石 楊， 呂長(zhǎng)平， 帥佳琪， 毛 咪， 江莉娜

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128)

牡丹為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬()多年生落葉灌木，具有極高的藥用、觀賞、油用價(jià)值。但在長(zhǎng)期的人工栽培中，牡丹病蟲害的發(fā)生日益嚴(yán)重，影響了牡丹的利用價(jià)值。牡丹炭疽病為牡丹的主要病害之一。在濕熱的夏季，牡丹葉片病害尤為突出。

目前主要使用化學(xué)藥劑防治牡丹炭疽病，但在使用過(guò)程中不僅會(huì)造成環(huán)境污染，而且極容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。由于微生物農(nóng)藥具有高效、低毒、環(huán)保及來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)，使其受到研究者的廣泛關(guān)注。目前用于防治的微生物主要有拮抗放線菌、拮抗真菌和拮抗細(xì)菌。植物內(nèi)生菌是指在植物生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的微生物類群。相比較于其他生防菌，植物內(nèi)生菌所處的環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，不易受外界溫度、紫外輻射等因素的影響，能夠在植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖，其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使其越來(lái)越多地應(yīng)用于生防菌的研發(fā)。丁東玲等從藥用牡丹內(nèi)部分離得到的短小芽孢桿菌()具有拮抗金黃色葡萄球菌的作用。

本研究擬從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地內(nèi)健康牡丹的莖和根中分離、篩選、鑒定牡丹炭疽病菌拮抗菌株，并評(píng)估其拮抗能力，同時(shí)探究其對(duì)植物的促生特性。以期為進(jìn)一步研究病原菌與內(nèi)生菌的互作奠定基礎(chǔ)，為牡丹炭疽病防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 2019年12月，于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地內(nèi)采集生長(zhǎng)健壯的鳳丹、紫繡球、湘西粉3個(gè)牡丹品種的莖和根，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。膠孢炭疽菌自行從發(fā)病的牡丹葉片中分離獲得。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)(NA)培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、-1，3-葡聚糖培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉(CMC)培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基。

PKO培養(yǎng)基：10 g葡萄糖、5.0 g Ca(PO)、0.5 g (NH)SO、0.2 g NaCl、0.2 g KCl、0.03 g FeSO、0.03 g MgSO·7HO、0.03 g MnSO、20 g酵母膏、20 g瓊脂、1 L蒸餾水，pH 值為6.8～7.0。

阿須貝氏培養(yǎng)基：0.2 g KHPO、0.2 g MgSO、0.2 g NaCl、5 g CaCO、10 g甘露醇、0.1 g CaSO、18 g 瓊脂、1 L蒸餾水。

金氏(King)培養(yǎng)基：20 g蛋白胨、1.5 g MgSO、1.15 g KHPO、15 mL CHO、0.1 g-色氨酸、1 L 蒸餾水。

比色液：1.5 mL 0.5 mol/L FeCl、30 mL HSO、50 mL蒸餾水。

以上試劑均來(lái)自北京酷來(lái)博科技有限公司，細(xì)菌提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP302-02]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 內(nèi)生菌的分離 內(nèi)生菌的分離、純化參照了Zhao等的方法進(jìn)行，將平板上長(zhǎng)出的單菌落保存于試管斜面中備用。

1.2.2 內(nèi)生菌對(duì)牡丹炭疽病菌的拮抗篩選 采用五點(diǎn)對(duì)峙法測(cè)試內(nèi)生細(xì)菌對(duì)炭疽病的拮抗作用。將內(nèi)生細(xì)菌轉(zhuǎn)接于NA和R2A液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，制備拮抗菌菌懸液，備用。在炭疽菌菌落邊緣用打孔器取帶有菌絲的菌餅，并將其接入空白PDA平板正中央，同時(shí)以病原菌為中心，距離菌餅2.5 cm處，3個(gè)點(diǎn)上分別接入20 μL內(nèi)生細(xì)菌菌懸液。將只接入病原菌菌餅作為空白對(duì)照，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)7 d左右，待對(duì)照組的菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

內(nèi)生菌拮抗病原菌抑菌率按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液抑菌試驗(yàn) 將篩選出的最具拮抗作用的拮抗菌接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)3 d。將菌懸液分裝于離心管中，12 000離心10 min，上清液通過(guò)0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器。將拮抗菌株的無(wú)菌發(fā)酵上清液按4 ∶1的比例倒入 65 ℃ 固體培養(yǎng)基中并倒平板，將不加無(wú)菌發(fā)酵上清液作為對(duì)照；在平板中央接種牡丹膠孢炭疽菌菌餅(直徑6 mm)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照病原菌長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率。

采用離體牡丹葉片接種：從花卉基地的健康牡丹植株上選取長(zhǎng)勢(shì)一致的牡丹葉片。清水沖洗 1 min，用高溫消毒后的棉球蘸取75%的乙醇正反擦拭牡丹葉片，再用棉球蘸取無(wú)菌水進(jìn)行擦拭，用無(wú)菌發(fā)酵液浸泡牡丹葉片30 min，并用無(wú)菌水作對(duì)照，用針刺葉片造成傷口，并在傷口上接種牡丹炭疽病菌菌餅，菌絲面貼近傷口，每張葉片接種1個(gè)菌餅，將處理的葉片放于準(zhǔn)備好的保鮮盒中，每盒2張葉片，加無(wú)菌水至濾紙完全浸潤(rùn)，蓋上盒蓋，每個(gè)處理10張葉片，28 ℃下保濕培養(yǎng)，每天觀察接種傷口情況，并根據(jù)濾紙的保水情況增加無(wú)菌水以保證盒內(nèi)濕度。待病斑不再擴(kuò)大后，觀察記錄。牡丹葉片面積病變比例=(-)×100，其中：為對(duì)照組牡丹葉片病變面積；為發(fā)酵上清液處理組牡丹葉片病變面積。

1.2.4 優(yōu)良拮抗菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將純化后的優(yōu)良內(nèi)生拮抗細(xì)菌接于NA和R2A培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察描述菌落形態(tài)，18～24 h菌齡時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察。

分子生物學(xué)鑒定：細(xì)菌DNA按照細(xì)菌DNA快速提取試劑盒提供的方法進(jìn)行提取。PCR擴(kuò)增引物選用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′；1492R：5′-G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)委托北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行，將所得到的16S rDNA序列經(jīng)過(guò)校對(duì)與BLAST中的GenBank序列采用 MEGA4.0軟件以鄰接法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 促生能力測(cè)定 IAA(吲哚乙酸)分泌能力的測(cè)定參照Patten等的方法；溶磷能力測(cè)定參照許進(jìn)嬌等的方法；固氮能力測(cè)定參照崔月貞等的方法。

1.2.6 拮抗細(xì)菌代謝分泌物測(cè)定-1，3-葡聚糖酶活性測(cè)定：將篩選的優(yōu)良拮抗菌接種于-1，3-葡聚糖培養(yǎng)基中，每株拮抗菌3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng) 3 d。測(cè)定透明圈直徑與菌落的直徑，并計(jì)算其比值(值)。纖維素酶活性測(cè)定參照張平等的方法。蛋白酶活性測(cè)定：將拮抗菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基中，每株拮抗菌重復(fù)3次，28 ℃條件下培養(yǎng) 3 d。然后測(cè)定透明圈與菌落直徑，并計(jì)算其比值(值)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excle及SPASS 3.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹炭疽病菌拮抗菌的篩選

將分離出的細(xì)菌與牡丹炭疽病菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，共篩選出拮抗細(xì)菌9株(表1)。其中菌株 FJ1.3、ZJ1.5、XG1.4、ZJ1.4的抑菌效果最好，生長(zhǎng)抑制率分別為51.39%、48.15%、41.67%、36.11%。因此選用FJ1.3、ZJ1.5、XG1.4、ZJ1.4菌株為牡丹炭疽病菌拮抗優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌株。

表1 不同內(nèi)生菌菌株對(duì)病原菌的抑制效果

2.2 拮抗內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制

本試驗(yàn)通過(guò)菌絲抑制法，測(cè)定最具拮抗作用的4株拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用。結(jié)果表明(表2)，菌株FJ1.3的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌最具抑制作用，抑制率為35.13%，其次是菌株ZJ1.4，抑制率為34.54%。

表2 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制效果

優(yōu)良拮抗菌株對(duì)牡丹炭疽病菌的離體防效試驗(yàn)(表3)結(jié)果表明，菌株FJ1.3病斑顯著小于清水對(duì)照。接種5 d后，菌株FJ1.3對(duì)牡丹炭疽病的防效達(dá)到47.06%。其次為菌株ZJ1.4，防效為22.48%。

表3 拮抗菌對(duì)牡丹炭疽病的防治效果

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 4株優(yōu)良拮抗菌在37 ℃培養(yǎng)3 d后，4株菌株菌落形狀不規(guī)則，菌落不透明，菌株FJ1.3、ZJ1.5表面濕潤(rùn)無(wú)光澤，菌株ZJ1.4、XG1.4表面濕潤(rùn)有光澤，扁平，菌株ZJ1.5顏色為淺黃色，其余菌株均為白色(表4)。革蘭氏染色后，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，4株菌株都為革蘭氏陽(yáng)性菌。4株拮抗菌都符合芽孢桿菌屬()特征。

表4 株優(yōu)良拮抗菌的形態(tài)特征

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將4株優(yōu)良炭疽病菌拮抗菌進(jìn)行測(cè)序后，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖1)，菌株FJ1.3最相似菌株為枯草芽孢桿菌()，相似性為99.50%。菌株ZJ1.5最相似菌株為解淀粉芽孢桿菌()，其相似性為99.50%。菌株ZJ1.4最相似菌株為特基拉芽孢桿菌()，相似性為99.60%。菌株XG1.4最相似菌株為嗜堿芽孢桿菌()，相似性為96.33%。

2.4 拮抗菌促生潛能的測(cè)定

所篩選出的4株菌株在與比色液結(jié)合后呈現(xiàn)出不同深度的紅色，表明4株菌株均具備分泌IAA的能力，顏色越深，分泌IAA能力越強(qiáng)。菌株ZJ1.5分泌IAA能力最強(qiáng)，IAA濃度高達(dá)17.02 mg/L，菌株FJ1.3分泌IAA能力次之，為16.94 mg/L(表5)。篩選出的4株拮抗細(xì)菌在無(wú)氮培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng)，故都具有固氮能力(圖2)。4株拮抗細(xì)菌在PKO培養(yǎng)基上生長(zhǎng)無(wú)明顯溶磷圈，表明其不具備溶磷能力(圖3)。

表5 拮抗細(xì)菌分泌IAA能力測(cè)定

2.5 拮抗細(xì)菌代謝分泌物的測(cè)定

拮抗細(xì)菌ZJ1.5、FJ1.3、ZJ1.4、XG1.4生長(zhǎng)過(guò)程中都具有產(chǎn)蛋白酶的能力(圖4)，酶產(chǎn)量最高的為菌株ZJ1.5，其透明圈直徑與菌落直徑的比值達(dá)到5.67(表6)。在CMC培養(yǎng)基上，3株菌株ZJ1.5、ZJ1.4、FJ1.3均能生長(zhǎng)出菌落，并使菌落周圍的剛果紅顏色消失而形成透明圈(圖5)，其中酶產(chǎn)量最高的為菌株FJ1.3，其透明圈直徑與菌落直徑的比值達(dá)到22.50(表7)。在-1，3-葡聚糖培養(yǎng)基上，4株菌株均不能使培養(yǎng)基中的藍(lán)色消失，表明4株菌株均不能產(chǎn)生-1，3-葡聚糖酶(圖6)。

表6 拮抗菌株產(chǎn)蛋白酶的測(cè)定結(jié)果

表7 拮抗菌株產(chǎn)纖維素酶的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 內(nèi)生細(xì)菌的促生作用

由于植株內(nèi)部環(huán)境條件不易受改變，容易定殖，不易受到外界環(huán)境因素的影響，漫長(zhǎng)的進(jìn)化選擇使植株體內(nèi)的組分相對(duì)固定。Gaiero等研究發(fā)現(xiàn)，植株內(nèi)生和根際微生物可以通過(guò)溶磷、固氮、分泌IAA等方式直接影響植物的新陳代謝，從而對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。目前研究者從多種植物體內(nèi)都分離出對(duì)植株具有促生作用的內(nèi)生細(xì)菌，如黃瓜內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌可通過(guò)固氮和產(chǎn)鐵載體的作用來(lái)促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)；野大豆內(nèi)生細(xì)菌普羅威登斯菌屬()具有溶磷能力，溶磷量為46 mg/L，且具有產(chǎn)IAA能力，達(dá)到19.97 mg/L，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基(ACC)脫氨酶活性達(dá)到8.59 μmol/(mg·h)，菌株處理小麥10 d后，促生效果最顯著，株高、根長(zhǎng)、葉干質(zhì)量與根干質(zhì)量分別增加58.46%、81.89%、54.87%、29.9%。

本試驗(yàn)篩選的優(yōu)良菌株都可產(chǎn)生IAA和固氮能力，但都不具有溶磷能力。在本試驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)菌株分泌IAA的量存在差異。本試驗(yàn)菌株ZJ1.5最相似菌株為解淀粉芽孢桿菌，產(chǎn)生IAA量最高，達(dá)17.02 mg/L，其次為菌株FJ1.3，其最相似菌株為枯草芽孢桿菌，產(chǎn)IAA量為16.94 mg/L，但兩者之間產(chǎn)IAA量差異不顯著。從野大豆中分離出的內(nèi)生細(xì)菌假單胞菌(sp.)產(chǎn)IAA為19.97 μg/mL，對(duì)水稻幼苗具有明顯的促進(jìn)作用。這些研究與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明宿主植物內(nèi)定殖了大量產(chǎn)生IAA的內(nèi)生菌資源。劉麗輝等從南方野水稻中分離出的內(nèi)生細(xì)菌織片草螺菌()產(chǎn)IAA能力高達(dá)29.97 mg/L，固氮酶活性高達(dá)494.14 nmol/mL，有力地支持了本研究結(jié)果。

3.2 內(nèi)生細(xì)菌的拮抗作用

植物與微生物關(guān)系緊密，通過(guò)構(gòu)建根際微生物區(qū)系，植物根部分泌的代謝物可驅(qū)使植物生長(zhǎng)和發(fā)生防御反應(yīng)，而細(xì)菌基因組特性決定了其對(duì)宿主的適應(yīng)性。近年來(lái)，利用植物內(nèi)生菌來(lái)抑制植物病原微生物進(jìn)行生物防治的研究在國(guó)內(nèi)外已展開，這些研究為牡丹炭疽病的生物防治提供了新的思路和借鑒。本研究從牡丹的根和莖中分離出了64株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)過(guò)篩選測(cè)試，牡丹內(nèi)生菌菌株FJ1.3、ZJ1.4、ZJ1.5、XG1.4對(duì)牡丹炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。抑菌率在36%以上，其中 FJ1.3 的抑菌率達(dá)到51.39%。無(wú)菌發(fā)酵液試驗(yàn)中抑菌率最高的菌株為FJ1.3，達(dá)到35.13%，其次是菌株ZJ1.4，抑菌率為34.54%。在離體葉片防效試驗(yàn)中防治效果最佳的菌株為FJ1.3，防效為47.06%。牡丹內(nèi)生菌接種處理牡丹炭疽病菌，出現(xiàn)抑制炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的現(xiàn)象，可能原因是內(nèi)生菌與病原菌對(duì)峙過(guò)程中產(chǎn)生了化感物質(zhì)及胞外代謝產(chǎn)物，如解毒酶、水解酶類等。陳思宇等的研究支持這個(gè)解釋，水稻紋枯病菌拮抗細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶和嗜鐵素對(duì)水稻紋枯病菌產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)初步探究了拮抗牡丹炭疽病菌的內(nèi)生細(xì)菌的代謝分泌物。4株優(yōu)良拮抗細(xì)菌都具有分泌蛋白酶和纖維素酶的能力，而不具有分泌-1，3-葡聚糖酶的能力。Kamensky等研究支持了這一結(jié)論，發(fā)現(xiàn)蛋白酶能夠?qū)瞬『突颐共‘a(chǎn)生抑制作用。Singh等研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌產(chǎn)生-1，3-葡聚糖酶，可破壞枯萎病病原菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致菌絲自溶、斷裂。本研究?jī)H對(duì)內(nèi)生菌代謝分泌物進(jìn)行初步探索，對(duì)內(nèi)生菌代謝酶活性還需進(jìn)一步探索。