印雙紅，張俊波， 張孟琴， 易 萌， 易彩霞， 蔡春連， 毛 宏， 易繼海， 李志強， 陳創(chuàng)夫

(1.銅仁學院大健康學院，貴州銅仁 554300； 2.銅仁學院農(nóng)林工程與規(guī)劃學院，貴州銅仁 554300；3.貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州銅仁 554300；4.銅仁學院材料與化學工程學院，貴州銅仁 554300； 5.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；6.商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘 476000)

布魯氏菌病是一種廣泛分布的人畜共患傳染病。動物感染布魯氏菌后表現(xiàn)為關節(jié)炎、流產(chǎn)、胎膜發(fā)炎、空懷和睪丸炎等癥狀。人可以通過吸入氣溶膠化的細菌或通過攝取和接觸被污染的動物組織而感染。人感染布魯氏菌后會導致反復發(fā)燒、關節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等全身性疾病。目前，布魯氏菌的持續(xù)性感染的分子機制尚不清楚。

泛素蛋白酶體途徑具有降解真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的作用，調(diào)節(jié)著大多數(shù)蛋白的降解，是維持細胞穩(wěn)態(tài)所必需的。蛋白酶體降解途徑主要包括靶蛋白的泛素化和泛素化靶蛋白在蛋白酶體內(nèi)的降解。靶蛋白的泛素化主要需要3種酶協(xié)同完成，包括E1活化酶、E2結合酶和E3連接酶。E2結合酶以一個多基因家族形式存在，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)40多個泛素結合酶。E2結合酶一般具有1個 16～18 ku大小的催化中心，包含具有催化活性的半胱氨酸殘基。然而，E2結合酶在布魯氏菌感染過程中的作用機制尚不清楚。本研究以泛素結合酶UBE2G2為研究對象，檢測其在胞內(nèi)布魯氏菌繁殖中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Opti-MEM培養(yǎng)基，購自GIBCO公司；LDH檢測試劑盒，購自碧云天生物技術公司；LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、Lipofectamine 2000 和總RNA提取試劑Trizol，均購自Invitrogen公司；布魯氏菌M5-90、小鼠巨噬細胞RAW264.7和pLVX-puro載體，由貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室保存。該試驗于2019年4月至2020年10月在貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室完成。

1.2 UBE2G2基因過表達細胞的構建

1.2.1 過表達質(zhì)粒pLVX-puro-的構建 利用NCBI網(wǎng)站下載小鼠的基因序列(GenBank登錄號為NM_019803.3)，送華大基因公司合成序列，將目的基因序列與pLVX-puro載體連接構建過表達質(zhì)粒pLVX-puro-，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，7 000 r/min離心3 min，將沉淀菌體涂布于含有氨芐青霉素(100 g/mL)的固體平板中，于 37 ℃ 培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒并進行PCR擴增和酶切驗證。

設計pLVX-puro載體和pLVX-puro-的共同檢測引物，F(xiàn)：5′-C A C G C T G T T T T G A C C T C C A T-3′，R：5′-G G A T G T G G A A T G T G T G C G A G-3′。質(zhì)粒pLVX-puro和pLVX-puro-的PCR體系為20 μL：2×ESMasterMix 10.0 μL，pLVX-puro-(pLVX-puro) 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，ddHO 7.0 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30次；72 ℃ 7 min。質(zhì)粒pLVX-puro-雙酶切驗證體系為40 μL：RⅠ限制性內(nèi)切酶 2.0 μL，HⅠ限制性內(nèi)切酶2.0 μL，質(zhì)粒pLVX-puro-20.0 μL，10×H Buffer 4.0 μL和ddHO 12.0 μL。

1.2.2 過表達效果的檢測 參照文獻[7]中的方法，用6孔板培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)液用10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，待細胞密度為1×10個/mL時，將細胞培養(yǎng)基更換為無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細胞分為磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組、pLVX-puro 空質(zhì)粒組和pLVX-puro-過表達質(zhì)粒組。取2支滅菌的EP管，一個管加入 10 μL Lipofectamine 2000和240 μL Opti-MEM；另一個管加入15 μL質(zhì)粒(pLVX-puro或pLVX-puro-)或15 μL PBS和235 μL Opti-MEM，室溫靜置4 min，將上述2個管中的液體混合，室溫靜置15 min，然后將其加入至6孔板中，培養(yǎng)4 h后加入含胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細胞，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因過表達情況。從NCBI網(wǎng)站下載和內(nèi)參基因序列(GenBank登錄號分別為NM_019803.3和 NM_008084.3)，設計引物(表1)，引物序列由華大基因公司合成。以為內(nèi)參，qRT-PCR分析的表達水平，反應體系為20 μL：熒光染料10 μL，模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 6 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。試驗將PBS處理的細胞作為對照組。每組細胞設置3次重復，采用2-ΔΔ法分析基因的相對表達量。

表1 UBE2G2、CHOP和GAPDH基因的qRT-PCR引物

1.3 UBE2G2沉默表達細胞的構建

1.3.1 小干擾RNA(siRNA)的合成 由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成基因干擾片段，包括3對陽性siRNA序列(-83-siRNA、-253-siRNA和-456-siRNA)和1對陰性siRNA序列(表2)。

表2 UBE2G2基因的siRNA序列

1.3.2 沉默效果的檢測 參照文獻[7]中的方法，按照“1.2.2”節(jié)的方法培養(yǎng)細胞，將細胞分為PBS對照組、陰性siRNA組、-83-siRNA干擾組、-253-siRNA干擾組和-456-siRNA干擾組。取2個EP管，個管分別加125 μL Opti-MEM，然后一個管加入7 μL Lipofectamine RNAiMAX，另一個管加入12.5 μL siRNA(-83-siRNA、-253-siRNA、-456-siRNA或陰性siRNA)，室溫孵育5 min，將上述2個管中的液體混勻，室溫孵育15 min，然后將其加入細胞液中，培養(yǎng)4 h后加入含20%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h后，利用qRT-PCR分析基因沉默表達情況。

1.4 UBE2G2沉默或過表達對細胞活性的影響

采用MTT比色法檢測細胞活性。將-83-siRNA和pLVX-puro-質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，消化細胞，加入含胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將懸浮細胞接種于96孔板中。棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)，測量490 nm處的吸光度。試驗設正常培養(yǎng)的細胞為對照組，重復3次。

1.5 羊種布魯氏菌M5-90感染對相關基因表達的影響

從NCBI網(wǎng)站下載基因序列(GenBank登錄號為NM_007837.4)，設計基因的引物(表1)。用qRT-PCR分析M5-90感染對過表達和沉默表達基因的細胞中基因表達量的影響。

用M5-90感染細胞，培養(yǎng)24 h收集細胞。利用qRT-PCR分析的表達水平，具體方法見“1.2.2”節(jié)。試驗以PBS處理的細胞為對照組。

取轉(zhuǎn)染pLVX-puro-和-83-siRNA的細胞，用M5-90感染轉(zhuǎn)染的細胞，培養(yǎng)24 h收集細胞。利用qRT-PCR檢測的表達水平，具體方法見“1.2.2”節(jié)。試驗同時設正常細胞及轉(zhuǎn)染pLVX-puro空質(zhì)粒、陰性siRNA、PBS處理的細胞為對照組。

1.6 UBE2G2沉默或過表達對細胞內(nèi)布魯氏菌存活的影響

取“1.5”節(jié)中5組細胞，37 ℃培養(yǎng)1.5 h，添加含有慶大霉素(50 μg/mL)細胞培養(yǎng)基孵育40 min，更換無慶大霉素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，用TritonX-100裂解細胞，室溫放置15 min后將裂解液涂布固體平板，統(tǒng)計細菌數(shù)量，試驗重復3次。

1.7 UBE2G2沉默或過表達對細胞乳酸脫氫酶(LDH)水平及相關細胞因子的影響

取M5-90感染的PBS對照組、pLVX-puro空質(zhì)粒組、pLVX-puro-過表達質(zhì)粒組、陰性siRNA對照組、-83-siRNA干擾組共5組細胞，檢測LDH水平、白介素-18(IL-18)水平和γ-干擾素(IFN-γ)水平，試驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

試驗所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2G2構建的驗證

由圖1可知，pLVX-puro質(zhì)粒經(jīng)引物pLVX-puro-F/pLVX-puro-R PCR擴增獲得大小為 254 bp 的條帶，pLVX-puro-質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增可獲得的764 bp的條帶。由圖2可知，質(zhì)粒pLVX-puro-經(jīng)雙酶切獲得大小為510 bp的目的基因條帶，結果與預期值相符。結果表明，pLVX-puro-構建成功。

2.2 過表達載體pLVX-puro-UBE2G2過表達效果的驗證

由圖3可知，轉(zhuǎn)染pLVX-puro-UBE2G2組細胞的表達量極顯著高于PBS對照組(<0.01)；轉(zhuǎn)染pLVX-puro組細胞的的表達量與PBS對照組無明顯變化。結果表明，pLVX-puro-質(zhì)?？蛇^表達。

2.3 siRNA干擾UBE2G2基因效果的驗證

由圖4可知，-83-siRNA、-253-siRNA和-456-siRNA干擾組細胞基因的表達量均極顯著低于PBS對照組(<0.01)，干擾效率分別為89%、63%、48%。結果表明，的最佳干擾片段為-83-siRNA。

2.4 沉默或過表達UBE2G2基因?qū)毎钚缘挠绊?/h3>

由圖5可知，-83-siRNA干擾組、pLVX-puro-過表達質(zhì)粒組的細胞活性均在90%以上。結果表明，沉默或過表達基因不影響細胞活性。

2.5 布魯氏菌感染對UBE2G2和CHOP基因相對表達量的影響

由圖6可知，M5-90感染組細胞基因的表達量極顯著高于PBS對照組(<0.01)。結果表明，M5-90感染可誘導細胞的表達。

由圖7可知，與PBS對照組細胞相比，pLVX-puro-過表達組細胞中的表達量顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細胞中的表達量顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA對照組細胞中的表達量均無明顯變化。結果表明，沉默和過表達分別可提高和抑制M5-90介導的細胞中的表達。

2.6 沉默和過表達UBE2G2基因?qū)Π麅?nèi)布魯氏菌存活的影響

由圖8可知，轉(zhuǎn)染-83-siRNA片段的細胞內(nèi)布魯氏菌(M5-90)菌株數(shù)量顯著低于PBS對照組(<0.05)，轉(zhuǎn)染pLVX-puro-質(zhì)粒的細胞內(nèi)M5-90菌株數(shù)量顯著高于PBS對照組(<0.05)。結果表明，沉默和過表達分別可抑制和促進胞內(nèi)M5-90菌株的存活。

2.7 沉默和過表達UBE2G2基因?qū)5-90感染細胞的LDH、IL-18和IFN-γ水平的影響

2.7.1 LDH水平 由圖9可知，與PBS對照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細胞的LDH水平極顯著升高(<0.01)，-83-siRNA干擾組細胞的LDH水平顯著降低(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細胞的LDH水平均無明顯變化。結果表明，沉默和過表達分別可抑制和提高M5-90介導的細胞中LDH水平。

2.7.2 IL-18水平 由圖10可知，與PBS對照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細胞的IL-18水平顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細胞的IL-18水平顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細胞的IL-18水平均無明顯變化。結果表明，沉默和過表達分別可提高和抑制M5-90介導的細胞中IL-18水平。

2.7.3 IFN-γ水平 由圖11可知，與PBS對照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細胞的IFN-γ水平顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細胞的IFN-γ水平顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細胞的 IFN-γ 水平均無明顯變化。結果表明，沉默和過表達分別可提高和抑制M5-90介導的細胞中 IFN-γ 水平。

3 討論與結論

泛素主要參與細胞周期、胞吞作用和細胞程序性死亡等細胞過程。泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與病毒感染、存活、釋放與免疫逃逸等各個階段。研究表明，沉默泛素結合酶UBE2J1可顯著降低登革病毒(DENV)感染，而過表達UBE2J1可增強DENV感染。細胞泛素蛋白酶體系統(tǒng)也參與了細胞內(nèi)布魯氏菌的存活。研究表明，布魯氏菌S2感染巨噬細胞可誘導泛素及蛋白酶體的表達；功能增強后的泛素蛋白酶體系統(tǒng)可抑制布魯氏菌S2的早期感染；而在感染后期，利用抑制劑乳胞素抑制細胞蛋白酶體功能，可抑制細胞內(nèi)布魯氏菌S2的存活能力，因此推測泛素蛋白酶體功能被抑制后可促進巨噬細胞自體吞噬系統(tǒng)的活化，從而提高了巨噬細胞的殺菌能力。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在胞內(nèi)布魯氏菌繁殖中發(fā)揮正調(diào)控作用，本研究結果表明，M5-90感染可誘導細胞中的表達，且可調(diào)控胞內(nèi)M5-90菌株的存活，因此，與功能相似。

細胞因子IL-18具有在機體中防御各種傳染病調(diào)節(jié)細胞免疫的作用。IL-18在清除病毒過程中發(fā)揮作用。干擾素INF-γ是細胞分泌的糖蛋白，可活化自然殺傷(NK)細胞和誘導細胞主要組織相容性復合物Ⅰ(MHCⅠ)的表達，增強宿主的免疫力。IFN-γ是反映宿主細胞免疫水平的主要巨噬細胞活化因子。INF-γ是抗布魯氏菌感染的細胞因子。本研究表明，沉默和過表達分別可提高和抑制M5-90介導的細胞中IL-18和IFN-γ水平。因此，可調(diào)控布魯氏菌介導的細胞中IL-18水平和IFN-γ水平。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在機體抵抗胞內(nèi)病原感染過程中至關重要。布魯氏菌侵入細胞后隱藏于膜結合隔室內(nèi)，該隔室被稱為布氏小體。由于布氏小體在感染細胞周期中具有內(nèi)體性質(zhì)，因此將其稱為內(nèi)體布氏小體，該內(nèi)體布氏小體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構持續(xù)相互作用，獲得與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關的標記物；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含菌小泡被稱為復制性布氏小體，該復制性布氏小體具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結構和功能特征，表明內(nèi)體布氏小體轉(zhuǎn)化為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的細胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為布魯氏菌在細胞內(nèi)的繁殖提供了有利的場所。布魯氏菌在感染的細胞內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用，可表現(xiàn)出免疫逃避和細胞凋亡抑制的功能。是細胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激超過自身的應答能力時，誘導的高表達，引發(fā)細胞凋亡。本研究表明，沉默和過表達分別可提高和抑制M5-90介導的細胞中的表達。筆者推測沉默可通過誘導M5-90介導的細胞中的表達促進細胞發(fā)生凋亡，從而抑制胞內(nèi) M5-90 菌株的存活；因此，可能通過的表達來調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌的存活。