周建福 劉莉莉 黃茂新 王桂芝 張一冰 林 堃

莆田學(xué)院附屬醫(yī)院1.新生兒科；2.小兒神經(jīng)康復(fù)科；3.新生兒疾病篩查中心，福建 莆田 351100

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD）缺乏癥是世界上最常見(jiàn)的一種遺傳性紅細(xì)胞酶?。?］，非洲大陸、地中海沿岸國(guó)家、中東地區(qū)和亞洲是高發(fā)區(qū)域［2］。我國(guó)不同地區(qū)人群G-6-PD 缺乏癥的發(fā)生率相差甚遠(yuǎn)［3］。國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)中心報(bào)告的G-6-PD缺乏癥發(fā)生率為1∶44［4］。出生前G-6-PD 缺乏癥可發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及胎兒水腫；出生后可表現(xiàn)為溶血、貧血、黃疸，嚴(yán)重者并發(fā)膽紅素腦病，甚至死亡［5］。慢性發(fā)病者可出現(xiàn)非球形紅細(xì)胞溶血性貧血［6］。

目前G-6-PD 缺乏癥尚無(wú)有效的治療措施，因此，盡早明確新生兒G-6-PD缺乏癥的基因型及酶活性亞型，早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防，對(duì)提高本地區(qū)出生人口素質(zhì)和群體生命健康水平具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

統(tǒng)計(jì)2020年7月—2021年6月莆田學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒疾病篩查中心的25 174 份濾紙片干血斑樣本，其中男性13 071例，女性12 103例，男女比為1.08∶1；收集G-6-PD 缺乏癥篩查陽(yáng)性病例共215例，陽(yáng)性率0.85%；男性176例，女性39例，男女比為4.51∶1。告知受檢病例的監(jiān)護(hù)人關(guān)于檢測(cè)G-6-PD缺乏癥突變基因及酶活性的必要性，征得監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 采用速率法檢測(cè)G-6-PD 酶活性 針對(duì)G-6-PD 缺乏癥篩查陽(yáng)性病例，采用速率法檢測(cè)酶活性。靜脈空腹采血，檢測(cè)樣本采用壓積紅細(xì)胞，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血，采集的抗凝血樣本密封2 ～8 ℃保存，可穩(wěn)定2周。樣品處理：抗凝血以4 000 r/min離心5 min，避開(kāi)血漿層用加樣器準(zhǔn)確吸取壓積紅細(xì)胞20 μL加入到1 mL溶解液中溶解，待紅細(xì)胞完全溶解后（約1 ～2 min）上機(jī)測(cè)定，測(cè)定時(shí)間不得超過(guò)25 min，否則會(huì)因G-6-PD 失活而造成結(jié)果假性偏低。

結(jié)果判讀：酶活性＜1 700 U/L 為陽(yáng)性，可生化診斷G-6-PD 缺乏；酶活性≥1 700 ～4 000 U/L 為正常。

1.2.2 采用MMCA 法檢測(cè)G-6-PD 突變基因 根據(jù)2019年新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)專(zhuān)家共識(shí)［7］的推薦，采用多色熔解曲線(xiàn)分析法（multicolor melting curve analysis，MMCA）檢測(cè)G-6-PD 缺乏癥突變基因。該檢測(cè)技術(shù)原理是利用DNA 的可擴(kuò)增性及熔點(diǎn)差值（Tm 值）對(duì)突變進(jìn)行定性檢測(cè)，采用4 色熒光探針，根據(jù)靶序列和探針雜交體熔點(diǎn)變化檢出G-6-PD 突變位點(diǎn)。用于體外定性檢測(cè)人外周血基因組DNA中的中國(guó)人群常見(jiàn)的12 種G-6-PD 基因突變：c. 95A＞G、c. 383T＞C、c. 392G＞T、c. 487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。每份檢測(cè)樣本需要通過(guò)2 個(gè)PCR 體系完成，每個(gè)體系有4 種熒光探針。最后，對(duì)待測(cè)樣本與野生型對(duì)照對(duì)應(yīng)通道的熔解峰的Tm 值進(jìn)行計(jì)算，判斷檢測(cè)樣本是否發(fā)生G-6-PD基因突變［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 G-6-PD酶活性檢測(cè)結(jié)果

215 例G-6-PD 篩查陽(yáng)性病例行酶活性檢測(cè)，其中168 例酶活性異常，可生化診斷G-6-PD 缺乏；男性143例，女性25例，男女比為5.72∶1。WHO根據(jù)G-6-PD 酶活性變異的程度及臨床表現(xiàn)的有無(wú)及程度，將G-6-PD 缺乏癥分為5個(gè)等級(jí)［9］。其中Ⅱ級(jí)95例（酶活性值32 ～147 U/L），Ⅲ級(jí)73 例（酶活性值213～950 U/L）。

2.2 G-6-PD基因突變檢測(cè)結(jié)果

采用MMCA法可同時(shí)檢測(cè)12種常見(jiàn)G-6-PD缺乏癥突變基因型。168 例G-6-PD 酶活性異常病例中有145 例（男性124 例，女性21 例）同意接受基因檢測(cè)，129例確診G-6-PD 缺乏癥突變基因型的分布情況見(jiàn)表1。

表1 129例突變基因分布情況（例）

145 例中檢出10 種常見(jiàn)突變基因型，混合突變僅1例。其中男性半合子112例，女性雜合子16例，女性純合子僅1 例，男女比為6.59∶1；另外16 例基因檢測(cè)陰性，其中7 例是Ⅱ級(jí)酶活性亞型（男性4 例，女性3 例），9 例是Ⅲ級(jí)酶活性亞型（男性8 例，女性1例）。

2.3 生化檢出率及基因檢出率比較

生化檢出率比較，男性81.25%（143/176）與女性64.10%（25/39）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.495，P=0.019）；基因檢出率比較，男性90.32%（112/124）與女性80.95%（17/21）的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.793，P=0.373）；生化檢出率78.14%（168/215）與基因檢出率88.97%（129/145）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.030，P=0.008）。

3 討論

全世界已發(fā)現(xiàn)G-6-PD 缺乏癥有400 多個(gè)基因突變類(lèi)型［10］。從全球范圍看，非洲大陸以c.202G＞A、c.376A＞G突變?yōu)橹鳎挥诘刂泻Ｑ匕兜膰?guó)家和地區(qū)以c.563C＞T 突變?yōu)橹鳎?1］，而東南亞國(guó)家主要以c. 871G＞A、c. 1311C＞T 這兩種突變類(lèi)型為主。東亞和南亞最常見(jiàn)的G-6-PD突變類(lèi)型是c.1003G＞A，又名G-6-PDChatham 突變，主要分布于日本、菲律賓和印度等國(guó)家［12］，也有文獻(xiàn)報(bào)道此突變?yōu)閹讉€(gè)東亞及伊朗部分省市的第二常見(jiàn)突變［13］。該突變導(dǎo)致G-6-PD 蛋白僅有不到正常蛋白10%的活性。Nuchprayon 等［14］報(bào)道在緬甸南部發(fā)現(xiàn)1 例c.94C＞G變異，由于變異導(dǎo)致組氨酸變?yōu)樘於彼?，從而影響G-6-PD 蛋白活性。該突變患者酶檢測(cè)活性為0。中國(guó)人群已報(bào)道的突變類(lèi)型有40余種，國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的G-6-PD 基因致病性變異超過(guò)30 種，絕大部分為Ⅱ類(lèi)或Ⅲ類(lèi)，分布具有種族和區(qū)域特異性［15］。G-6-PD 缺乏癥是X 連鎖不完全顯性等位基因異常引起的，基因檢測(cè)是G-6-PD 缺乏癥確診的重要依據(jù)，尤其對(duì)于女性雜合子、臨床疑似病例和有家族史的患者。女性雜合子由于其X染色體可隨機(jī)失活，導(dǎo)致部分女性可發(fā)病。G-6-PD 致病基因位于Xq28，長(zhǎng)約20 kb，包含13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子，共編碼515 個(gè)氨基酸的蛋白酶［16］，起始密碼子位于第2 外顯子，第1外顯子不參與翻譯。G-6-PD 缺乏癥基因突變以單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變?yōu)橹鳌?/p>

本組168 例酶活性異常病例中，其中男性檢出率為81.25%，女性檢出率為64.10%，表明采用速率法檢測(cè)酶活性可初步檢出80%左右本地區(qū)男性新生兒G-6-PD缺乏癥病例，適合在缺乏基因檢測(cè)條件的基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。而女性病例生化檢出率比較低，提示女性病例更有必要采用基因檢測(cè)以明確診斷。從篩查陽(yáng)性到基因確診，男女比例由4.51∶1（176/39）擴(kuò)大到6.59∶1（112/17），反映出部分女性雜合子可能被漏診。本組病例基因檢出率88.97%明顯高于生化檢出率78.14%；但男性生化檢出率81.25%與女性基因檢出率80.95%相近；男女性常見(jiàn)突變基因檢出率分別為90.32% 和80.95%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示酶活性異常病例的突變基因檢出率不存在性別差異。對(duì)比唐芳等［17］報(bào)道的酶活性異常病例中男女性常見(jiàn)突變基因檢出率分別為96.93%和90.52%，發(fā)現(xiàn)本組女性病例的突變基因檢出率與該報(bào)道有差距，可能提示本地區(qū)女性G-6-PD 缺乏癥突變基因型更具區(qū)域特點(diǎn)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本組病例中檢測(cè)出10 種常見(jiàn)突變基因型和1 種混合突變。比較陳瑤等［18］報(bào)道的應(yīng)用Massarray（質(zhì)量陣列）基因芯片技術(shù)共檢出9種新生兒G-6-PD缺乏癥單純型單點(diǎn)突變和7種復(fù)合突變，前3順位突變基因型為：c. 1376G＞T、c. 1388G＞A 及c.95A＞G。除了第一順位都是最常見(jiàn)的c.1376G＞T外，其他順位及基因型都不一致，表明與地域差異有關(guān)。129 例基因確診病例中112 例為男性半合子，16 例為女性雜合子，1 例女性純合子，僅1 例女性純合子和3例男性半合子有明確家族成員患G-6-PD 缺乏癥病史，顯示G-6-PD 缺乏癥呈X 連鎖不完全顯性遺傳。之所以男性發(fā)病居多，因?yàn)槟行灾挥? 條G-6-PD 拷貝，而女性有2 條G-6-PD 拷貝，僅依靠正常表型不能區(qū)分其為純合子或雜合子。當(dāng)為雜合子時(shí)，有一正?；蚩珊铣烧５腉-6-PD，其等位基因則合成變異的G-6-PD，這種雙向合成使紅細(xì)胞表現(xiàn)為兩種情況，一種正常，一種則缺乏G-6-PD 酶。這就使女性雜合子G-6-PD 缺乏癥難以診斷，因?yàn)檎＜t細(xì)胞部分掩蓋了異常紅細(xì)胞，其酶活性變化范圍較大，常在正常范圍之內(nèi)，也可呈輕度至重度降低［19-20］。女性雜合子發(fā)病與否取決于其G-6-PD缺乏的細(xì)胞數(shù)量在細(xì)胞群中所占的比例，由于臨床上不同的表現(xiàn)程度，稱(chēng)為不完全顯性［21］。

本組病例的酶活性亞型分布以Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)為主，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Ⅰ級(jí)、Ⅳ級(jí)和Ⅴ級(jí)亞型。與國(guó)內(nèi)報(bào)道［22］基本一致。另外，接受基因檢測(cè)的145 例酶活性異常病例中，除外129 例基因確診，還有7 例Ⅱ級(jí)亞型和9 例Ⅲ級(jí)亞型未檢出突變基因。由于MMCA 法僅檢測(cè)12 種常見(jiàn)基因變異位點(diǎn)［7］，易將其他突變位點(diǎn)漏診。中國(guó)已有35 種致病突變被證實(shí)［23］，尚缺乏大型流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，Liu 等［24］對(duì)2013 至2017年多中心1 764 299 例新生兒篩查樣本進(jìn)行基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)29 種基因變異，其中c.1388G＞A、c.1376G＞T 和c.95A＞G 仍然是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)變異位點(diǎn)，且僅在華人中存在，世界其他民族未見(jiàn)報(bào)道。本組病例中最常見(jiàn)的3種突變類(lèi)型與國(guó)內(nèi)報(bào)道的前3 種突變基因型及順位都不一致［18，24］，顯示本地區(qū)G-6-PD 缺乏癥突變基因型獨(dú)具地域特色的可能性，有必要通過(guò)基因測(cè)序分析以鑒定12 種基因型之外的其他常見(jiàn)突變位點(diǎn)和新的突變位點(diǎn)［7］。

隨著新生兒G-6-PD缺乏癥篩查在我國(guó)推廣，基因型與生化表型的關(guān)系受到關(guān)注［25］，目前有關(guān)G-6-PD 基因型與新生兒篩查干血斑G-6-PD 酶活性的關(guān)系尚不十分清楚。郭靜等［26］報(bào)道的G-6-PD 基因突變位點(diǎn)與G-6-PD活性無(wú)明顯相關(guān)性，臨床不能以該病患兒G-6-PD 基因突變位點(diǎn)推測(cè)其G-6-PD 活性。陳鄉(xiāng)等［27］報(bào)道的單中心研究顯示，攜帶相同G-6-PD致病變異同性別患兒的表型譜有較大差異，攜帶相同致病位點(diǎn)且酶活性一致的同性別患兒臨床表現(xiàn)亦有差異。

綜上所述，采用速率法檢測(cè)酶活性及MMCA法檢測(cè)突變基因，對(duì)G-6-PD缺乏癥的酶活性分型及基因型確診都有意義。下一階段將采用基因測(cè)序分析聯(lián)合多色熔解曲線(xiàn)分析法探討G-6-PD 缺乏癥基因變異位點(diǎn)與酶學(xué)表型的關(guān)聯(lián)性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突