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        兔出血癥病毒2型SC株VP60基因工程疫苗研制及其與傳統(tǒng)兔出血癥病毒疫苗的交叉保護(hù)作用

        2022-08-26 07:02:00宋艷華范志宇魏后軍陳萌萌仇汝龍徐為中
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年16期

        宋艷華, 胡 波, 范志宇, 魏后軍, 陳萌萌, 仇汝龍, 徐為中, 王 芳

        (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014)

        兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)屬于杯狀病毒科兔病毒屬。該病毒引起的兔出血癥以高感染率和死亡率為特征,嚴(yán)重阻礙養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展,并對(duì)公共衛(wèi)生安全存在潛在威脅。RHDV分為經(jīng)典毒株GI.1(RHDV1)和變異毒株GI.2(RHDV2)2種基因型,GI.1又分為GI.1a、GI.1b、GI.1c和GI.1d等4種亞型。2010年 GI.2 首先在法國(guó)暴發(fā),隨后在歐洲、非洲、澳大利亞和美洲流行,且RHDV2有逐漸替代經(jīng)典RHDV毒株成為主要流行毒株的趨勢(shì)。OIE認(rèn)定RHDV2型毒株為兔出血癥病毒的第二個(gè)血清型。2020年筆者所在團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了GI.2(RHDV2)在我國(guó)暴發(fā),該毒株與中國(guó)GI.1型RHDV毒株的同源性低于85%,在致病性方面,與RHDV1相比,RHDV2更具危害性,不僅能夠感染不同日齡的家兔,還能感染不同品種的野兔,感染兔病死率可達(dá)90%。在遺傳特性及抗原性方面,RHDV2與RHDV1也存在較大差異,傳統(tǒng)毒株的疫苗對(duì)新型RHDV2毒株的交叉保護(hù)作用較弱,自2020年至今,RHDV2已在我國(guó)廣泛流行,嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)。本研究獲得表達(dá)我國(guó)RHDV2 SC毒株VP60蛋白的重組桿狀病毒,并以該毒種為疫苗毒種研制獲得RHDV2 SC株基因工程疫苗。

        1 材料與方法

        1.1 菌毒種

        兔出血癥病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)和兔出血癥病毒1型WF株,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存;大腸桿菌DH10Bac、Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

        1.2 主要試劑

        總RNA提取試劑RNAiso Regent、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RⅠ酶、dⅢ酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基IB905;RHDV單克隆抗體6B3由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

        1.3 RHDV2 VP60基因的擴(kuò)增

        根據(jù)兔出血癥病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)的基因序列,設(shè)計(jì)引物序列:設(shè)計(jì)合成上游引物P1:5′-A T A G A A T T C A T G G A G G G C A A A G C C C G C-3′;下游引物P2:5′-G C A A G C T T T C A G A C A T A A G A A A A A C-3′。上游引物引入RⅠ酶切位點(diǎn),下游引物引入dⅢ酶切位點(diǎn)。抽提RHDV2的病毒RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以cDNA為模板,利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因,最終利用核酸電泳鑒定目的條帶。

        1.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1-RHDV2-VP60的構(gòu)建及鑒定

        利用RⅠ和dⅢ分別酶切pFastBac1和 目的基因,T連接酶將載體與目的基因進(jìn)行連接,連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,涂布平板,挑取單菌落,抽提重組質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定,最終獲得含有目的基因的重組轉(zhuǎn)移載體,命名為:pFastBac1-RHDV2-VP60。

        1.5 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

        將上述獲得的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至DH10Bac中,取適量培養(yǎng)菌液涂于含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素以及-和IPTG的平板上,培養(yǎng)2 d后,挑取白色的單菌落,再次接種相同條件平板上進(jìn)行菌落純化,再次挑取白色單菌落,接種于含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 振搖培養(yǎng)24 h,抽提重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒,并以通用pUC/M13上、下游引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,命名為Bacmid-RHDV2-。

        1.6 重組RHDV2 VP60桿狀病毒的獲得

        利用轉(zhuǎn)染試劑將Bacmid-RHDV2-VP60轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)約80%的單層昆蟲(chóng)細(xì)胞,培養(yǎng)3 d,逐日觀察病變情況,待細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后,收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,獲得重組桿狀病毒原液。

        1.7 重組RHDV2 VP60蛋白的表達(dá)及鑒定

        1.7.1 Western blot鑒定 對(duì)制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印和免疫印跡分析,并以接種野生型桿狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物為空白對(duì)照,利用抗RHDV2特異性單抗6B3為一抗,羊抗鼠HRP-IgG為二抗,對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

        1.7.2 血凝效價(jià)檢測(cè) 對(duì)制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行血凝效價(jià)檢測(cè),按照紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)96孔試驗(yàn)操作測(cè)定重組蛋白的血凝效價(jià)。

        1.7.3 電鏡觀察 對(duì)制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,將樣品置于銅網(wǎng)靜置2 min,再加入2%磷鎢酸染液進(jìn)行固定,最后利用透射電鏡觀察和拍照。

        1.8 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的制備

        利用懸浮培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),接種重組桿狀病毒,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和病變進(jìn)程,病變細(xì)胞數(shù)量達(dá)約85%時(shí)取樣,利用凝集試驗(yàn)和Western blot方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。根據(jù)血凝效價(jià)水平,取適量重組蛋白,并按照抗原 ∶氫氧化鋁膠質(zhì)量比9 ∶1配制疫苗,最終獲得RHDV2 SC株基因工程疫苗。用同樣的方法制備抗原含量相同的傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗,用于評(píng)價(jià)交叉保護(hù)作用。

        1.9 疫苗的免疫效力評(píng)價(jià)

        選用兔出血癥病毒抗原、抗體均為陰性的2~3月齡家兔60只,設(shè)置免疫4組,對(duì)照2組,10只/組。取免疫組2組,對(duì)照組1組,分別接種RHDV2 SC株基因工程疫苗1.0 mL/只,傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只,對(duì)照接種生理鹽水1.0 mL/只,分別于免疫后21 d,頸部皮下注射兔出血癥病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD),觀察7 d。另取免疫組2組,對(duì)照組1組,分別接種RHDV2 SC株基因工程疫苗 1.0 mL/只,傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只,對(duì)照接種生理鹽水1.0 mL/只,分別于免疫后21 d,頸部皮下注射兔出血癥病毒1型WF株1.0 mL(含病毒 1 000 LD),觀察7 d。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定

        利用PCR擴(kuò)增獲得RHDV2-基因(圖1),并成功克隆至pFastBac1質(zhì)粒中。構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pFastBac1-SC-VP60,雙酶切鑒定結(jié)果顯示,分別以RⅠ和dⅢ進(jìn)行酶切,結(jié)果顯示,酶切后出現(xiàn)4 800 bp和1 740 bp左右的2個(gè)片段(圖2),說(shuō)明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。

        2.2 重組穿梭質(zhì)粒的PCR鑒定

        利用重組Bacmid DNA為模板,利用pUC/M13上、下游引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4 300 bp (陽(yáng)性大小為2 560 bp+目的基因),證明轉(zhuǎn)座成功,重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SC-VP60構(gòu)建成功(圖3)。

        2.3 重組兔出血癥病毒2型VP60桿病毒的獲得

        將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SC-VP60轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,培養(yǎng)3 d后,逐日觀察病變情況,直至細(xì)胞出現(xiàn)典型變大變圓的病變特征,同時(shí)對(duì)照細(xì)胞正常生長(zhǎng)時(shí),收獲重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒,命名為rBAC-RHDV2-VP60株。

        2.4 重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒的鑒定

        2.4.1 Western blot鑒定 以抗RHDV2 特異性單抗6B3為一抗,結(jié)果提示重組桿狀病毒接種昆蟲(chóng)細(xì)胞后,表達(dá)獲得了特異性重組蛋白VP60,大小為 60 ku(圖4)。同時(shí),接種野生型桿狀病毒的細(xì)胞產(chǎn)物無(wú)特異性條帶,結(jié)果提示VP60蛋白獲得有效表達(dá)。

        2.4.2 紅細(xì)胞凝集效價(jià)測(cè)定 接種重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,測(cè)定紅細(xì)胞凝集效價(jià),結(jié)果顯示,表達(dá)獲得的重組蛋白對(duì)人的紅細(xì)胞凝集效價(jià)結(jié)果為1 ∶4 096。

        2.4.3 電鏡觀察 重組桿狀病毒接種昆蟲(chóng)細(xì)胞后,表達(dá)獲得高水平的重組蛋白,該蛋白可形成大小約36 nm、形態(tài)和結(jié)構(gòu)類(lèi)似天然病毒RHDV2的病毒樣顆粒(圖5)。

        2.5 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的免疫效力檢測(cè)

        利用RHDV2 SC株基因工程疫苗和傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗分別免疫實(shí)驗(yàn)兔,免疫后21 d,攻毒兔出血癥病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD),結(jié)果(表1)顯示,對(duì)照組兔全部死亡,免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔全部健康存活,免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗兔死亡6只,保護(hù)率僅為40%。

        表1 疫苗免疫保護(hù)效果檢測(cè)(SC株攻毒)

        免疫后21 d,攻毒兔出血癥病毒1型WF株 1.0 mL(含病毒1 000 LD),結(jié)果(表2)顯示,免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗兔全部健康存活,對(duì)照組兔全部死亡;免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔死亡7只,保護(hù)率僅為30%。 結(jié)果說(shuō)明RHDV2 SC株基因工程疫苗能夠有效保護(hù)兔出血癥病毒2型SC株的攻擊,而傳統(tǒng)RHDV型WF株疫苗不能對(duì)國(guó)內(nèi)流行毒株RHDV2 SC毒株產(chǎn)生有效的免疫保護(hù),RHDV2 SC株基因工程疫苗也不能對(duì)國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)RHDV毒株產(chǎn)生有效的免疫保護(hù),兩型毒株間交叉保護(hù)作用較低。

        表2 疫苗免疫保護(hù)效果檢測(cè)(WF株攻毒)

        3 討論與結(jié)論

        當(dāng)前新型RHDV2毒株已經(jīng)在全國(guó)多地流行和暴發(fā),變異毒株與RHDV傳統(tǒng)毒株在遺傳特性、免疫保護(hù)相關(guān)基因、對(duì)宿主的易感性等方面均發(fā)生了高度的變異,新型毒株能夠逃逸傳統(tǒng)毒株誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答,且與RHDV傳統(tǒng)毒株相比,新型毒株感染宿主譜更廣,并出現(xiàn)了跨宿主傳播的現(xiàn)象。RHDV具有高度變異的特點(diǎn),同時(shí)也具有毒株間高頻的基因重組特性,因此,該病毒對(duì)公共衛(wèi)生安全存在重大的潛在威脅,加強(qiáng)病毒的監(jiān)測(cè)對(duì)維護(hù)養(yǎng)兔生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

        兔出血癥以高發(fā)病率高死亡率為特征,死亡率高達(dá)90%。自2010年RHDV2首次在法國(guó)報(bào)道后,研究已證實(shí)經(jīng)典型RHDV的疫苗不能夠?qū)HDV2毒株提供有效的交叉保護(hù)作用,因此急需研制高效的針對(duì)我國(guó)流行毒株RHDV2型的疫苗。研究構(gòu)建重組RHDV2 SC毒株VP60桿狀病毒,并以此重組桿狀病毒為疫苗毒種,制備獲得到了兔RHDV2 SC株基因工程疫苗。疫苗的免疫效力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RHDV2 SC株基因工程疫苗對(duì)RHDV2的保護(hù)效力為100%,具有良好的免疫效力。然而免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗的保護(hù)率僅為40%,本研究研制的基因工程疫苗對(duì)防控我國(guó)目前流行的RHDV2型毒株方面具有重要的意義,能夠保證我國(guó)家兔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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