凌 琳 游麗娟 袁 葵

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明，以慢性復發(fā)性腸道炎癥為主要特征的疾病，UC患者常出現(xiàn)腹瀉、營養(yǎng)不良、腹腔內(nèi)膿腫和腸道狹窄等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。由于UC病因不明，臨床上主要使用免疫抑制劑或生物制劑來緩解UC患者癥狀[2-3]，需要識別UC發(fā)病機制以尋找新的治療方法。微小RNAs(miRNAs)是一類長度在19～25個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因結(jié)合參與多種病理生理過程[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-190能顯著減少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的結(jié)腸上皮細胞的炎癥因子分泌和細胞凋亡。但是miR-548a-3p在LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞中作用以及相關(guān)機制報道較少。基于此，本研究將miR-548a-3p模擬物和miR-548a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染進LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞，觀察miR-548a-3p對結(jié)腸上皮細胞炎癥因子分泌、增殖和凋亡的影響，并進一步識別miR-548a-3p的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年1月至2020年5月南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院35例UC患者的腸道黏膜組織，所有患者均經(jīng)腸鏡及病理學檢查確診為活動期UC患者，其中男性20例，女性15例，年齡36～57歲。對照組選自該院接受腸鏡檢查并進行腸道黏膜組織活檢的健康體檢者，其中男性20例，女性15例，年齡38～59歲。所有組織樣本獲取后立即置于液氮保存。排除標準：近期服用過抗炎藥、有嚴重肝腎功能障礙者。結(jié)腸上皮細胞NCM460和上皮細胞培養(yǎng)基購于上海盈灣生物科技有限公司；miR-548a-3p模擬物、miR-548a-3p抑制劑和陰性對照購于上海吉滿生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購于美國賽默飛世爾科技公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)、人類TNF-α ELISA Kit、人類IL-8 ELISA Kit和一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗兔多克隆抗體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、兔單抗B細胞淋巴瘤/白血病-2基因-相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 gene-associated X protein-associated X protein，Bax)、兔單抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、兔單抗磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和二抗山羊抗兔IgG (H+L)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司?；颊邩颖镜氖占褪褂媒?jīng)南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批號：ZLC20181205)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將結(jié)腸上皮細胞NCM460細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期NCM 460細胞，以2×103個/孔的密度接種于6孔板上，將NCM 460細胞分為對照組、LPS組、miR-NC組、miR-548a-3p mimics組、miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4組。對照組不做任何處理；LPS組使用含50 μg/mL LPS的上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-NC組、miR-548a-3p mimics組、miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4組中將miR陰性對照序列，miR-548a-3p模擬物、miR-548a-3p抑制劑、miR-548a-3p模擬物和TLR4過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進NCM460細胞，隨后給予LPS處理。

1.3 qRT-PCR檢測miR-548a-3p的表達 使用Trizol試劑提取組織和細胞總RNA，再將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在-20℃條件下保存。以U6小核1 (U6 small nuclear 1, U6)為內(nèi)參檢測miR-548a-3p的表達。PCR反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，73℃ 10 s共40個循環(huán)，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖情況 轉(zhuǎn)染48 h后，取對數(shù)生長期的細胞，以1×103個/孔的密度接種于96孔板上。分別在24、48和72小時于每孔滴加15 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定每孔細胞在450 nm處的吸光度(A)值。

1.5 ELISA法檢測細胞炎癥因子分泌情況 按說明書制備標準品，于每孔滴加50 μL檢測緩沖液，分別加入標準品、對照品和收集的各組細胞上清液，然后加入檢測抗體，封板膜封閉，于37 ℃下孵育，2 h后洗板，加入100 μL二抗，封板膜封閉，37 ℃孵育45 min，洗板，每孔加3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine，TMB)顯色液80 μL，于37 ℃避光反應15 min，最后于每孔加終止液100 μL，用酶標儀測量光密度(optical density，OD)值。根據(jù)標準曲線和樣品的OD值，計算各炎癥因子濃度。

1.6 TUNEL檢測細胞凋亡情況 取各組對數(shù)期生長細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌，用4 %多聚甲醛固定60 min，PBS洗滌1次，用含0.3 % Triton X-100的PBS重懸細胞，5 min后向每個樣品加50 mL TUNEL檢測液，在37 ℃下避光孵育60 min，孵育結(jié)束后，PBS洗滌，用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4, 6-amidine-2-phenylindole，DAPI)染色后在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡數(shù)量和總細胞數(shù)量，采用TUNEL末端標記法計算細胞凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-548a-3p與TLR4的靶向關(guān)系 根據(jù)Star Base在線數(shù)據(jù)庫檢測miR-548a-3p與TLR4的結(jié)合位點，將吉滿生物技術(shù)有限公司合成的TLR4 3’UTR-WT和TLR4 3’UTR-MUT，分別與miR-548a-3p mimics或miR-NC(miR陰性對照序列)通過脂質(zhì)體2000(lipofectamine 2000)共轉(zhuǎn)染入細胞。48 h后，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性。

1.8 Western blot檢測目標蛋白表達 使用放射免疫沉淀實驗(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解NCM 460細胞，提取總蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。取40 μL蛋白樣品進行上樣，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封閉，加入相應一抗，4℃孵育過夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌，加入二抗室溫孵育1 h，電化學發(fā)光法(electrochemical luminescence，ECL)顯影，用 Image J 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-548a-3p在UC組織和LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞中的表達 對GSE48957數(shù)據(jù)集進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p在活動期UC患者結(jié)腸黏膜中低表達。見圖1。RT-qPCR結(jié)果顯示，UC患者腸黏膜組織miR-548a-3p的表達水平低于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義[(1.684±0.733)比(1.130±0.568)，t=3.534，P<0.001]；LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞中miR-548a-3p的表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義[(1.001±0.090)比(0.463±0.042)，t=9.382，P<0.001]。

圖1 miR-548a-3p在UC組織和LPS誘導的

2.2 LPS對結(jié)腸上皮細胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響 與對照組相比，LPS組24小時和48小時細胞增殖水平較低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖2A。此外，LPS組Bax和Caspase 3表達，TNF-α和IL-8含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2B。

表1 各組細胞增殖水平和凋亡率的比較

表2 各組細胞凋亡蛋白和炎癥因子含量的比較

注：A，TUNEL檢測對照組和LPS組凋亡率；B，Western blot檢測對照組和LPS組中Bax和Caspase3表達。

2.3 miR-548a-3p對結(jié)腸上皮細胞炎癥因子分泌和凋亡蛋白表達的影響 ELISA實驗顯示，miR-548a-3pinhibitor組TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表達水平高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；miR-548a-3pmimics組TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表達水平低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組細胞炎癥因子分泌和凋亡蛋白表達的比較

圖3 miR-548a-3p對結(jié)腸上皮細胞凋亡蛋白表達的影響

2.4 各組細胞增殖水平和凋亡率比較 與miR-NC組相比，miR-548a-3p inhibitor組細胞凋亡率較高，24小時和48小時細胞增殖水平較低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-548a-3p mimics組細胞凋亡率較低，24小時和48小時細胞增殖水平較高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表4、圖4。

表4 各組細胞增殖和凋亡情況的比較

圖4 miR-548a-3p對LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞凋亡的影響

2.5 miR-548a-3p與TLR4靶向關(guān)系 驗證通過檢索miRDB和Targetscan數(shù)據(jù)庫找到能與miR-548a-3p存在互補結(jié)合位點的mRNA，并繪制韋恩圖，見圖5A。Targetscan數(shù)據(jù)庫顯示，TLR4和miR-548a-3p的潛在互補結(jié)合位點，見圖5B。與miR-NC組相比較，miR-548a-3p組可降低含野生型TLR4熒光素酶報告質(zhì)粒相對螢光素酶活性[1.011±0.100)比(0.507±0.043),t=11.341,P<0.001]。miR-NC組和miR-548a-3p組中含突變型TLR4熒光素酶報告質(zhì)粒的相對螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義[(0.982±0.090)比(1.020±0.102),t=0.684,P=0.509]，見圖5C。Western blot實驗結(jié)果顯示，miR-NC組,miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics組中TLR4蛋白表達分別為：(1.167±0.122)、(2.102±0.162)、(0.579±0.061)，F(xiàn)=236.761,P<0.001。 與miR-NC組相比，miR-548a-3p inhibitor組TLR4蛋白表達量升高(P<0.001), miR-548a-3p mimics組TLR4蛋白表達量降低(P<0.001)。

注：A，與miR-548a-3p存在潛在互補結(jié)合位點的mRNA；B，二者互補結(jié)合位點；C，Western blot檢測各組結(jié)腸上皮細胞TLR4表達。

2.6 TLR4對LPS誘導結(jié)腸上皮細胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響 與miR-548a-3p mimics組相比，miR-548a-3p mimics組+pcDNA3.1-TLR4組中Bax蛋白和Caspase3蛋白表達較高，細胞凋亡率較高，24小時和48小時吸光度較低，TNF-α含量和IL-8含量較高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表5、6。

表5 各組細胞增殖和凋亡率的比較

表6 各組細胞凋亡蛋白和炎癥因子分泌的比較

圖6 各組細胞凋亡蛋白表達的比較

3 討論

UC是發(fā)生在消化道的慢性復發(fā)性炎性疾病，其病因和發(fā)病機制尚不清晰，可能與腸黏膜組織內(nèi)免疫調(diào)節(jié)紊亂、腸黏膜屏障受損和持續(xù)性腸道感染有關(guān)[6-7]。本研究用LPS誘導結(jié)腸上皮細胞來構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎細胞模型[8-9]，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LPS組中炎癥因子水平和細胞凋亡率顯著升高，細胞增殖能力顯著降低。

miRNA可通過調(diào)節(jié)靶基因參與多種細胞行為，且在控制細胞炎癥反應中也發(fā)揮著重要作用[10-11]。既往有研究[12]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-548a-3p可顯著增強肝癌細胞增殖、集落形能力并抑制凋亡。而對于肺癌細胞，過表達miR-548a-3p能顯著促進肺癌細胞的凋亡，并抑制肺癌細胞侵襲和凋亡的發(fā)生[13]。在糖尿病中，有研究[14]表明，miR-548a-3p在患者血清外泌體和外周血單核細胞中顯著下調(diào)，其可通過調(diào)控相關(guān)信號通路參與疾病進展。此外，miR-548a-3p在IL-22刺激的人角質(zhì)形成細胞表達中顯著上調(diào)，通過下游靶基因調(diào)控相關(guān)蛋白發(fā)揮角質(zhì)形成細胞增殖的作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p在UC患者組織和LPS組中顯著下調(diào)，miR-548a-3p可抑制炎癥因子的表達，降低細胞凋亡率并促進細胞增殖。TLR4在結(jié)腸上皮細胞中廣泛表達，而TLR4異常表達被認為是UC潛在發(fā)病機制之一[16]。有既往研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-31能通過上調(diào)TLR4的表達介導UC小鼠腸上皮細胞凋亡，從而促進小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。而在另一項研究[18]中顯示，miR-542-3p能通過抑制TLR4蛋白表達來減輕UC大鼠結(jié)腸組織炎癥反應程度。TLR4在UC患者血清中顯著上調(diào)，且TLR4表達水平與UC患者病情嚴重程度成正比[19]。TLR4是miR-548a-3p的靶基因，TLR4過表達質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)miR-548a-3p對LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞凋亡、炎癥因子分泌的抑制作用，和對細胞增殖的促進作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-548a-3p通過下調(diào)TLR4表達，能顯著抑制LPS誘導的結(jié)腸上皮細胞炎癥因子分泌和細胞凋亡，為UC患者治療提供了新的可能靶點。