鄭 玲， 李夢丹

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽 471934)

轉(zhuǎn)錄因子是一類DNA蛋白復(fù)合體，其可與目的基因啟動(dòng)子部位的元件產(chǎn)生特異性聯(lián)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。Trihelix是植物特有的一種轉(zhuǎn)錄因子，因其含Trihelix結(jié)構(gòu)域而獲名，參與光響應(yīng)、環(huán)境調(diào)節(jié)和植株生長發(fā)育等一系列生命活動(dòng)，Trihelix也被稱為GT家族。

Trihelix含有3個(gè)保守域，分別是Trihelix保守結(jié)構(gòu)域、第四α螺旋和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。Trihelix保守結(jié)構(gòu)域的3個(gè)串聯(lián)的α-螺旋能形成螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)和MYB家族3個(gè)α螺旋構(gòu)成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)相似，所以通常認(rèn)為Trihelix家族源于一個(gè)MYB-like基因。Trihelix家族根據(jù)其功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸不同被分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1等5個(gè)亞族。此家族每個(gè)亞族的結(jié)構(gòu)域都十分保守，每個(gè)α螺旋均有1個(gè)保守的色氨酸。每個(gè)亞族間卻不同，GT-2亞族的N、C端分別有1個(gè)Trihelix保守結(jié)構(gòu)域，GT-2C、SH4及GT-1亞族中的Trihelix結(jié)構(gòu)域內(nèi)部疏水區(qū)都有1個(gè)色氨酸殘基。GTγ亞族中有1個(gè)第四α螺旋和N端Trihelix結(jié)構(gòu)域，SH4亞族無前者，即(F/Y)-(F/Y)-X-X-(L/I/M)-X-X-(L/I/M)保守序列，其余Trihelix亞家族均含有此結(jié)構(gòu)域。異亮氨酸存在于SIP1亞族Trihelix結(jié)構(gòu)域的第3個(gè)疏水區(qū)。Trihelix家族C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，亞族間區(qū)別較大，但亞族內(nèi)部保守，一般與二聚化或多聚化有關(guān)。

關(guān)于Trihelix家族的研究表明，擬南芥()有34個(gè)Trihelix家族成員，而水稻()有41個(gè)、番茄()有36個(gè)、谷子()有34個(gè)、蘋果(Mill.)有39個(gè)、辣椒()有28個(gè)、葡萄()有27個(gè)等。

甜瓜()為葫蘆科甜瓜屬，是主要的園藝作物之一，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。甜瓜全基因組測序的完成為對甜瓜功能基因組進(jìn)行深入研究提供了數(shù)據(jù)支持。但目前還沒有關(guān)于甜瓜Trihelix家族的研究報(bào)道。本研究以甜瓜的基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對其Trihelix家族進(jìn)行鑒定，分析該家族的基本信息、進(jìn)化關(guān)系、位置信息、表達(dá)模式和順式元件等，為進(jìn)一步探究該家族的基因功能提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜瓜Trihelix家族的鑒定

本試驗(yàn)的研究對象是甜瓜，于2020年3—6月在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室(214室)計(jì)算機(jī)上進(jìn)行軟件操作和信息處理：在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)PlantTFDB(http：//planttfdb.gao-lab.org/)中分別獲取甜瓜及擬南芥(34個(gè))Trihelix家族的氨基酸序列；在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站ICuGI(http：//cucurbitgenomics.org/)中獲取甜瓜基因組數(shù)據(jù)信息，并利用甜瓜Trihelix家族序列對其基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，得到候選蛋白序列，以PF13837為探針進(jìn)行搜索鑒定；隨后利用InterPro在線程序軟件對下載的甜瓜Trihelix序列進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)其是否含有Trihelix結(jié)構(gòu)域，最終得到26個(gè)含有完整結(jié)構(gòu)域的候選Trihelix序列；利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam工具(https：//web.expasy.org/protparam/)分析甜瓜每個(gè)候選Trihelix家族成員蛋白質(zhì)序列的長度、理論等電點(diǎn)、分子量等基本信息，利用Plant-PLoc網(wǎng)站(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plan-t/？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 甜瓜Trihelix基因家族在染色體上的定位

將甜瓜Trihelix家族基因的蛋白質(zhì)序列在Melonet DB(https：//melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/top)中進(jìn)行檢索，得到基因在染色體上的位置信息，再利用MapInspect軟件將基因位置信息在染色體上進(jìn)行定位，并繪制物理圖譜。

1.3 甜瓜Trihelix家族進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 MEGA 6.0軟件里的Clustal W工具對擬南芥、甜瓜共計(jì)60個(gè)Trihelix氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，利用 MEGA 6.0 軟件 Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)分析

在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫中獲得甜瓜基因組信息，依次檢索出相對應(yīng)的CDS序列和GENE序列，利用GSDS 2.0(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)網(wǎng)站進(jìn)行分析，生成甜瓜Trihelix家族基因的外顯子-內(nèi)含子圖像。甜瓜Trihelix家族基因的保守基序采用在線工具M(jìn)EME(http：//meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行預(yù)測，保守基序數(shù)目設(shè)置為10。將下載的結(jié)果利用TBtools軟件的Redraw Motif Pattern工具進(jìn)行分析，生成圖像。

1.5 甜瓜Trihelix基因家族的啟動(dòng)子分析

從甜瓜基因數(shù)據(jù)庫中下載Trihelix家族基因啟動(dòng)子序列(起始密碼子上游2 000 bp)，采用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool-s/plantcare/html/)進(jìn)行分析，得出其中的順式作用元件相關(guān)數(shù)據(jù)。利用GSDS2.0網(wǎng)站(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終得到順式作用元件圖譜。

1.6 甜瓜Trihelix基因家族的表達(dá)模式分析

在Melonet DB(https：//melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/top)根據(jù)基因登錄號檢索出每個(gè)CDS序列編碼出的蛋白質(zhì)在植株各部位及相同部位各生長時(shí)段的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜Trihelix家族的鑒定

本研究共鑒定到26個(gè)甜瓜Trihelix家族成員，在ProtParam和Plant-PLoc網(wǎng)站分別檢索出CmGT基因家族蛋白質(zhì)序列的長度、分子量、理論等電點(diǎn)和亞細(xì)胞定位等信息。26個(gè)甜瓜Trihelix家族基因按照下載的蛋白質(zhì)原始序列順序，依次命名為～，蛋白質(zhì)長度介于279aa()～927aa()之間；分子量范圍為 33 225.58()～102 712.52()；等電點(diǎn)范圍4.81()～9.80()，其中17個(gè)小于7，富含酸性氨基酸，其余9個(gè)大于7，富含堿性氨基酸；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)定位于線粒體和細(xì)胞核，定位于線粒體和葉綠體，僅定位于葉綠體，、、、和僅定位于細(xì)胞核，其余18個(gè)都定位于線粒體。

2.2 甜瓜Trihelix基因家族的染色體定位

由圖1可知，甜瓜26個(gè)Trihelix基因不均勻地分布于12條染色體上；每條染色體上的基因數(shù)為 1～5個(gè)，其中Chr4上基因數(shù)目最多(5個(gè))，其次是Chr1與Chr3(4個(gè))，Chr10上含有3個(gè)基因，Chr2和Chr11上僅含有2個(gè)基因，其余染色體上均含有1個(gè)基因；另外Chr4上出現(xiàn)了基因簇現(xiàn)象。

2.3 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3.1 甜瓜與擬南芥Trihelix系統(tǒng)進(jìn)化樹 根據(jù)擬南芥Trihelix家族的分類標(biāo)準(zhǔn)，將甜瓜Trihelix家族也分為5個(gè)亞族(圖2)，依次為GT-2亞族、GT-1亞族、SH4亞族、GTγ亞族和SIP1亞族，分別包括7、5、3、3、8個(gè)基因?；谙到y(tǒng)進(jìn)化樹，確定了12對姐妹基因，分別是SIP1亞家族中的6對；SH4亞家族中的2對；GT-1亞家族中的2對；GTγ亞家族中的1對；GT-2亞家族中的3對。還可看出甜瓜Trihelix家族存在1對同源旁系基因和。

2.3.2 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)分析 由圖 3-B 可知，在26個(gè)甜瓜Trihelix家族基因中，GT-2亞族除外均有1個(gè)內(nèi)含子；GT-1亞族中，有17個(gè)內(nèi)含子，有4個(gè)內(nèi)含子，其他基因皆僅有1個(gè)內(nèi)含子；GTγ亞族和SIP1亞族中、、和均無內(nèi)含子，SH4亞族內(nèi)含子數(shù)量為2～3個(gè)不等，SIP1亞族中為0～6個(gè)。

2.3.3 甜瓜Trihelix基因家族的的保守基序分析 26個(gè)甜瓜Trihelix序列中保守基序的數(shù)量和種類差異較大(圖3-C)。所有的序列都含有Motif1。除、、外所有的序列都含有Motif2。Motif4及Motif5僅出現(xiàn)在GT-2亞族中。Motif6存在于除、外的所有序列中。Motif7及Motif3僅在GT-2和GT-1亞族的部分成員中出現(xiàn)。SH4亞族無Motif8，GT-1及 GT-2 亞族中均無Motif9，GTγ、SH4及SIP1亞族中均未出現(xiàn)Motif10。GT-2亞族中出現(xiàn)較多種類的Motif基序。、及具有相同種類的Motif基序。僅有Motif10、Motif6、Motif1、Motif8 4種基序，和其他序列差別較大。

2.4 甜瓜Trihelix基因家族的啟動(dòng)子元件分析

在甜瓜Trihelix家族中鑒定到多種響應(yīng)激素和環(huán)境信號的順式作用元件(圖4)。光響應(yīng)元件(G-box和G-Box)、脫落酸信號響應(yīng)元件(ABRE)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif)在各亞族中均有分布；GT-2、GT-1 和SIP1亞族里的9個(gè)基因中均出現(xiàn)了低溫響應(yīng)元件(LTR)；MBS為干旱響應(yīng)元件，主要出現(xiàn)于SIP1、GTγ及GT-2亞家族；在13個(gè)基因中出現(xiàn)了生長素響應(yīng)元件(TCA-element)；20個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了缺氧信號響應(yīng)元件(ARE)；、、、和、中皆發(fā)現(xiàn)了茉莉酸、光、脫落酸信號、乙烯4種響應(yīng)元件。

2.5 甜瓜Trihelix基因家族的表達(dá)模式分析

熱圖(圖5)顯示，種子經(jīng)過吸水后，的表達(dá)量明顯下調(diào)，、、、、和則呈現(xiàn)不同程度上調(diào)，推測這些基因可能與早期種子的萌發(fā)有關(guān)。和在果實(shí)發(fā)育的過程中表達(dá)量明顯上調(diào)，推測其與果實(shí)的發(fā)育有關(guān)。SH4亞族的在采摘1～4周后的果實(shí)和外果皮中顯著表達(dá)，SIP1亞族的絕大多數(shù)成員(除和)在果實(shí)成熟過程中均呈現(xiàn)較高表達(dá)量，推測這些成員與乙烯、脫落酸(果實(shí)成熟相關(guān)的激素)的合成相關(guān)，與之相似的還有GTγ亞族的和，GT-1亞族的。GT-2亞家族中的、和基因在雌花的幼根、花藥和雌花中表達(dá)水平較高，推測該亞族在調(diào)節(jié)花和根的成長方面占據(jù)重要地位。SIP1亞族中大多數(shù)成員(除和)在幾乎所有的組織中都呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，推測該亞族的大多數(shù)基因在幼苗、根、莖、葉、花、果實(shí)等生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均具有重要的作用。

3 討論與結(jié)論

本研究對甜瓜的Trihelix家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，共鑒定了26個(gè)Trihelix家族成員。這些基因多數(shù)定位于線粒體中，不均勻地分布于12條染色體上，Chr4上出現(xiàn)基因簇現(xiàn)象。此家族被分為 GT-2、GT-1、GTγ、SH4、SIP1 5個(gè)亞族，確定了12對姐妹基因，1對同源旁系基因。擬南芥與甜瓜Trihelix家族共同構(gòu)建的進(jìn)化樹中，和位于同一分支，參與干旱和寒冷等逆境脅迫應(yīng)答，可推測也具有此功能；和位于同一分支，(ASIL2)作用于營養(yǎng)器官的各部分，在種子中作用效果更為明顯，推測也可能參與了營養(yǎng)器官和種子的生長發(fā)育過程。

本研究在甜瓜Trihelix家族成員中發(fā)現(xiàn)大量與光響應(yīng)有關(guān)的順式元件(G-box和G-Box)，推測甜瓜Trihelix家族與光響應(yīng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。這與Park等、Nagano等與Wang等的相關(guān)研究一致。當(dāng)受到冷害、鹽以及ABA脅迫時(shí)，擬南芥基因在植物體內(nèi)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。谷子Trihelix家族可能參與了調(diào)節(jié)各種非生物脅迫和激素的處理。黃禮鴻等的研究表明，番茄Solyc09g015150和Solyc12g05651受多種非生物脅迫和激素的調(diào)控。棉花Trihelix家族SH4亞族調(diào)控基因表達(dá)響應(yīng)了干旱、低溫、高鹽和ABA處理。葡萄Trihelix家族的GT-2亞族與干旱脅迫有密切關(guān)系。水稻中OsGTγ-1過量表達(dá)對其提高鹽脅迫抗性具有明顯作用。甜瓜Trihelix家族的SIP1和GT-2亞族中出現(xiàn)大量干旱、低溫和缺氧信號等響應(yīng)元件，推測SIP1和GT-2亞族在植株應(yīng)對缺氧、低溫和干旱等逆境環(huán)境的調(diào)節(jié)方面起到十分關(guān)鍵的影響。另外此家族啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件還包括脫落酸信號、乙烯、生長素和茉莉酸等響應(yīng)元件。脫落酸和茉莉酸可以誘導(dǎo)植株抗旱性、抗寒性、抗病性和耐鹽性的產(chǎn)生，乙烯會(huì)促進(jìn)果實(shí)成熟，生長素則可以促進(jìn)植株成長。故推測Trihelix家族在植物逆境脅迫調(diào)節(jié)和生長發(fā)育等方面起到十分關(guān)鍵的作用。

擬南芥中基因?qū)儆贕T-2亞家族，通常表達(dá)于花萼原基發(fā)生時(shí)期，在囊胚發(fā)育中也起著重要作用。同為GT-2亞家族的()可以抑制擬南芥腺毛狀體發(fā)育過程中倍性細(xì)胞的增長。相似的，本研究發(fā)現(xiàn)甜瓜Trihelix家族中的GT-2亞族在調(diào)節(jié)根和花的生長發(fā)育方面占據(jù)重要地位。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，SIP1亞族的大部分成員在甜瓜營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這與“SIP1亞族的參與植株早期胚胎發(fā)育”的推測一致。順式作用元件分析中，SH4亞族的和SIP1亞族的絕大多數(shù)成員與乙烯、脫落酸等相關(guān)激素的合成有關(guān)，而表達(dá)模式分析也表明，這些基因在果實(shí)成熟的過程中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，Trihelix家族普遍參與植株成長的各個(gè)過程，在營養(yǎng)生長和生殖生長過程中都可能具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。