齊莎莎 張國(guó)偉 孟凡威 付曉梅 張旭亞

支氣管哮喘是常見(jiàn)的慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，在嬰幼兒時(shí)期即可發(fā)病[1]。隨著經(jīng)濟(jì)快速的發(fā)展和環(huán)境污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重，哮喘發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響兒童生命健康及家庭生活質(zhì)量[2]。微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是一種腦組織中特異性較高的miRNA，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本(long non-coding RNA X inactive specific transcript，LncRNA XIST)是位于X染色體失活中心的XIST基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[4]。Li等[5]研究結(jié)果顯示，哮喘患者血漿中miR-124呈低表達(dá)，且本研究前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST與miR-124存在靶向關(guān)系。但目前關(guān)于lncRNA XIST、miR-124共同參與支氣管哮喘的研究較少。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST、miR-124水平，探討二者與肺功能指標(biāo)及炎癥因子的關(guān)系，以期為兒童支氣管哮喘的預(yù)防和評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年3月因支氣管哮喘于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及病房接受治療的168例患兒為研究對(duì)象，其中急性發(fā)作期82例(急性發(fā)作組)、緩解期86例(緩解組)；同期選取84例健康體檢兒童作為對(duì)照組。收集各組患兒年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、哮喘家族史、病程等一般資料。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②3～13歲兒童，本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試兒童家長(zhǎng)自愿參加研究，并簽署知情同意書(shū)；③患兒臨床資料完整，可配合治療；④入組前4周無(wú)糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有感染性疾病、過(guò)敏性鼻炎、喘息性疾病、因感染引起的咳喘及其他呼吸系統(tǒng)疾病者；②有β2受體激動(dòng)劑過(guò)敏史者；③有銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及處理 采集各組兒童清晨空腹外周靜脈血。①血清收集：部分離心15 min后收集血清，用于炎癥因子檢測(cè)；②外周血單個(gè)核細(xì)胞收集：部分加同等體積生理鹽水，混勻后加入到含有人外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心30 min后取出，此時(shí)離心管最上層為血漿，血漿層下白色薄層為外周血單個(gè)核細(xì)胞層，收集單個(gè)核細(xì)胞層，離心后棄上清，收集乳白色細(xì)胞，并采用PBS緩沖液洗滌，用于lncRNA XIST、miR-124水平檢測(cè)。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST和miR-124水平檢測(cè) RNA提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST、miR-124水平。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃、30 s，63℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。qRT-PCR反應(yīng)體系：上下游引物(10 μM)各0.5 μL，AceQ qPCR SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 3.0 μL。lncRNA XIST、miR-124及其內(nèi)參引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCT法對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST、miR-124水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平檢測(cè) 采用肺功能儀(北京西化儀科技有限公司)檢測(cè)各組患兒第一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)。采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)各組兒童炎癥因子白介素(interleukin，IL)-17、IL-1β、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。其中IL-17 ELISA試劑盒購(gòu)自南京北魚(yú)生物科技有限公司，IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司；IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組一般資料比較 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組年齡、性別、BMI、哮喘家族史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與緩解組比較，急性發(fā)作組病程較短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組一般資料比較

2.2 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST和miR-124水平比較 與對(duì)照組比較，緩解組、急性發(fā)作組外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與緩解組比較，急性發(fā)作組外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNAXIST和miR-124水平比較

2.3 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較，緩解組、急性發(fā)作組IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，F(xiàn)EV1、IL-10水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與緩解組比較，急性發(fā)作組IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，F(xiàn)EV1、IL-10水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 對(duì)照組、緩解組、急性發(fā)作組肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平比較

2.4 支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST與miR-124水平相關(guān)性 Pearson法相關(guān)性分析結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST與miR-124水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.668，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST與miR-124水平相關(guān)性

2.5 支氣管哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124與肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒lncRNA XIST與IL-17、IL-1β、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)，與FEV1、IL-10呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。miR-124與FEV1、IL-10呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-17、IL-1β、TNF-α呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 支氣管哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124與肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平相關(guān)性

3 討論

哮喘是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的難治性慢性疾病之一，兒童支氣管哮喘的預(yù)防和治療也成為世界性的醫(yī)學(xué)課題[7]。研究[8]表明，支氣管哮喘是多種組分、多種細(xì)胞共同參與、共同作用的結(jié)果。支氣管哮喘發(fā)病時(shí)多表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、反復(fù)發(fā)作性喘息，但其病因復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，增加了臨床診療難度[9]。因此，急需尋找相關(guān)的生物標(biāo)志物用于支氣管哮喘的臨床診治。

LncRNA是一類缺少完整閱讀框的非編碼RNA，對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞分化以及炎癥反應(yīng)均有重要影響[10]。lncRNA XIST是哺乳動(dòng)物X染色體失活時(shí)的關(guān)鍵起始物，研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中表達(dá)失調(diào)[11-12]。lncRNA XIST在炎癥性疾病中的作用有待進(jìn)一步探究。miRNA是一類高度保守的單鏈、非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、代謝等一系列生理過(guò)程，miRNA同時(shí)還是促炎細(xì)胞因子的重要調(diào)節(jié)因子[13]。miR-124在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)量較高，其在神經(jīng)細(xì)胞損傷及神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。本研究結(jié)果中顯示，與健康兒童相比，支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，且隨哮喘疾病活動(dòng)度的增加，其變化趨勢(shì)更為明顯。Atashbasteh等[15]研究顯示，與健康人群比較，哮喘患者血清中miR-124表達(dá)下調(diào)，與本研究中miR-124表達(dá)趨勢(shì)基本一致。提示本研究lncRNA XIST、miR-124表達(dá)水平可能與兒童支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究顯示，miR-124與變應(yīng)性鼻炎的疾病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度及炎癥相關(guān)，且miR-124可通過(guò)調(diào)控Toll樣受體相關(guān)通路中因子表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎作用[16-17]。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果中二者的靶向關(guān)系及上述研究[16-17]中miR-124在炎癥疾病中的作用機(jī)制推測(cè)：哮喘病理發(fā)展初期，lncRNA XIST表達(dá)水平升高，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)miR-124使其表達(dá)下降，miR-124無(wú)法抑制Toll樣受體相關(guān)通路中IL-1受體相關(guān)激酶1和TNF受體相關(guān)因子6的表達(dá)，使得其下游核因子-κB活化增加，造成miR-124抗炎作用被抑制，參與支氣管哮喘的疾病進(jìn)程，導(dǎo)致患兒病情加重。此外，本研究中l(wèi)ncRNA XIST與miR-124表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。而Li等[5]研究中顯示，lncRNA NEAT1與miR-124在哮喘患兒血清中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)在哮喘發(fā)病過(guò)程中miR-124的表達(dá)可能受不同的基因調(diào)控，進(jìn)而在哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

相關(guān)研究[18-19]顯示，炎癥反應(yīng)在支氣管哮喘的病理學(xué)機(jī)制中起重要作用，IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10等炎癥因子可能是導(dǎo)致支氣管哮喘患兒氣道癥狀出現(xiàn)的直接因素。而本研究中與健康兒童比較，支氣管哮喘患兒IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，F(xiàn)EV1、IL-10水平降低，且隨支氣管哮喘活動(dòng)度增加，IL-17、IL-1β、TNF-α水平依次升高，F(xiàn)EV1、IL-10水平依次降低。提示支氣管哮喘患兒呼吸道炎癥水平相對(duì)較高，且肺功能可能受損。此外，本研究結(jié)果中l(wèi)ncRNA XIST、miR-124與肺功能指標(biāo)及炎癥因子均呈一定的相關(guān)性。而廖偉榮等[20]研究同樣顯示lncRNA NEAT1/miR-124軸表達(dá)量與哮喘患兒肺通氣功能及炎癥水平相關(guān)。本研究中l(wèi)ncRNA XIST可能通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)miR-124表達(dá)，使其表達(dá)水平降低，miR-124調(diào)控炎癥的作用降低，進(jìn)而影響患兒肺功能及其病情進(jìn)展。

綜上所述，支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA XIST高表達(dá)，miR-124低表達(dá)，且二者與肺功能指標(biāo)FEV1及炎癥因子IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10均呈一定的相關(guān)性。lncRNA XIST、miR-124可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響支氣管哮喘的病情進(jìn)展，提示臨床重視哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124的水平變化，為今后哮喘的治療及預(yù)防提供了新的靶點(diǎn)和思路。本研究仍存在不足之處：本研究?jī)H從臨床水平上探究了lncRNA XIST、miR-124在支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況，今后將進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)相關(guān)機(jī)制；且本研究納入病例數(shù)有限，所有樣本均來(lái)自同一家醫(yī)院，為單中心研究，且部分干擾因素未能排除，今后將排除其他各類干擾因素，進(jìn)一步采用大樣本量、多中心的前瞻性研究驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。