丁酸含量顯著降低，F(xiàn)eng等研究發(fā)現(xiàn)，肝PPARα的激活能促進脂肪酸利用，并增加血清3-羥基丁酸的含量。此外，雞FLHS的肝中檸檬酸合酶和細胞色素C氧化酶的活性降低，另一項研究中，表現(xiàn)為-1、和(甘油三酯水解標志酶)基因下調。肝脂肪酸β氧化減少引起了脂肪酸的過度積累。

3.1.3 脂滴的形成 過多脂肪酸在肝中形成TG并以脂滴(lipid droplets, LDs)形式暫時儲存或以含TG的極低密度脂蛋白(VLDL-TG)形式分泌。雞FLHS中大部分表現(xiàn)為肝TG增多和脂滴積累導致肝細胞不同程度空泡化(脂肪變性)。Apo B定位在內質網(wǎng)膜啟動VLDL囊泡組裝， MTTP作為關鍵酶參與了Apo B在內質網(wǎng)的轉運以及轉移脂肪到新生脂蛋白顆粒中，兩者是VLDL組裝和分泌過程中的重要蛋白；功能失調的VLDL-TG合成和分泌是單純性脂肪變性轉變?yōu)橹拘愿窝椎脑?，阻斷Apo B、MTTP和VLDL分泌導致NASH/NAFLD。肝MTTP在FLHS雞中表達增加，表明TG在VLDL中積累；Song等研究發(fā)現(xiàn)，雞肝中Apo AⅠ和Apo B100在FLHS雞中異常降低，表明VLDL的功能失調是FLHS的一部分，VLDL分泌受阻又會進一步導致LDs的形成，導致肝細胞脂肪化。

3.2 胰島素抵抗

雞肝組織中，胰島素與胰島素受體結合，使其自磷酸化并磷酸化胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)的酪氨酸殘基以啟動胞內胰島素信號轉導，即PI3K/Akt和MAPK ERK1/2兩條主要轉導途徑。已證實雞肝中存在的IRS包括IRS-1和Shc(主要為52 ku亞型)，雖然雞基因組1號染色體存在IRS-2同源物編碼序列，但IRS-2尚未在雞各組織中報道。Dupont等研究發(fā)現(xiàn)，胰島素級聯(lián)反應在雞肝中正常表現(xiàn)，但在雞脂肪和肌肉組織存在明顯的胰島素抵抗(insulin resistance， IR)，具體表現(xiàn)為胰島素刺激或抑制不影響胰島素受體、IRS-1、Shc的酪氨酸磷酸化和下游元件(PI3K、Akt、AMPK)的活性，具有天然的“胰島素抵抗癥”。胰島素通過葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)增強對葡萄糖的攝取，而在雞組織中缺乏GLUT4，因此雞的血糖濃度水平是其體重相近哺乳動物的2～4倍，其生理特征較哺乳動物更易誘發(fā)IR。研究顯示，F(xiàn)LHS雞空腹血糖和TG濃度顯著增加，產(chǎn)生高水平IR，表明IR參與了雞FLHS。

3.2.1 FFA誘導促進胰島素抵抗 FFA引起IR的機制包括細胞內脂質中間體、內質網(wǎng)應激/氧化應激、促炎細胞因子的產(chǎn)生。一方面，大量FFA及其脂質中間體如二?；视?DAG)、脂酰CoA和神經(jīng)酰胺等具有脂肪毒性，導致線粒體功能障礙(氧化活性和ATP合成降低)，抑制胰島素分泌(胰島素分泌消耗ATP)；DAG和內質網(wǎng)應激/線粒體功能障礙產(chǎn)生的過量ROS可激活蛋白激酶C(PKC)，而PKC可降低IRS-1/2的酪氨酸磷酸化。另一方面，F(xiàn)FA介導NF-κB的激活和促炎細胞因子產(chǎn)生(IL-1β、IL-6、TNF-α)，促炎細胞因子激活JNK1和細胞信號轉導抑制因子(SOCS)，二者增強IRS1/2絲氨酸磷酸化，抑制酪氨酸磷酸化。因此，F(xiàn)FA通過多種途徑導致胰島素信號通路缺陷，產(chǎn)生IR。

3.2.2 胰島素抵抗加劇FFA的生成 IRS激活可作為SREBP-1c的調節(jié)因子，IR狀態(tài)下，IRS下調使SREBP-1c過度表達進而驅動肝DNL。正常情況下，胰島素與其受體結合使參與TG水解為甘油和FFA的激素敏感酶(hormone-sensitive lipase，HSL)失活，抑制TG分解；而在IR狀態(tài)下，HSL將FFA釋放到肝循環(huán)中的活性增強，從而進一步引起肝FFA水平大量增加，造成惡性循環(huán)。

過量FFA與IR的惡性循環(huán)是導致雞FLHS的重要誘因之一，并且兩者共同導致脂肪因子分泌異常，并激活脂肪毒性、氧化應激和炎癥的級聯(lián)反應。

3.3 脂肪毒性、氧化應激

脂肪毒性與氧化應激的惡性循環(huán)加重雞FLHS，且進一步激活炎癥信號通路。

3.3.1 內質網(wǎng)應激 正常含量的脂質成分控制內質網(wǎng)、線粒體的結構和功能，這取決于內質網(wǎng)運輸?shù)骄€粒體的脂質數(shù)量、線粒體合成磷脂的能力。磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl serine，PS)主要在內質網(wǎng)合成，通過線粒體相關內質網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs)導入線粒體轉化為磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine，PE)，PE再導入內質網(wǎng)轉化為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)。研究表明，MAMs的完整性決定了內質網(wǎng)-線粒體的正常通訊，其被脂質破壞時可損害內質網(wǎng)Ca穩(wěn)態(tài)、導致內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，靶向MAMs完整性的藥物可改善NAFLD。線粒體融合蛋白2(mitofusin-2，Mfn2)為線粒體膜蛋白，具有連接內質網(wǎng)膜和線粒體的作用，Mfn2結合PS并特異性地將PS提取到膜區(qū)轉移至線粒體。Hernández-Alvarez等最新研究發(fā)現(xiàn)，在NASH患者和小鼠模型中均檢測到Mfn2水平降低，減少了內質網(wǎng)PS轉移和PC合成，導致ERS，并提出破壞內質網(wǎng)-線粒體PS轉移可能是肝疾病發(fā)展的新機制。細胞色素P4502E1(CYP2E1)為內質網(wǎng)膜末端氧化酶，Ca穩(wěn)態(tài)破壞、ERS提高CYP2E1活性而產(chǎn)生過量ROS，導致氧化應激。另一方面，蛋白質合成增加、ERS或缺乏ATP導致內質網(wǎng)內未折疊蛋白質的積累，激活的“未折疊蛋白反應 (unfolded protein response，UPR)”是解決ERS的適應性反應。在NAFLD中，誘導UPR的因素包括高血糖、高膽固醇血癥、線粒體損傷、ATP缺乏、PC耗竭和氧化應激。在長期或嚴重的ERS下，UPR由適應性轉變?yōu)榧せ頙NK1信號通路和線粒體凋亡途徑啟動促凋亡機制。Gesek等在研究Ross 308、Cobb 500和 Hubbard F153 三個品種肉雞育肥過程中肝組織超微結構變化時發(fā)現(xiàn)，在育肥的17、31、38 d隨著肝細胞細胞質顯示大小不等的空泡或脂滴，線粒體發(fā)生腫脹、變形、增殖和損傷，粗面內質網(wǎng)出現(xiàn)碎片化和腺泡轉化。內質網(wǎng)應激可能參與了禽FLHS發(fā)展，但需要進一步開展更多的研究來證實。

3.3.2 氧化應激 大量脂質中間體如脂酰CoA進入線粒體內膜進行β氧化，增加的脂質流量使呼吸鏈崩潰，增加電子泄露使ROS過量產(chǎn)生，導致氧化應激。大量FFA、脂質中間體、ROS以及ROS氧化生物膜產(chǎn)生的脂質過氧化物等具有脂肪毒性，改變細胞膜流動性和通透性，造成線粒體Ca內流增加、結構改變和功能障礙，進一步產(chǎn)生ROS形成氧化應激增強的“惡性循環(huán)”，并且氧化應激通過上調肝DNL進一步驅動脂肪變性。在雞FLHS進程中，Xing等報道高能低蛋白導致蛋雞肝中丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度顯著增加，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽水平顯著降低；同樣，Wu等報道高脂日糧誘導FLHS雞的肝中MDA濃度升高，GSH-Px降低，造成氧化應激。

3.4 炎癥和纖維化

3.4.1 NLRP3炎癥小體和IL-1β NLRP3炎癥小體是炎癥反應中重要的組成部分，為大型細胞質多聚體復合物。脂質積累使細胞受損/死亡釋放ATP，胞外高濃度ATP可激活靶細胞中嘌呤能受體(如P2X7受體)，受體激活NLRP3炎癥小體組裝，并誘導IL-1β成熟和分泌，加強炎癥反應。NLRP3的磷酸化促進NLRP3炎癥小體復合物的組裝，而JNK1可介導NLRP3磷酸化；線粒體功能障礙、ROS產(chǎn)生以及溶酶體損傷進一步促進磷酸化NLRP3炎癥小體自身結合和隨后的炎癥體組裝。NLRP3炎癥小體缺陷小鼠全身神經(jīng)酰胺水平降低，炎癥減輕，且免受飲食誘導NASH疾病的進一步發(fā)展。炎癥小體激活還促進肝纖維化，3基因敲入小鼠在正常飲食下表現(xiàn)出自發(fā)性肝纖維化，Gaul等最新研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞外NLRP3炎癥小體可被肝星狀細胞吞噬，使IL-1β 和α-平滑肌肌動蛋白表達增加，導致肝纖維化，揭示細胞間炎癥傳播的新方式。與單純脂肪變性患者相比，NASH患者NLRP3和前IL-1β的表達顯著升高，并且IL-1β進一步加強TNF-α誘導的細胞損傷和炎癥，推動NASH發(fā)展。降低雞只NF-κB/NLRP3/Caspase1相關通路表達能減輕肝炎癥反應和細胞焦亡，但是，NLRP3炎癥小體與雞FLHS關系研究甚少。

3.4.2 炎癥狀態(tài) 過量的FFA直接刺激TNF-α的表達，TNF-α和ROS主要通過刺激NF-κB和JNK1/2炎性通路使促炎細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)進一步產(chǎn)生和釋放。與單純脂肪變性患者相比，NASH患者血清TNF-α水平更高，且肝組織TNF-α和TNF受體1(TNFR1)的表達水平與脂肪性肝炎進程和纖維化嚴重程度相關。TNF-α介導的肝損傷主要通過TNFR1轉導，Wandrer等研究表明，在NAFLD小鼠模型中選擇性抑制TNFR1可抑制SREBP1及其下游和JNK的激活，抑制肝脂肪變性、炎癥性損傷、胰島素抵抗和纖維化。然而，TNFR1相關功能在雞FLHS中尚無報道。NF-κB是炎癥激活的主要轉錄因子，在NAFLD動物模型以及NASH患者中顯示NF-κB的持續(xù)激活，而其持續(xù)激活導致慢性炎癥狀態(tài)。JNK1/2是炎癥和凋亡的激活劑，抑制JNK減少脂肪變性、脂肪性肝炎和胰島素抵抗。如前所述，TNF-α、NF-κB和JNK1/2都可導致胰島素抵抗和炎癥狀態(tài)，因此，炎癥信號通路和促炎因子持續(xù)激活在脂肪變性發(fā)展為脂肪性肝炎和肝纖維化過程中起關鍵作用，且導致脂肪性肝炎/纖維化的常見組織學變化，如細胞凋亡和壞死、中性粒細胞浸潤、肝星狀細胞活化和mallory小體產(chǎn)生。最近有研究檢測到FLHS雞的肝中IL-1β、TNF-α表達升高，導致脂肪性肝炎；FLHS雞的肝脂肪變性和局部出血并伴隨淋巴細胞、單核細胞和嗜異性粒細胞浸潤，肝-1、-6基因表達增高、外周白細胞總數(shù)和纖維蛋白原水平升高，表明肝局部和全身性炎癥引起損傷并最終導致雞FLHS。

因此，F(xiàn)FA水平的增加以及隨之而來的胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應激、炎癥等促發(fā)一系列級聯(lián)反應，導致肝的炎癥、損傷和纖維化。

3.5 脂肪因子分泌異常

脂肪組織被認為是控制新陳代謝的激素活性系統(tǒng)，可分泌激素和脂肪因子，如瘦素(leptin)和脂聯(lián)素(adiponectin，ADPN)，影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質代謝和炎癥。脂肪組織中過多的脂質儲存導致胰島素抵抗、NAFLD和其他脂質代謝疾病，而胰島素抵抗進一步導致脂肪因子失衡，不僅嚴重影響脂肪組織本身，還會影響肝的脂質代謝。

瘦素是脂肪細胞分泌的重要脂肪因子，可調節(jié)脂肪儲存，加快生物的新陳代謝，抑制食欲，具有促炎作用，并防止非脂肪部位的脂質積聚。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其受體不僅存在于丘腦、脂肪組織，還廣泛存在于全身各個組織如乳腺上皮細胞、胎盤、胃黏膜上皮細胞。在哺乳動物肝中，瘦素通過降低SREBP-1的表達調節(jié)脂質代謝；通過hedgehog和m-TOR途徑激活肝星狀細胞，其促纖維化作用已在各種體外和動物模型中得到證實；瘦素還具有激活肝細胞自噬的功能，血清瘦素水平對NAFLD的作用和意義仍未明確。雞瘦素基因由于低序列保守性、低表達水平，GC含量高達70%，直到2016年才被確認，且目前暫無瘦素對雞肝的影響和機制研究。Seroussi等研究明確了雞瘦素在腸道黏膜上皮柱狀細胞和杯狀細胞中表達。因此，不同于哺乳動物中瘦素作為循環(huán)激素，雞瘦素可能通過自分泌/旁分泌模式作用，通過腸-肝軸影響雞FLHS。

ADPN作為一種胰島素超敏化激素，可改善肝和外周胰島素抵抗，并具有抗炎和保肝活性。ADPN水平與代謝綜合征和肝功能障礙的風險呈強負相關，其在肥胖中的水平降低可能與線粒體功能障礙和胰島素抵抗有關。ADPN還具有直接的抗纖維化作用，這可能通過激活脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)-AMPK途徑介導；在缺乏ADPN的小鼠中已證實其肝纖維化增強，而注射重組脂聯(lián)素可顯著改善小鼠的脂肪性肝炎和纖維化。最近，新型合成活性小分子脂聯(lián)素受體激動劑(AdipoRon)在體內外顯示出與ADPN相似的作用，AdipoRon通過AdipoR1-AMPK和AdipoR2-PPARα途徑發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。ADPN和AdipoR1/2可在雞肝中較高表達，不同于哺乳動物的ADPN為3種不同的寡聚體，雞ADPN結構為獨特的脂聯(lián)素聚合物，其質量大于669 ku。然而，ADPN對雞肝的作用暫無報道，有待研究。

3.6 自噬抑制

自噬調節(jié)脂質代謝和胰島素抵抗，清除異常線粒體保護肝細胞免受損傷和死亡，且多方證據(jù)支持自噬抑制在NAFLD進程中起核心作用。脂噬為自噬的一種，其介導的LDs脂肪分解為較新發(fā)現(xiàn)，Gao等報道高脂飲食抑制小鼠脂噬，而運動和飲食干預分別通過激活AMPK/ULK1和抑制Akt/mTOR/ULK1途徑增強肝的脂噬進而改善NAFLD；沉默自噬相關基因(5、7)表達或抑制劑阻斷自噬導致LDs積累，而通過肝特異性過表達Atg7、FOXO1、TFEB等或使用自噬激活劑則可降低肝脂肪變性和胰島素抵抗。自噬清除ROS和受損線粒體DNA從而抑制炎癥小體激活，小鼠肝細胞特異性5基因敲除通過IL-1β/TNF途徑導致肝組織炎癥增加；NAFLD患者肝62/1基因和蛋白表達增高，其積累代表自噬抑制，并與纖維化階段顯著正相關。然而，自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展的不同階段其影響呈雙面性，自噬抑制肝癌的發(fā)生和調節(jié)免疫發(fā)揮抗腫瘤作用，一旦腫瘤形成，自噬則通過降解受損細胞器和異常蛋白提供營養(yǎng)使癌細胞得以存活進而轉為促進肝癌發(fā)展。誘導RAW264.7細胞脂肪酸氧化抑制細胞自噬；Wang等通過高能低蛋白日糧誘導的FLHS蛋雞，發(fā)現(xiàn)肝自噬相關基因-1、5和7表達量降低，62基因表達量升高。Wu等利用高脂日糧誘導FLHS蛋雞，發(fā)現(xiàn)FLHS蛋雞肝自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量減少。以上研究均表明自噬抑制參與了雞FLHS的發(fā)展，但自噬如何調節(jié)FLHS還有待進一步的研究。

4 總結和展望

受遺傳、表觀遺傳修飾、營養(yǎng)、激素和環(huán)境等多重影響因素使雞易感FLHS，而游離脂肪酸增多、胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應激、炎癥、纖維化、脂肪因子分泌障礙和自噬抑制等“多重打擊”導致積累性肝損傷最終引起雞死亡。對于模型的選擇，通過對近5年雞FLHS模型的分析總結出：1)誘導日糧的選擇：高能低蛋白(HELP)日糧>高能(HE)日糧>甲硫氨酸/膽堿缺乏(MCD)日糧，如需快速獲得雞FLHS可將幾種模型結合。2)雞年齡的選擇：年長雞比青年雞更加易感FLHS，青年雞易誘導FLHS進程前期的脂肪變性和炎癥模式，年長雞易誘導FLHS進程后期的出血和纖維化模式。

雞FLHS的形成具有多重影響因素，表現(xiàn)為系統(tǒng)間的平衡至關重要；雞日糧中的各種成分通過腸-肝軸發(fā)揮作用、生殖系統(tǒng)中雌二醇的變化、應激引起腎上腺相關激素的改變、骨組織分泌的骨鈣素以及脂肪因子脂聯(lián)素等能量調控因子的變化、雞脂肪和肌肉組織本身存在明顯的胰島素抵抗，體現(xiàn)出機體維持健康的基礎是各器官系統(tǒng)良性的動態(tài)平衡。目前，雞FLHS“多重打擊”機理研究較少，在脂肪酸、甘油三酯、胰島素抵抗和炎癥因子方面較多，但瘦素、脂聯(lián)素、炎癥小體和自噬在FLHS發(fā)展中的作用還未明確；瘦素由于其特殊的表達位置可能通過腸-肝軸影響FLHS，已報道FLHS進展中存在自噬但具體作用有待確定。由于雞FLHS臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，發(fā)病突然死亡，臨床應多以預防為主，可針對不同的影響因素和作用機制篩選藥物，利用營養(yǎng)補充劑、骨鈣素、益生菌、益生元、合生元、糞菌移植以及信號通路相關的siRNA、miRNA、脂聯(lián)素受體激動劑、AMPK激動劑、自噬激動劑、JNK抑制劑等有望預防和治療雞FLHS。