李海霞， 米銀法， 陳雙臣

(1.河南財政金融學院，河南鄭州 450000； 2.河南科技大學園藝與植物保護學院，河南洛陽 471003)

土壤干旱是限制農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要環(huán)境因素，干旱常常引起植物大量缺水、正常光合生理代謝紊亂，如氣孔閉合，酶活性降解，光合同化力下降，光能過?；钚匝踉黾?，損害光合機構。但許多研究表明，干旱脅迫時植物可啟動熱耗散調節(jié)途徑，依靠自身生理調節(jié)機能降低過剩光能的傷害，保護光合機構。如干旱下，白及、增加，降低，光合機構受損；甜高粱凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率降低，升高，、/、逐漸降低，表明高粱幼苗受損加重；干旱時棉花凈光合速率和氣孔導度降低，葉綠素熒光指標熒光產(chǎn)量(Yield)和葉綠素熒光非光化猝滅(NPQ)比/對干旱更敏感。鼓節(jié)竹干旱脅迫時可通過降低、和增加來降低 PSⅡ反應中心的開放程度，從而降低PSⅡ干旱下的傷害，表現(xiàn)出一定的耐旱性。研究還表明不同抗旱型的植物品種應對脅迫下PSⅡ受損時的保護機制不同。如遭受干旱時，耐旱型辣椒品種正椒13號的/、、和NPQ顯著高于敏感型品種弄口早椒。說明辣椒品種的抗高溫干旱能力與較高的光化學能力和熱耗散能力相關。

Ca是葉綠體PSⅡ必不可缺的重要組分，它在維持PSⅡ中心活性和穩(wěn)定細胞膜結構方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，干旱、高溫等逆境時外源Ca能夠調控PSⅡ中心活性，優(yōu)化逆境下的葉綠素熒光能量分配，改善植物的光合性能。如干旱脅迫下施用外源鈣后甘草葉片葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO濃度均有不同程度提高。高溫脅迫下噴施CaCl后葡萄葉n顯著提高，維持了較高的PSⅡ活性，、′/′、/極顯著高于對照，極顯著小于對照，有效緩解了高溫對葡萄葉光合作用的抑制及PSⅡ系統(tǒng)的損害。高鹽脅迫下外源Ca能顯著提高巴西蕉幼葉/、光化學淬滅、和，增強光合活性、光保護能力和捕光能力，有效緩解高鹽對光合系統(tǒng)的不利影響。干旱脅迫下噴施CaCl后烤煙葉片光合電子傳遞能量比例()降幅明顯小于對照，電子轉運效率明顯高于對照，PSⅡ用于光合電子傳遞的捕獲光能比例增加，提高了烤煙幼苗的抗旱能力。

綜上所述，關于外源Ca對干旱脅迫下植物葉綠素PSⅡ功能的研究文獻相對較多，但有關外源Ca對干旱脅迫下牡丹(Andr.)葉綠體PSⅡ熒光活性的影響，尤其是PSⅡ功能及吸收光能分配方面的研究尚未見報道，為此本研究以不同抗旱能力的牡丹品種為試材，研究干旱脅迫下外源CaCl對其PSⅡ功能及葉片吸收光能分配的影響，以期探求Ca的調控生理機制，為牡丹的栽培開發(fā)及引種管理等提供理論基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年8月至2019年6月在河南省林業(yè)科學研究院進行。選抗干旱能力較強的胡紅和不耐干旱脅迫的烏龍捧盛牡丹三年生分株苗為試材，植株由中國洛陽牡丹國家基因庫提供。2018年8月初選擇長勢良好、均勻一致的優(yōu)良苗，統(tǒng)一修整后在內徑30 cm高28 cm的瓦盆中進行盆栽，1盆1株，基質為大田肥沃土壤。每種牡丹栽種12棵，正常肥水管理。 2019年6月1—10日將盆栽分為不噴施CaCl的對照組和外施CaCl的處理組。每個處理6盆，6次重復。處理組噴施 0.3 mmol/L CaCl，對照組噴施蒸餾水。噴施時按早晚間隔 8 h以上的原則，每天對牡丹葉片正反面噴灑2次，葉片噴灑直至有水滴落，連續(xù)10 d。6月1—10日期間上述材料一邊進行噴施試驗，一邊進行下列干旱脅迫試驗，脅迫期間搭建防雨棚遮雨備用。6月1—10日內按文獻[13]每天傍晚時分對盆栽進行稱重、及時補水，使盆栽維持80%土壤含水量，6月11日后進行控水處理，讓各盆栽自然干旱。測得3、6、9 d時的相對含水量分別為50%～55%(輕度干旱)、35%～40%(中度干旱)、25%～30%(重度干旱)。干旱控水10 d，各處理大部分葉片明顯萎蔫，此時澆水至80%的相對土壤含水量進行復水并控水2 d。

1.2 試驗方法

分別在試驗期內0、3、6、9、12 d 10：00—12：00用美國Li-Cor6400XT V6.1熒光儀測定各處理葉綠素熒光參數(shù)，每次測定時固定選用基部上數(shù)第 4～5節(jié)位的完全展開葉。按照儀器操作說明并參照周艷虹等的方法測定各熒光指標，包括暗適應時葉片最大熒光()、初始熒光()、光下葉片初始熒光(′)、可變熒光()、最大熒光(′)、表觀光合電子傳遞速率()、最大光化學效率(/)、實際光能轉換效率(′/′)、非光化學淬滅系數(shù)()和葉綠素熒光光化學猝滅系數(shù)()等，指標可由儀器直接讀出。各指標重復4次。葉片天線熱耗散百分率()、非光化學耗散百分率()、光化學反應百分率()分別按照下列公式進行計算。試驗數(shù)據(jù)用DPS軟件進行分析，用Excel軟件進行作圖。

=1-′/′；

=×′/′；

=(1-)×′/′。

2 結果與分析

2.1 Fo、Fm的變化

反應中心PSⅡ開放時的熒光水平通常由葉綠素基礎熒光()加以衡量。圖1表明，抗性不同的牡丹品種胡紅和烏龍捧盛遭受干旱脅迫時隨脅迫程度的加重，對照及處理葉綠素基礎熒光均整體呈逐漸升高趨勢，趨勢則整體逐漸降低。9 d時，重度干旱脅迫下值最大，胡紅、烏龍捧盛分別比對照降低19.6%、14.1%(<0.05)。說明干旱脅迫對牡丹葉片光合作用產(chǎn)生了明顯的光抑制現(xiàn)象，光合原初反應受到抑制，影響了植株正常生長。但與脅迫初期相比，耐性較強的胡紅對照增加了48.1%，處理增加了25.9%?？梢娡馐〤aCl后耐性較強的胡紅增幅減少了22.2百分點。耐性較差的烏龍捧盛對照比脅迫初期增加了64.5%；處理比脅迫初期增加了45.0%。因此外施CaCl后耐性較差的烏龍捧盛增幅被抑制了19.5百分點?？梢娫馐芨珊得{迫時外施CaCl后，2個品種的牡丹增幅均受到了顯著抑制，緩解了因干旱逆境對2種牡丹葉綠素PSⅡ反應中心產(chǎn)生的破壞作用，減輕了失活。同時說明CaCl對耐性較強的胡紅緩解光抑制效應，改善光合作用的能力明顯優(yōu)于耐性較差的烏龍捧盛。圖1還表明，脅迫后期經(jīng)CaCl處理的2個品種復水后葉片顯著低于重度干旱時，與中度脅迫時無顯著差異，可見復水一定程度地緩解了2個牡丹品種的光抑制，可恢復到中度干旱時的水平。

研究認為逆境脅迫時，最大熒光()降低是光抑制光合作用的另一顯著表現(xiàn)。圖1表明，隨脅迫程度的加重2個牡丹品種逐漸降低，重度脅迫時最低，此時與脅迫初期相比，胡紅對照及處理分別降低了19.5%、14.6%；烏龍捧盛則分別降低了22.4%、13.9%?？梢娡馐〤aCl后2個品種均顯著抑制了脅迫期內的減少，就品種差別而言胡紅減少程度相對較輕。外施CaCl復水后，胡紅恢復到了輕度干旱時的水平(>0.05)；烏龍捧盛則恢復到了中度干旱時的水平。因此CaCl抑制胡紅降低的效果優(yōu)于烏龍捧盛。

2.2 Fv和Fv/Fm的變化

逆境生理下葉綠素可變熒光的大小及變化，可用于反映PSⅡ最初電子受體質體醌Q的氧化還原情況。由圖2可見，2種牡丹葉片隨干旱脅迫程度的增加逐漸降低，直到后期復水后，外施CaCl的2種牡丹葉又回升至中度干旱時的水平(>0.05)。說明外施CaCl結合復水能夠顯著提高2個牡丹品種葉片光化學效率，改善光合性能從而獲得較多的能量物質，以應對干旱逆境帶來的傷害。圖2還表明，外施CaCl后2個牡丹品種雖總體趨勢降低，但同一干旱程度下，胡紅、烏龍捧盛均顯著高于各自的對照。9 d時，胡紅、烏龍捧盛分別比對照提高了37.5%、34.7%。因此2種牡丹遭受干旱逆境時，光反應中心最初電子受體Q的氧化還原能力顯著降低。但外施CaCl后2種牡丹顯著提高，說明CaCl對Q的氧化還原能力起到了有效的保護作用。外施CaCl后6～9 d時，耐干旱能力較強的胡紅品種顯著高于抗性較差的烏龍捧盛(<0.05)，品種間差異顯著。2個品種之所以存在這種差異，可能與CaCl能維持胡紅較低的和較高的(圖1)有關。

葉綠素光能轉化時，/的大小和光合電子傳遞活性成正比，可用于衡量原初光能轉化率的高低。圖2表明，隨干旱脅迫程度的加重，抗性不同的2個牡丹品種葉綠素/均逐漸降低。但中度及重度干旱時噴施CaCl，2個牡丹品種葉片/都顯著高于對照，其中胡紅和烏龍捧盛分別比對照提高了10.7%～20.0%、9.7%～20.1%?？梢娫馐苤卸群椭囟雀珊禃r，噴施CaCl能有效緩解牡丹葉綠素PSⅡ系統(tǒng)原初光能轉化效率的受損程度，維持暗適應時較高狀態(tài)的最大光化學效率。

2.3 PSⅡ光潛在活性Fv/Fo的變化

葉綠體光反應中心PSⅡ的潛在活性可用/表示。圖3表明，對照及處理條件下的2種牡丹，葉片/都隨干旱脅迫程度的增加呈下降趨勢。2種牡丹對照葉片內/范圍為1.5～3.6，外施CaCl后則維持在1.8～4.2之間?？梢姼珊得{迫逆境下2種牡丹葉片PSⅡ潛在活性均受到了明顯抑制，但外施CaCl可以顯著提高/，進而提高PSⅡ的潛在活性。進一步方差分析表明，干旱脅迫期間3～12 d，處理和對照之間以及外施CaCl后的2個品種之間，/均存在顯著差異(<0.05)。尤其是重度干旱9 d時，胡紅和烏龍捧盛分別比對照值提高了71.5%、56.9%。表明此時抗性較強的胡紅PSⅡ潛在活性顯著高于烏龍捧盛(<0.05)。12 d經(jīng)復水處理后，2種牡丹/又迅速回升且與6 d時差異不顯著，可見PSⅡ潛在活性經(jīng)過3 d復水已經(jīng)能夠恢復到中度脅迫時的水平。

2.4 Fo′、Fm′、Fv′及Fv′/Fm′的變化

光下初始熒光(′)、光下最大熒光(′)、光下可變熒光(′)和PSⅡ實際光能轉換效率(′/′)也是葉綠素熒光參數(shù)研究中的幾個重要指標。圖4表明，遭受干旱脅迫時，抗旱能力不同的2種牡丹隨脅迫程度的增加，葉內′逐漸升高，′、′及′/′整體逐漸降低。表明遭受干旱脅迫時，胡紅和烏龍捧盛 PSⅡ反應中心捕獲激發(fā)能效率下降，PSⅡ 功能受到影響，致使牡丹植株葉片PSⅡ反應中心光化學效率降低。與各自對照相比，2種牡丹外施CaCl后′顯著降低，′、′及′/′顯著提高。外施CaCl后9 d的胡紅、烏龍捧盛′/′分別為0.71、0.66，分別比對照提高了20.3%、17.4%。由此可見，外施CaCl后抗旱能力較強的胡紅′/′無論是數(shù)值大小還是增加幅度，都顯著高于耐旱能力較差的烏龍捧盛(<0.05)。表明外施CaCl可以顯著提高干旱脅迫尤其是重度脅迫下牡丹植株PSⅡ的實際光能轉換效率，而且抗旱能力較強的胡紅PSⅡ實際光能轉換效率提高效果顯著優(yōu)于耐性較差的烏龍捧盛。脅迫后期復水后2種牡丹的′/′又逐漸升高，表明PSⅡ實際光能轉換效率又得以恢復。

2.5 qP、qN的變化

葉綠素熒光光能包含光化學猝滅()和非光化學猝滅()2種主要的能量耗散形式。圖5表明，遭受干旱脅迫時，抗旱能力不同的2種牡丹隨干旱時間的延長脅迫程度加劇，葉內耗散逐漸降低、耗散逐漸增加，復水時和得到改善。干旱脅迫下的減少和的增加意味著PSⅡ電子傳遞活性減弱、非光化學猝滅能量耗散增加，這2種因素造成Q的重新氧化能力減弱，植株光合碳同化能力受到嚴重影響。但與對照相比， 外施CaCl

顯著提高了胡紅和烏龍捧盛中度和重度干旱脅迫下的值，顯著降低了重度干旱脅迫下的值(圖5)。9 d時胡紅處理和烏龍捧盛處理的分別為0.53、0.46，比各自的對照提高了23.3%、24.3%；分別為0.75、0.87，比各自的對照降低了17.9%、28.9%。因此2個牡丹品種外施CaCl可以通過提高降低的方式，進一步穩(wěn)定PSⅡ的電子傳遞活性，保持它們較高的Q重新氧化能力。就2個牡丹品種而言，遭受重度干旱時抗性較強的胡紅仍能保持相對較高的值和相對較低的值，說明胡紅的能量耗散比烏龍捧盛損失較輕，維護光合反應中心免受破壞的能力相對更強，2個品種間差異顯著(<0.05)。

2.6 Pc、Hd、PSⅡ反應中心Ex、ETR的變化

由圖6可見，隨脅迫程度的加劇，胡紅和烏龍捧盛及反應中心呈逐漸升高的趨勢，和逐漸降低(<0.05)。但與各自的對照相比，外施CaCl條件下2個牡丹品種除外，顯著降低，、均顯著提高。9 d時胡紅和烏龍捧盛分別比對照降低29.3%、22.5%，增加48.3%、45.9%，增加118.3%、208.6%。因此CaCl處理能夠顯著提高干旱脅迫下2個牡丹品種葉綠素PSⅡ的光化學反應能量百分率和表觀光合電子傳遞速率，CaCl的這種調控效果非常有利于PSⅡ光化學效率的升高，結論與王曉黎等的研究結果一致。CaCl的這種調控作用可能與黃素循環(huán)受到抑制或D1蛋白活性升高相關。這也是經(jīng)外源CaCl調控下牡丹自行適應干旱脅迫的應對調節(jié)機制之一。就2種牡丹品種差異而言，雖然CaCl調控下胡紅的表觀光合電子傳遞速率增幅低于烏龍捧盛，但其光化學反應的能量百分率增加的幅度及天線熱耗散的百分率減少的幅度，都好于耐旱性較差的烏龍捧盛。

2.7 葉綠素熒光能量分配的變化

由圖7可見，遭受干旱脅迫0～6 d時，與抗性較差的烏龍捧盛相比，胡紅PSⅡ反應中心用于葉綠素熒光能量分配的吸收光能各份額所占比例較為穩(wěn)定，能量分配基本沒有受到較大影響。但總體上脅迫期內，2種牡丹PSⅡ吸收光能用于葉綠素熒光能量分配的和所占份額整體逐漸加大、所占份額逐漸減少，直到復水時、有所降低、增加。9 d時，胡紅對照∶∶=33.7 ∶25.4 ∶40.9，烏龍捧盛∶∶=35.5 ∶20.9 ∶43.6。外施CaCl后9 d，胡紅∶∶=33.4 ∶37.7 ∶28.9、烏龍捧盛∶∶=35.8 ∶30.5 ∶33.7。9 d時，胡紅、烏龍捧盛分別比對照增加了48.3%、45.9%，降低了29.3%、22.6%。脅迫中后期比值的增大，說明牡丹葉綠體捕捉到的光能分配比例進入PSⅡ反應中心的能量減少，天線熱耗散的能量損失份額加大，葉片光合保護機制嚴重受損。經(jīng)外施CaCl調控后減少、增大，可見外施Ca能夠提高進入PSⅡ反應中心的能量，緩解并降低天線熱耗散的能量損失，提高PSⅡ反應中心的光化學反應百分率，起到了很好地保護牡丹葉片光合機制的作用。

3 討論與結論

在正常生長條件下，植物葉綠體中光合反應中心PSⅡ活性較強，能夠及時將捕獲天線收集到的光能用于光化學反應，實現(xiàn)電子傳遞藕連光合磷酸化助推碳同化并生成同化力。但遭受逆境脅迫后，PSⅡ 光化學反應中心將發(fā)生可逆性失活，即便能吸收光能也推動不了電子傳遞，只有等逆境解除后反應中心活性才能恢復。其中Ca在PSⅡ調控中起著重要作用， 譬如Ca通道可抑制葉綠素熒光的猝滅。Ca還可參與PSⅡ放氧系統(tǒng)中的重要氧化還原反應，外施Ca進入細胞質后，會對葉綠體內的酶代謝過程進行調控，譬如碳同化相關Rubp竣化酶的活性等。目前認為干旱脅迫條件下外施Ca的生理調控作用，主要體現(xiàn)在它能維持類囊體膜的穩(wěn)定性，并顯著增強類囊體膜上的電子傳遞能力，提高葉片光能的轉換效率。Ca還擔負著細胞第二信使的功能，當植物感受到發(fā)育或生物、非生物脅迫信號的刺激后，Ca泵和Ca通道得以激發(fā)誘導細胞內Ca濃度變化產(chǎn)生鈣信號。借助于Ca-CaM信使系統(tǒng)參與并保護細胞膜雙脂層結構的穩(wěn)定和完整性。Ca還能夠結合許多受體細胞，接收外界環(huán)境信號并進行傳遞和放大，觸發(fā)一系列增強植物抗逆特性相關的生理反應，如內源滲透性調節(jié)物質的增加、保護酶活性的增強等。為此本研究以CaCl為外源調控物質，以便探求Ca對不同抗性牡丹品種干旱脅迫下的葉PSⅡ功能及葉綠素熒光能量分配的影響。

本研究中2種不同抗性的牡丹葉片隨干旱脅迫程度的加深，逐漸升高、逐漸降低(圖1)，致使顯著降低(=-)，進而/(圖2)和/(圖3)也顯著下降。的逐漸升高說明2種不同抗性的牡丹葉片PSⅡ 反應中心光化學已受到了明顯的損害。同時，研究認為植物葉片PSⅡ 反應中心遭受逆境時，還可以通過增加熱耗散來降低逆境傷害，并伴隨另一種猝滅過程，這個猝滅過程可由葉綠素熒光光化學猝滅系數(shù)進行衡量，且越大電子傳遞活性越強，氧化形成的QA量越多。外施CaCl后與對照相比，2個牡丹品種均顯著抑制了各脅迫程度時的增幅和的減少，提高了以及/，證明外施CaCl能夠有效減輕牡丹葉綠素光反應中心PSⅡ系統(tǒng)中原初光能轉化效率受損程度，維持暗適應時較高狀態(tài)的最大光化學效率。與各自的對照相比，外施CaCl后2種牡丹內′顯著降低，′、′及′/′顯著提高。′及′/′即光下可變熒光和PSⅡ實際光能轉換效率，表明CaCl可以顯著提高干旱脅迫尤其是重度脅迫下牡丹植株內PSⅡ的實際光能轉換效率，維持較高的碳同化產(chǎn)物。

圖5表明遭受干旱脅迫時，2種牡丹隨時間的延長葉內逐漸降低、逐漸增加。逐漸降低說明葉綠素PSⅡ氧化反應中心的電子傳遞Q-Q的過程中，受到了較為嚴重的抑制，最終導致進入并用于光合作用的電子量減少，同時也提高了耗散掉的無效光能份額，這和本試驗中升高的結論吻合(圖6)。但外施CaCl后2個牡丹品種又顯著提高、顯著降低，表明CaCl可以通過調控干旱脅迫時的PSⅡ氧化側向反應中心Q-Q的傳遞過程，改善光合電子傳遞效率，利于提高牡丹葉片NADPH和ATP的合成能力。

2個牡丹品種遭受干旱尤其是重度脅迫時，外施CaCl后對干旱敏感的烏龍捧盛/、/、′/′、無論是增加幅度還是數(shù)值大小均顯著低于抗性較強的胡紅，同時的降低幅度也高于胡紅。因而抗性較強的胡紅較高的和′/′增幅及數(shù)值，維持了其脅迫下較好的葉片PSⅡ反應中心開放程度和較高的光合電子傳遞速率。即為非輻射能量耗散誘發(fā)的熒光猝滅，外施CaCl后胡紅的降幅顯著低于烏龍捧盛，說明外施CaCl后胡紅用于保護光合機構而消耗的非輻射能量相應少于烏龍捧盛。由此可見就2個牡丹品種來說遭受重度干旱時，外施CaCl能促使抗性較強的胡紅調控至相對較高的值和相對較低的值狀態(tài)(<0.05)，保持較少的能量耗散和較強的ATP、NADPH合成力，維護光合反應中心免受破壞的能力更強，損失顯著輕于烏龍捧盛。

外施CaCl后與各自對照相比，2個牡丹品種除差異不顯著外，顯著降低，、均顯著提高(圖6)。減少、增大，表明外施CaCl能夠減少天線熱耗散的能量損耗，使得進入PSⅡ反應中心的能量增多，提高PSⅡ反應中心的光化學反應百分率，進而促進光合磷酸化以及NADPH和ATP的生成，以便更好地保護牡丹葉片光合機制向暗反應配送更多的還原力。這與低溫弱光下黃瓜光反應中心的能量分配結論類似，其作用機理還與黃素循環(huán)受到抑制或D1蛋白活性升高相關。而沒有施加CaCl的對照牡丹葉內，在脅迫中后期份額增大，說明重度脅迫加大了天線熱耗散，從而抑制了PSⅡ反應中心能量的進入，2個牡丹品種葉片光合保護機制受損嚴重。文獻表明引起增加的因素，主要有以下幾種：(1)干旱脅迫時葉內PSⅡ反應中心接受源于捕光色素捕獲能量的距離增加，加大了“線耗”，也隨之增高；(2)的增減還密切關聯(lián)于葉黃素的循環(huán)過程和光合單位葉綠素分子數(shù)量的多寡；(3)逆境條件下植物中的減少也會促進份額的增加。

就2個牡丹品種PSⅡ反應中心光能分配差異而言，干旱脅迫中后期(6 d后)，外施CaCl后不耐干旱的烏龍捧盛和所占份額均顯著高于抗性較強的胡紅(圖7)，但是較高份額也會引起 PSⅡ 反應中心激發(fā)壓的迅速增大，這種狀況將會直接導致葉綠素分子處于能量過剩狀態(tài)，過剩的能量一旦傳給O，將會形成極具破壞性的單線態(tài)O。因此烏龍捧盛較高的份額引起的光合機構失活程度和破壞作用明顯高于胡紅?？梢姼珊的婢硶r，Ca對抗性較弱的烏龍捧盛PSⅡ葉綠素熒光能量分配的調控機制要劣勢于抗性較強的胡紅?？傊@種比較復雜的Ca調控機制有待于進一步探討。